Name: Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Lernen Sie die Expansion und Reinigung humaner NK-Zellen aus peripherem Blut für die Immuntherapie. Diese Methode ermöglicht eine 21.000-fache Zellvermehrung mit hoher Tumorzytotoxizität.

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Die Autoren bedanken sich bei Laurence Cooper, Harjeet Singh und Lenka Hurton für ihre Arbeit danken bei der Erstellung der ersten K562 AAPC und mIL21 Fusionsvektoren. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von der UT MD Anderson Physician Scientist Program, das St. Baldrick Stiftung und die Legends of Friendswood zur Verfügung gestellt.

1. Isolation von PBMCs aus Buffy Coat Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) werden durch Schwebedichte Zentrifugation auf Ficoll-Paque aus gesunden Spenders Buffy-Coat-Proben durch Leukapherese gewonnen wird. <ol><li> Die Ficoll-Paque Zentrifugation ist nach Hersteller-Protokoll mit geringfügigen Änderungen vorgenommen. </li><li> Add PBS zu einem normal-Spenderblut-Bank-Buffy-Coat auf ein Endvolumen von 140 mL (typische Buffy-Coat-Volumen ist 40-70 ml). </li><li> Schicht 35 ml Buffy-Coat-Probe auf 15 ml Ficoll-Paque (4 Röhren). </li><li> Zentrifugation bei 400g für 20 Minuten ohne Bremse. </li><li> Recover der PBMCs aus der Ficoll-Paque: Plasma-Schnittstelle, nicht verwerfen die roten Blutkörperchen an der Unterseite der Ficoll-Paque. </li><li> Wash PBMCs dreimal mit PBS, Zentrifugieren jedes Mal bei 400g für 10 Minuten. </li><li> PBMCs können direkt für die NK-Zell-Expansion in diesem Stadium oder NK-Zellen verwendet werden kann RosetteSep isoliert werden (Abschnitt 4) </li><li> Verbleibende PBMCs können in FBS eingefroren werden mit 10% DMSO in flüssigem Stickstoff. </li><li> Saugen Sie das Ficoll und sammelt die roten Blutkörperchen von Schritt 5 in zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen, dreimal mit PBS (zu 50 ml Marke), absaugen jedes Mal der Überstand Skimming der Spitze des RBC-Schicht Granulozyten entfernen. </li><li> Die roten Blutkörperchen können sofort für RosetteSep  Reinigung von NK-Zellen (siehe Abschnitt 4) verwendet werden oder in gleicher Menge Alsever Lösung bei 4 ° C für eine spätere Verwendung (Die roten Blutkörperchen können gespeichert werden für maximal 4 Wochen). </li></ol> 2. NK-Zell-Expansion Die NK-Zell-Expansion eingeleitet mit PBMCs oder gereinigten NK-Zellen sein. Die Höhe der PBMCs für die Expansion verwendet bezogen auf die Menge der NK-Zellen am Ende einer dreiwöchigen Erweiterung gewünscht variiert werden kann, um repräsentative Ergebnisse für Details verweisen. (Siehe Hinweis 1) STIMULATION 1 Tag 0 <ol><li> Für jede 5x10 6 PBMCs erweitert werden, zählen und bestrahlen 10x10 6 K562 Cl9 mIL21 mit einem Gamma-Strahler bei 100 Gy. </li><li> Beitrag Bestrahlung, waschen Sie die Zellen mit PBS und Resuspendieren in NK-Zell-Expansion Medien (Nkem). </li><li> Seed 5x10 6 PBMCs mit 10x10 6 bestrahlt K562 Cl9 mIL21 (1:2 ratio) in 40 mL Nkem in einer T75 Flasche und legen Sie sie aufrecht in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> Tage 3 und 5 <ol start="4"><li> Recover Zellen durch Zentrifugation bei 400g für 5 min und ersetzen die Hälfte der Medien mit frischen Nkem (Zugabe von frischem IL2 für die gesamte Medien-Volumen) und die Kultur. </li></ol> STIMULATION 2 Tag 7 <ol><li> Zählt die Anzahl der Zellen in Kultur am Ende einer Woche. </li><li> Beiseite 5x10 5 Zellen zur Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie (siehe Hinweis 2) </li><li> Für jede 5x10 6 Zellen zu restimuliert werden, zählen und bestrahlen 5x10 6 K562 Cl9 mIL21 mit einem Gamma-Strahler bei 100 Gy. </li><li> Fügen Sie die gleiche Anzahl von bestrahlten K562 Cl9 mIL21 (1:1) und resuspendieren in Nkem in 2.5x10 5 insgesamt Zellen / ml (siehe Anmerkung 3). </li><li> Seed-Zellen in T75 Flaschen (maximal 50 ml pro Flasche). </li></ol> Tage 10 und 12 <ol start="6"><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen. </li><li> Ändern gesamten Medien mit frischen Nkem auf die Zellzahlen auf (siehe Anmerkung 3). </li></ol> Tag 14 <ol start="8"><li> Am Ende der zwei Wochen der Erweiterung zählen die Anzahl der Zellen in Kultur. </li><li> Beiseite 5x10 5 Zellen zur Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie (siehe Hinweis 2) </li><li> Wenn Expansion von PBMCs gestartet wurde der NK-Zellen können in dieser Phase der Expansion mit der RosetteSep Aufreinigungsprotokolls (siehe Abschnitt IV) gereinigt werden. Wenn Expansion wurde