Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Breng een tricaïne verdoofde vis over op een natte spons met de rugzijde naar boven gericht. Plaats de spons die de vis draagt onder een microscoop. Plaats een micronaald onder een hoek van 45 graden van de lichaamsas in de buurt van de rugspier.
Zoek vervolgens de plek voor de rugvin die niet bedekt is met schubben waar u de naald kunt inbrengen zonder grote kracht aan te brengen. Steek vervolgens voorzichtig de naald in en injecteer langzaam de verbinding van belang samen met een marker zoals fenolrood in de spier.
Als de verbinding van belang genetisch materiaal bevat, elektroporate de cellen door elektroden aan weerszijden van de injectieplaats te plaatsen en de stroom toe te dienen. De stroom maakt de spiercellen doorlaatbaar en in staat om het genetische materiaal efficiënt op te nemen. Na de procedure, breng de vis onmiddellijk over in een hersteltank. In het volgende protocol zullen we een intramusculaire injectie uitvoeren op een volwassen zebravis om een DNA-vaccin tegen mycobacteriose af te leveren.
Om de vis tijdens de injectie in een vaste positie te houden, gebruikt u een stuk spons met een groef in het midden als vulling. Week de spons grondig in systeemwater en plaats deze in een Petrischaal. Breng met behulp van een plastic lepel een verdoofde zebravis over naar de natte spons met de ventrale kant van de vis naar beneden in de groef. Plaats de naald onder de microscoop in een hoek van 45 graden dicht bij de rugspier van de zebravis.
Als er weerstand wordt gevoeld, probeer dan een aangrenzende plek. Gebruik een voetschakelaar om de plasmide-oplossing geleidelijk in de spier te injecteren. Onder de microscoop moet het fenolrood zichtbaar zijn wanneer het het spierweefsel binnenkomt.
Elektroporateer de vis onmiddellijk na injectie door de elektroden van het pincettype aan elke kant van de injectieplaats te plaatsen. Druk op de startknop op de elektroporator en geef deze zes pulsen van 40 volt en 50 milliseconden. Breng de vis vervolgens voorzichtig over naar een hersteltank. Gebruik ten slotte, na het verdoven van de vis volgens het tekstprotocol, een UV-licht om egfp-expressie in de buurt van de injectieplaats te zien.