aus gereinigtem NK-Zellen vor der Stimulation 3 gestartet. </li><li> Nach der Reinigung beiseite 5x10 5 Zellen zur Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie, um die Reinheit der NK-Zellen (wie in Schritt 8) zu überprüfen. </li><li> Fahren Sie mit Stimulation 3 mit all der gereinigten NK-Zellen (siehe Anmerkung 4). </li></ol> STIMULATION 3 <ol><li> Resuspendieren NK-Zellen mit bestrahlten K562 Cl9 mIL21 (1:1) in Nkem auf Zellzahlen auf (siehe Anmerkung 3). </li></ol> Tage 17 und 19 <ol start="2"><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen. </li><li> Ändern Medien mit frischen Nkem auf die Zellzahlen auf (siehe Anmerkung 3). </li></ol> Tag 21 <ol start="4"><li> Am Ende der drei Wochen der Erweiterung zählen die Anzahl der Zellen in Kultur. </li><li> Recover 1x10 6 Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse für volle NK-Zell-Phänotypisierung Antikörper-Panel (siehe Tabelle 1). </li><li> Freeze-Zellen in FBS mit 10% DMSO bei einer maximalen Dichte von 5x10 7 Zellen pro Flasche für den zukünftigen Gebrauch. </li></ol> 3. NK-Zell-Zytotoxizität Assay <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen von NK-Zellen und Saatgut in Nkem, einen Tag vor der performing Zytotoxizitätsassay zur Erholung zu ermöglichen. </li><li> Für jede NK-Zell-Zytotoxizität Assay mit einem einzelnen Ziel-Zelllinie, 6x10 5 NK-Zellen und 3x10 5 Zielzellen benötigt werden (siehe Hinweis 5). </li><li> Bereiten CAM-Media durch Verdünnen Calcein-AM (stock 1 mg / mL in DMSO) in Nkem (Siehe Anmerkung 6). </li><li> Resuspendieren 10 6 Zielzellen in 1 ml CAM-Medien (siehe Anmerkung 7). </li><li> Inkubation für 1 h bei 37 ° C, unter gelegentlichem Schütteln. </li><li> Resuspendieren NK-Zellen bei 1x10 6 Zellen / ml und fügen 200 &amp;mgr; l der NK-Zell-Suspension in jeden der 3 Wells einer U-Boden 96-Well-Platte entspricht bis 10: 1 E: T-Verhältnis in Abbildung 1 dargestellt. (Siehe Anmerkung 8) </li><li> Add 100 ul der komplette Medien, alle verbleibenden Vertiefungen, mit Ausnahme für "Maximum". </li><li> Add 100 ul von 2% Triton X-100 auf "Maximum". </li><li> Führen Sie serielle Verdünnungen der NK-Zellen für die 5 folgenden E: T-Verhältnissen durch die Übertragung von 100 ul der Zellen jedes Mal, gut mischen. Discard 100 ul aus den letzten Bohrungen (E: T-Verhältnis von 0.3125:1). </li><li> Nach 1 Stunde von Calcein Laden, Wasch-Zielzellen in Nkem zweimal Zentrifugation für 5 min bei 1200 Umdrehungen pro Minute. (Siehe Anmerkung 9) </li><li> Re-count die Zielzellen und resuspendieren bei 1x10 5 Zellen / ml. </li><li> Geben Sie 100 ul von Zielzellen in jede Vertiefung (1x10 4 / well). Säule für 1 min bei 100g zu Zelle Kontakt zu initiieren. </li><li> Bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 Stunden. </li><li> Mischen Sie die Kultur vorsichtig durch Pipettieren mit einer 100 ul Pipette, um gleichmäßig auszusetzen veröffentlicht Calcein, Spin-down Platte bei 100g für 5 Minuten die Zellen zu pelletieren und Transfer 100 ul des Überstandes auf eine neue Platte darauf achten, dass Luftblasen zu vermeiden. Pop keine Blasen, die Form mit feinen Nadel kann. </li><li> Lesen Sie die Platte mit einem fluoreszierenden Platte Leser (Anregungsfilter 485 nm, Emissions-Filter 530 nm). Unten lesen wird empfohlen. </li><li> Berechnen Prozent spezifische Lyse nach der Formel [(Test-Release-spontane Freisetzung) / (maximale Freisetzung - spontane Freisetzung)] x 100. </li></ol> 4. NK-Zell-Reinigung durch RosetteSep <ol><li> Nehmen Sie 100-fachen Überschuss an roten Blutkörperchen, dass der PBMCs oder expandierten Zellen in eine 50 ml Tube (100:1 RBC: PBMC). </li><li> Wenn Sie frische Erythrozyten direkt zum nächsten Schritt übergehen oder wenn die Erythrozyten in Alsever s Lösung gelagert wurden, zählen die Anzahl der roten Blutkörperchen und waschen entsprechende (100 facher Überschuss) Menge der roten Blutkörperchen mit PBS mit 2% FBS dreimal Zentrifugation bei 1200 rpm für jeweils 10 Minuten Zeit. </li><li> Kombinieren Sie Erythrozyten mit PBMCs aus Schritt 1.7 oder expandierten Zellen von Schritt 2.10 In PBS + 2% FBS auf ein Endvolumen von 1 ml pro 5x10 7 von PBMCs oder expandierten Zellen. </li><li> Add 1μL von RosetteSep  menschlichen NK-Zell-Anreicherung Cocktail pro 1x10 6 von PBMCs oder expandierten Zellen. </li><li> Gut mischen und bei Raumtemperatur inkubieren für 20 Minuten unter leichtem Mischen alle 5 Minuten. </li><li> Add gleichen Volumen PBS + 2% FBS vorsichtig mischen und Schicht auf Ficoll-Paque. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte der Ficoll-Paque Zentrifugation PBMC Isolation beschrieben (Abschnitt I). </li><li> Zählen Sie die NK-Zellen nach der Reinigung wieder und beiseite 5x105 Zellen für phenotpying mittels Durchflusszytometrie für NK-Zell-Reinheit (Schritt 8). </li></ol> 5. Hinweise ANMERKUNG 1. NK-Zellen können direkt aus PBMCs erweitert werden, oder von RosetteSep  gereinigt NK-Zellen. Wir haben ähnliche Expansion Effizienz festgestellt, aber einige Geber können sehr niedrige NK-Zellzahlen, was zu Schwierigkeiten Reinigung durch RosetteSep vor der Expansion haben. ANMERKUNG 2. Wir verwenden routinemäßig CD56-FITC, CD16-PE und CD3-PE-Cy5 zur Phänotypisierung während der Expansion, Aufzählen NK-Zellen als solche, die CD3-negative und CD16-oder CD56-positiv sind. ANMERKUNG 3. Bei jedem Medienwechsel oder Stimulation, um die Zellen auf 2,5 x 10 5 / ml PBMC / NK-Zell-Zahlen bei oder unter 2 Millionen pro ml zu halten in Spitzenzeiten Ausbaustufen. Dadurch wird verhindert, Erschöpfung der Nährstoffe und zur Erreichung maximaler Expansion und Überleben. ANMERKUNG 4. Die NK Expansionsrate ist Spenders abhängig und am Ende der Stimulationen 1 oder 2 ein Teil der Zellen können eingefroren werden und ein Teil weiter ausgebaut je nach den Versuchsbedingungen müssen. Wir haben gute Erfolge bei der Verwendung der eingefrorenen Zellen für Erweiterungen zu einem späteren Zeitpunkt hatte. ANMERKUNG 5. Um Raum für Fehler erlauben, empfehlen wir mit einem Minimum an 7x10 5 NK-Zellen in 700 uls der Nkem und 4x10 5 Calcein-AM gefärbt Zielzellen in 4 ml Nkem für den Aufbau der Zytotoxizitätsassay resuspendiert resuspendiert. Wenn Sie Mehrkanalpipette für die Aussaat Zielzellen höhere Volumen der Zellen (bis zu 6x10 5 in 6 mL) können je nach Größe der Medien Becken eingesetzt erforderlich sein. Auch die empfohlene NK-Zell-Zahlen sind speziell für den E: T-Verhältnissen zeigen, in das Protokoll, für die Verwendung von höheren E: T-Verhältnissen zu erhöhender NK-Zellzahlen pro ml entsprechend (zB für eine 40:1 E: T-Verhältnis verwenden 4x10 6 Zellen / ml) ANMERKUNG 6. Wir empfehlen die Durchführung einer vorläufigen Calcein-AM loading Titration für die Ziel-Zelllinie der Wahl, mit den folgenden Verdünnungen von 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 und 1:100, um eine optimale Differenz zwischen maximaler und spontane Freisetzung zu erreichen. ANMERKUNG 7. Wenn Sie ein Anhänger Zelllinie als Ziel, zunächst vorbereiten einzigen Zellsuspension mit nicht-enzymatische Zelle Dissoziationspuffer. Wenn die Durchführung ADCC, bereiten ein Duplikat Rohr von Zielzellen in CAM-media. ANMERKUNG 8 Bei der Durchführung ADCC, fügen gleichen NK-Zellen zu 3 wells entsprechende bis 10:1 E:. T für ADCC. Wiederholen Sie für weitere Spender. Wiederholen Sie für weitere Zielzellen. ANMERKUNG 9. Wenn der Durchführung einer ADCC Experiment nach 45 Minuten von Calcein Laden, fügen 10ug der spezifischen Antikörper zu induzieren ADCC gegen die Zielzellen. Nach 15 Minuten, waschen Zielzellen in Vollmedium zweimal Zentrifugation für 5 min bei 1200 Umdrehungen pro Minute. Die Zellen auf 1x10 5 Zellen / ml und fahren Sie mit dem nächsten Schritt in das Protokoll. 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Wenn die Erweiterung, wie es gemäß dem Schema durchgeführt oben beschrieben, mit 5x106 PBMCs als Ausgangsmaterial, typische NK-Zell-Erträge reichen von 1x10 Oktober von 9 bis 10 Zellen (Spender Variabilität). Die Abbildung zeigt NK-Zell-fache Expansion (n = 19) im Vergleich zu NK-Zellen in das ursprüngliche Produkt (Median + / - Quartil). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Die erweiterte NK-Zellen exprimieren verschiedene NK-Zell-Rezeptoren, die vergleichbar mit dem expandierten primären NK-Zellen mit wenigen Ausnahmen (CD11b, CD160 und CD244) sind. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. PBMCs Erholung von Buffy coat ist Spenders abhängig und kann von 300x10 6 bis 800x10 6-Reihe. NK-Zellen können aus 2% - 18% der PBMCs. Für RosetteSep Reinigung von expandierten Zellen, Gewinnung von reinen NK-Zellen am Tag 14 reicht von 40-70%. Mit der empfohlenen Protokoll der Expansion und der Reinigung kann NK-Zell-Reinheit von 99% gerechnet werden. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Expanded NK-Zellen haben Zytotoxizität gegen eine Reihe von Tumor-Zelllinien, einschließlich Neuroblastom, AML, Osteosarkom und Melanom (Vertreter AML Töten als Prozent spezifische Lyse gezeigt) nachgewiesen.

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</ol>

NK-Zell-Expansion und Aktivierung Media (Nkem) <ul><li> 90% RPMI 1640 (CellGro) </li><li> 10% fötalem Rinderserum (Gibco) </li><li> 1x Penicillin / Streptomycin (CellGro) </li><li> 1x L-Glutamin (Gibco) <ul><li> Filter sterilisieren Medien vor dem Gebrauch. </li></ul></li><li> 50 U / ml IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) <ul><li> - Von einem 200 IU / ul Lager verdünnt. Add IL2 auf die gewünschte Menge an Medien kurz vor der Verwendung jeder Zeit. </li></ul></li></ul> PBMC und NK-Zell-Isolation <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Alsever-Lösung (Sigma) </li><li> RosetteSep menschlichen NK-Zell-Anreicherung Cocktail (Stemcell Technologies) </li></ul> NK-Zell-Zytotoxizität Assay <ul><li> Calcein-AM (Invitrogen) <ul><li> Stammlösung ist bei 1 mg / ml, Lagerung in 50 ul Aliquots eingefroren. Man löst in Nkem Medien auf die gewünschte Verdünnung für Zellfärbung erreichen. </li></ul></li></ul> Antibodies Die Liste der Antikörper für die NK-Zell-Phänotypisierung verwendet werden in der nachstehenden Tabelle aufgeführt sind; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Antikörper </td><td> Volume pro Test </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Tube 1 </td><td valign="top"> Isotyp FITC Isotyp FITC Isotyp FITC Isotyp FITC FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tube 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Rohr 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tube 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tube 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tube 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS-Puffer Gesamtvolumen </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, reinigung und functional assessment of human peripheren blut nk-zellen

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

Natürliche Killerzellen (NK) Zellen spielen eine wichtige Rolle in Immunüberwachung gegen eine Vielzahl von infektiösen Mikroorganismen und Tumore. Begrenzte Verfügbarkeit von NK-Zellen und die Fähigkeit, in vitro zu erweitern hat die Entwicklung von NK-Zell-Immuntherapie beschränkt. Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern riesige Mengen an funktionellen NK-Zellen ex vivo mit K562-Zellen, die Membran-gebundenen IL21, als ein künstliches Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC). NK-Zell-Therapien Adoptiveltern bis dato eine Zelle Produkt von steady-state Leukapherese des Spenders durch Depletion von T-Zellen oder positive Selektion von NK-Zellen, gefolgt erhalten eingesetzt. Das Produkt ist in der Regel in IL-2 über Nacht und aktiviert dann verabreicht folgenden Tag 1. Aufgrund der geringen Häufigkeit von NK-Zellen im peripheren Blut, haben eine relativ kleine Zahl von NK-Zellen in klinischen Studien geliefert. Die Unfähigkeit, NK-Zellen in vitro zu propagieren ist der limitierende Faktor für die Erzeugung ausreichender Zellzahlen für optimale klinische Ergebnis gewesen. Einige Expansion von NK-Zellen (5-10 fach über 1-2 Wochen) wurde durch High-dosiertem IL-2 allein 2 erreicht werden. Die Aktivierung von autologen T-Zellen vermitteln können NK-Zell-Expansion, vermutlich auch durch Freisetzung von lokalen Zytokin-3. Unterstützung mit mesenchymalen Stromazellen oder künstliche Antigen-präsentierende Zellen (aAPCs) unterstützt die Expansion von NK-Zellen sowohl aus dem peripheren Blut und Schnur Blut 4. Kombinierte NKp46 und CD2 Aktivierung durch Antikörper-beschichteten Beads ist derzeit für NK-Zell-Expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA) vermarktet, was in etwa 100-fache Expansion in 21 Tagen. Klinische Studien mit AAPC-Erweiterung oder-aktivierten NK-Zellen sind im Gange, eine mit leukämischen Zelllinie CTV-1 bis prime und aktivieren NK-Zellen 5 ohne wesentliche Erweiterung. Eine zweite Studie nutzt EBV-LCL für NK-Zell-Expansion, das Erreichen einer mittleren 490-fache Expansion in 21 Tagen 6. Die dritte nutzt eine K562-basierte AAPC transduziert mit 4-1BBL (CD137L) und membrangebundene IL-15 (mIL-15) 7, die eine mittlere NK Expansion erreicht 277-fach in 21 Tagen. Obwohl die NK-Zellen erweitert mit K562-41BBL-mIL15 AAPC hochcytotoxisch sind in vitro und in vivo im Vergleich zu unexpanded NK-Zellen, und beteiligen sich an ADCC, ist ihre Verbreitung durch Seneszenz zugeschrieben Telomerverkürzung 8 begrenzt. In jüngerer Zeit eine 350-fache Expansion von NK-Zellen wurde berichtet, mit K562 Ausdruck MICA, 4-1BBL und IL15 9. Unsere Methode der NK-Zell-Expansion hierin beschriebenen produziert schnelle Verbreitung von NK-Zellen ohne Seneszenz Erreichen einer medianen 21.000 fache Expansion in 21 Tagen.

Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern und zu reinigen eine große Anzahl von menschlichen NK-Zellen und beurteilen ihre Funktion.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) spielen eine wichtige Rolle bei der Immunüberwachung gegenüber einer Vielzahl von infektiösen Mikroorganismen und Tumoren. Die begrenzte Verfügbarkeit von ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, große Zahlen menschlicher NK-Zellen schnell zu vermehren. Beginnen Sie ex vivo mit der Isolierung von pBMCs oder NK-Zellen aus einem Buffy-Coat- oder Vollblutprobe. Anschließend koinkubieren Sie PBMCs mit künstlichen antigenpräsentierenden Zellen zur Expansion der NK-Zellen.Das Kulturmedium, ergänzt mit IL-2, dient zur Erhaltung der NK-Zellkultur über einen Zeitraum von drei Wochen mit wöchentlichen Stimulationen mittels aAPCs, wobei darauf zu achten ist, die Anzahl der NK-Zellen unter 1 × 10⁶ pro Milliliter Kulturmedium zu halten. Abschließend wird die funktionelle Wirksamkeit der expandierten NK-Zellen mittels eines nicht-radioaktiven Zytotoxizitätsassays überprüft. Eine typische Ausbeute an NK-Zellen nach diesem Expansionsverfahren beträgt nach 21 Tagen eine mediane Expansion um den Faktor 21.000; diese Zellen weisen eine hohe Zytotoxizität gegenüber verschiedenen Tumoren auf, wie durch einen Kalziumfreisetzungsassay bestimmt wurde.Dieses Verfahren kann eine zentrale Fragestellung im Bereich der NK-Zellbiologie beantworten, da es historisch gesehen äußerst schwierig war, große Mengen an NK-Zellen zu gewinnen. Diese Technik hat Auswirkungen auf die Immuntherapie menschlicher Krebserkrankungen, da die Erzeugung ausreichender Mengen an NK-Zellen für eine solche Therapie bisher sehr schwierig war. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Cecily, die leitende wissenschaftliche Assistentin in meinem Labor, durchführen, um P BMCs aus Blut von gesunden Spendern zu gewinnen.Üblicherweise wird als Quelle der Buffy-Coat aus der Blutbank verwendet. Zunächst wird PBS hinzugefügt, um das Volumen des Buffy-Coats auf 140 Milliliter einzustellen. Anschließend werden 35 Milliliter der Probe auf 15 Milliliter Fial-PA geschichtet und für die Gradientenseparationszentrifugation 20 Minuten bei 400 ×g zentrifugiert.Ohne Unterbrechung. Gewinnen Sie die P-BMCs vorsichtig von der Plasmagrenzfläche der Fial-PA und stellen Sie das Röhrchen mit den Erythrozyten beiseite, um es später zu verwenden. Waschen Sie die P-BMCs dreimal mit PBS, wobei jedes Mal bei 400 ×g für 10 Minuten zentrifugiert wird.Verwenden Sie diesen Anteil der P BMCs zur Expansion von NK-Zellen. Kehren Sie nun zur Gradientenröhre zurück. Aspirieren Sie das Fi.Rufen Sie die Erythrozyten an und überführen Sie sie in zwei 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen; waschen Sie sie mit PBS, das bis zur 50-Milliliter-Marke zugegeben wird. Nach der Zentrifugation aspirieren Sie den Überstand, indem Sie die Oberfläche der Erythrozytenschicht abschöpfen. Um Granulozyten zu entfernen.Führen Sie drei Waschschritte durch, resuspendieren Sie die Erythrozyten anschließend in einem gleichen Volumen von Else's Lösung und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zu einem Monat lang. Dieser Erythrozytenanteil kann zur Rosetten-SEP-Reinigung von NK-Zellen am Ende von zweiwöchiger Expansion verwendet werden. Um funktionelle NK-Zellen effizient ex vivo zu expandieren, verwenden Sie K562-Klon-9-Zellen mit membrangebundenem IL-21, im Folgenden als K562 bezeichnet.Klon neun IL-21 wird als künstliche antigenpräsentierende Zelle verwendet. Zählen Sie zunächst PBMCs und berechnen Sie das Volumen für fünf mal 10 hoch sechs Zellen, die für die NK-Zell-Expansion ausgesät werden sollen, pro fünf mal 10 hoch sechs PBMCs. Bestrahlen Sie 10 mal 10 hoch sechs K562-Klon-neun-IL-21-Zellen mit einem Gamma-Bestrahlungsgerät bei 100 Gray. Bestrahlte Zellen können auch für die spätere Verwendung eingefroren werden. Waschen Sie die vorbestrahlten Zellen nun mit PBS und resuspendieren Sie sie in NK-Zell-Expansionsmedium.Stellen Sie nun ein Verhältnis von zwei zu eins bestrahlter Zellen zu PBMCs in 40 Milliliter NK-Zell-Expansionsmedium her und platzieren Sie den T-75-Flasche aufrecht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am dritten Tag. Gewinnen Sie die stimulierten Zellen durch Zentrifugation bei 400 × g für fünf Minuten und ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch frisches NKEM, um die Kultur weiterzuführen. Wiederholen Sie einen Mediumwechsel am fünften Tag. Am Ende einer Woche zählen Sie die Anzahl der Zellen, stellen fünf mal 10 hoch fünf Zellen für die Phänotypisierung per Durchflusszytometrie beiseite und bestrahlen Sie ein Verhältnis von eins zu eins von K562.Klonen Sie neun IL-21-Zellen, um deren Zellen zu vermehren, und kombinieren Sie anschließend die Zellen in NK-Zell-Expansionsmedium mit insgesamt 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Bringen Sie die Zellen nun in T-75-Flaschen aus und kultivieren Sie sie weiter; passagieren Sie die Zellen am Tag 10 und Tag 12 in NK-Zell-Expansionsmedium mit 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter bis zum Tag 14 der Expansion. Zählen Sie die Zellen erneut und phenotypisieren Sie eine Probe mittels Durchflusszytometrie.Reinigen Sie diese aus PBMCs stammende Zellvermehrung mithilfe des Rosetten-SEP-Reinigungsprotokolls und überprüfen Sie die Reinheit der NK-Zellen durch Durchflusszytometrie-Phänotypisierung. Führen Sie eine dritte Stimulation der gereinigten NK-Zellen mit einem Verhältnis von eins zu eins von bestrahlten K562-Klon-neun-IL-21-Zellen durch. Analysieren Sie abschließend am Tag 21 die amplifizierten NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines vollständigen Antikörpersets zur Phänotypisierung.Tiefgefrieren Sie Zellbestände in FBS mit 10 % DMSO bei einer maximalen Dichte von fünf mal 10 hoch 7 Zellen pro Röhrchen. Verwenden Sie für den Zytotoxizitätsassay entweder frische oder gefrorene NK-Zellen. Wenn gefrorene NK-Zellen verwendet werden, tauen Sie zunächst das Röhrchen mit NK-Zellen auf und säen Sie sie 24 Stunden lang in NKEM aus, um der Zellerholung am Tag des Assays Rechnung zu tragen; resuspendieren Sie 10 hoch 6 Zielzellen in einem Milliliter NKEM, das Calcium enthalten, und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln in einer UBO-96-Well-Platte. Geben Sie jeweils 200 Mikroliter NK-Zellen, die bei einer Konzentration von ein mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter suspendiert sind, im Triplikat hinzu und führen Sie die serielle Verdünnung der Zellen wie angegeben durch.Nach einer Stunde der Kalziumbeladung die Zielzellen zweimal durch Zentrifugation fünf Minuten bei 400 × g in NK-Zell-Expansionsmedium waschen. Die Zielzellen erneut zählen und in einer Konzentration von einer mal 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter resuspendieren. 100 Mikroliter der Zielzellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte geben und eine Minute bei 100 × g zentrifugieren, um den Zellkontakt herzustellen; anschließend vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.Um das freigesetzte Calcium gleichmäßig zu suspendieren, mischen Sie die Kultur vorsichtig durch Pipettieren, zentrifugieren Sie die Zellenpellets bei 100 ×g für fünf Minuten und übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstandes in eine neue flache 96-Well-Platte, wobei Sie gegebenenfalls Blasen vermeiden. Stechen Sie gegebenenfalls entstehende Blasen mit einer feinen Nadel auf. Messen Sie die Platte mit einem fluoreszenzbasierten Plattenreader, der auf einen Anregungsfilter von 485 Nanometern und einen Emissionsfilter von 530 Nanometern eingestellt ist.Berechnen Sie die prozentuale spezifische Lyse. Typischerweise ergibt die Expansion von fünf mal 10 hoch 6 PBMC, isoliert aus Buffy Coat, zwischen ein mal 10 hoch 9 und 10 hoch 10 NK-Zellen. Die expandierten NK-Zellen exprimieren verschiedene NK-Zellrezeptoren, die mit den nicht expandierten primären NK-Zellen im Buffy Coat vergleichbar sind.NK-Zellen können zwei bis 18 % der PBMC am Tag 14 ausmachen. Die Rosetten-SEP-Reinigung der expandierten Zellen kann 40 bis 70 % der im Kulturansatz vorhandenen NK-Zellen mit einer Reinheit von 99 %, angegeben durch CD drei, zurückgewinnen. Negativ für CD 56 und positiv für expandierte NK-Zellen wurde eine Zytotoxizität gegenüber einer Reihe von Tumorzelllinien nachgewiesen, einschließlich Neuroblastom, A ML Osteosarkom und Melanom.Hier wird die repräsentative A ML-abhängige Zerstörung als prozentuale spezifische Lyse dargestellt. Das Live-BIOT-Video zeigt die Zerstörung der Neuroblastomzelllinie CHP 134 durch NK-Zellen, die mit Calcium am beladen wurden, nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie die Analyse der Zytokinproduktion durch NK-Zellen und die adaptive Übertragung in tierischen Tumormodellen können durchgeführt werden, um weitere Fragen bezüglich der Funktionen der NK-Zellen zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man große Mengen an NK-Zellen vermehren und reinigen kann. Dies kann direkt aus peripheren mononukleären Blutzellen erfolgen, gefolgt von der Reinigung der NK-Zellen, oder die Vermehrung kann mit mittels Rosettenmethode gereinigten NK-Zellen initiiert werden. Zu Beginn liefert ein typischer Buffy Coat 15 bis 40 Millionen NK-Zellen, die alle zur Vermehrung einer sehr großen Anzahl an NK-Zellen unter Verwendung des in dieser Methode beschriebenen Schemas genutzt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Aktivierung und Ausbau menschlichen NKT-Zellen aus losem T-Zellpopulationen mit künstlichen Antigen-präsentierende Zellen (AAPC). Die Verwendung von CD1d basierenden AAPC bietet eine standardisierte Verfahren zur Erzeugung hoher Anzahl funktioneller NKT-Zellen.

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Expansion von natürlichen Killerzellen (NK) direkt aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Feeder-Zelllinie. PBMCs werden mit genetisch veränderten lymphoblastoiden Feeder-Zellen co-kultiviert, die membrangebundenes Interleukin-21 (mIL-21) exprimieren, und die Kultur wird mit den Zytokinen Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-15 (IL-15) ergänzt. Zusammen führt dieser Ligandencocktail zu einer verlängerten Expansion...

Ex-vivo-Expansion natürlicher Killerzellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung, Expansion und in-vivo-Bildgebung von NK-Zellen aus hES-und iPS-Zellen abgeleitet.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

Hier stellen wir ein angepasstes Protokoll vor, das zur Erzeugung einer großen Anzahl von murinen invarianten natürlichen Killer-T-Zellen aus der Milz der Maus verwendet werden kann. Das Protokoll beschreibt einen Ansatz, mit dem Milz-iNKT-Zellen in vitro mit einer begrenzten Anzahl von Tieren und Reagenzien angereichert, isoliert und expandiert werden können.

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Ein Protokoll zur Untersuchung von FcγRIIIa-gesteuerten Ereignissen durch therapeutische Antikörper in menschlichen natürlichen Killerzellen wird hier beschrieben. Diese künstliche Stimulationsplattform ermöglicht die Abfrage nachgeschalteter Effektorfunktionen wie Degranulation, Chemokin/Zytokin-Produktion und Signalwege, die durch die FcγRIIIa- und Fc-Anteile von Antikörpern, die an der Bindung beteiligt sind, vermittelt werden.

Bewertung menschlicher natürlicher Killerzellereignisse, die durch fcγRIIIa Engagement in Gegenwart therapeutischer Antikörper angetrieben werden

Wir beschreiben ein schnelles und robustes Protokoll, um invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT) aus Mausmilz anzureichern und sie in vitro auf geeignete Zahlen für In-vitro- und In-vivo-Studien zu erweitern.

Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien

Hier stellen wir eine Methode zur Erweiterung von peripheren Blut-Naturkillern (PBNK), NK-Zellen aus Lebergeweben und chimären Antigenrezeptor (CAR)-NK-Zellen vor, die aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (CB) stammen. Dieses Protokoll demonstriert die Expansion von NK- und CAR-NK-Zellen unter Verwendung von 221-mIL-21-Feederzellen zusätzlich zur optimierten Reinheit expandierter NK-Zellen.

Natural Killer (NK) und CAR-NK Zellexpansionsmethode unter Verwendung der membrangebundenen IL-21-modifizierten B-Zelllinie

Das vorliegende Protokoll zeigt, wie CD3−/CD45+CD56+-Zellen mit leichter Zytotoxizität von humanen Stammzellen mit expandiertem Potenzial (hEPSCs) sowohl unter 3D- als auch unter 2D-Kulturbedingungen unterschieden werden können. Dies ermöglicht eine routinemäßige phänotypische Validierung, ohne die komplexe Mikroumgebung zu zerstören.

Generierung natürlicher Killerzellen aus humanen Stammzellen mit erweitertem Potenzial

Lernen Sie die Expansion und Reinigung humaner NK-Zellen aus peripherem Blut für die Immuntherapie. Diese Methode ermöglicht eine 21.000-fache Zellvermehrung mit hoher Tumorzytotoxizität.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

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