Name: Perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T18:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez la manipulation et la séparation de cellules et de billes dans des dispositifs microfluidiques multicouches en utilisant la diélectrophorèse avec des circuits imprimés. Cette méthode offre une approche pratique et accessible pour la recherche en microfluidique.

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Nous exprimons notre gratitude à Woo-Jin Chang pour fournir des canaux pour le DEP trifurcating actionnement et à Mitchell Collens pour son aide dans l&#39;installation des équipements. Le travail a été soutenu par la NSF américaine par le biais de subvention OISE-0951647 et par Taiwan NSC travers Grant 99-2911-1-002-007.

Un schéma général de la configuration de l'équipement est montré dans la figure 1A. L'assemblage PCB-échantillon est détaillée dans un schéma en coupe de la figure 1B. 1. Préparation des électrodes PCB: <ol><li> PCB Design électrodes à la géométrie désirée pour générer un champ électrique non uniforme. Personnalisé puces électrode PCB peuvent être commandés par des installations de fabrication commerciale (figure 1C). </li><li> Préparer préfabriqués électrodes PCB par soudage de calibre 16 fil à la fin de chaque électrode métallique imprimé (figure 1D). <ol><li> Placez le fil à l'extrémité de l'électrode. Tenez le fil en place sur la partie métallique du PCB avec le fer à souder chaud pour chauffer le fil. </li><li> Nourrir un peu de soudure sur le fil chauffé à remplir le fil avec de la soudure. </li><li> Après le fil est rempli avec de la soudure, enlever le fer à souder, maintient le fil en place pendant la soudure se refroidit. </li></ol></li><li> Répétez le processus de soudage pour chaque raccordement électrique sur le PCB (figure 1D). </li></ol> 2. Préparer canaux microfluidiques: <ol><li> Polydiméthylsiloxane (PDMS) basé canaux microfluidiques sont préparés en utilisant l'élastomère PDMS, Sylgard 184 de Dow Corning. Un moule maître qui définit les canaux sont généralement créées par des procédés de microfabrication standard en utilisant une plaquette de silicium et de résine photosensible SU-8. </li><li> Mélanger composé de base à l'agent de durcissement à un ratio de 10:1 pour 5 minutes. </li><li> Verser le liquide PDMS sur le moule préfabriqué SU-8 maîtriser et éliminer les bulles d'air en exposant liquide PDMS au vide pendant quelques minutes. Répétez le processus si nécessaire sous vide pour éliminer complètement toutes les bulles. </li><li> Guérissez les PDMS à 70 ° C pendant 2 heures. </li><li> Retirez la dalle avec des canaux microfluidiques en PDMS de la plaquette avec une lame de rasoir, attention à ne pas casser la plaquette. </li><li> Percez des trous pour l'introduction de liquides et de cellules dans le dispositif microfluidique. (Remarque: Seringue de pompage, gravité ou la tension superficielle de débit basée peuvent tous être utilisés avec DEP). </li><li> Inspectez le dispositif microfluidique afin de s'assurer qu'elle est exempte de poussière et de débris. Nettoyage du PDMS peuvent facilement être réalisé en utilisant ruban 3M Scotch Magic. </li><li> Plasma coller les canaux microfluidiques en PDMS à un nettoyage No.0 épaisseur (80 à 130 um) lamelle. Chauffer l'assemblage lamelle-microfluidique à 100 ° C pendant un minimum de 15 min. </li></ol> 3. Préparer les médias à faible conductivité-: <ol><li> Faible conductivité des médias est préparée en mélangeant 8,5% de saccharose glucose + 0,3% (p / v) dans déminéralisée (DI) d'eau 1. Remarque:. Nous avons déjà démontré que les cellules peuvent être cultivées pendant des jours dans les milieux de culture conventionnels cellule après avoir été exposés à une faible conductivité pour de courtes périodes (environ 30 min) 11 </li></ol> 4. Assemblez canaux microfluidiques sur des électrodes du circuit imprimé: <ol><li> Placer une petite quantité (environ 10 pi) de l'huile minérale sur le PCB pour assurer un contact étroit entre le PCB et la lamelle. Remarque: Une étape facultative pour diminuer la visualisation de l'électrode est de recouvrir la surface PCB avec une très fine couche de feutre indélébile noir ou peinture. </li><li> Placez l'ensemble de canal lamelle-microfluidique sur le PCB huilé, avec contact lamelle formant avec l'huile (lamelle vers le bas). Appuyez doucement sur l'assemblage lamelle-microfluidique vers le bas pour assurer un bon contact et de minimiser les bulles d'air qui peuvent nuire à la cellule et la visualisation de perles. Un exemple de dispositif complété est montré dans la figure 1D. </li></ol> 5. Trier et concentré Perles et Cellules utilisant DEP: <ol><li> Remplissez les canaux microfluidiques avec de l'eau DI ou à faible conductivité des médias, le processus de collage de plasma facilite le chargement facile des solutions aqueuses dans les canaux microfluidiques par temporairement rendant la surface hydrophobe normalement PDMS hydrophile. </li><li> Introduire des cellules et / ou des billes de polystyrène dans le réservoir de canal (figure 1C). Ici, nous utilisons un adénocarcinome du côlon humain (HT-29) cellules. </li><li> Connectez la sortie d'un générateur de fonctions à l'entrée d'un amplificateur d'alimentation, puis branchez la sortie de l'amplificateur aux fils de l'électrode. Couvrir tous les fils électriques et des surfaces de l'installation avec du ruban électrique pour protéger les utilisateurs de l'exposition potentielle à un choc. Un diagramme schématique de la configuration du matériel est montré dans la figure 1A. </li><li> Régler le générateur de fonctions pour produire une sortie d'onde sinusoïdale de 1,0-1,5 MHz. L'amplitude de la sortie doit être ajustée pour l'amplificateur de puissance RF pour produire une puissance de 80-100V à la carte. L'amplificateur de puissance RF dans ce travail nécessite une tension d'entrée autour de 220 à 330 mV. Pour séparer les cellules et les perles, le taux d'écoulement laminaire doit être conforme à la force DEP pour passer des cellules et des perles dans le canal principal (largeur w = 100 um, la hauteur h = 27 um) dans les canaux de cible (largeur w = 100 um , hauteur h = 27 m). Attention: consulter le fabricant de PCB pour déterminer les mtensions de fonctionnement MAXIMALE pour éviter des problèmes tels que la surchauffe des PCB ou de fusion. Vérifiez les spécifications du fabricant de l'équipement pour le générateur de fonctions et de fabricants d'amplificateurs de puissance pour déterminer les paramètres d'exploitation sûre. </li><li> Initier DEP pour trier les cellules et les perles. Cellules expérience positive-DEP alors des billes de polystyrène expérience d'un négatif-DEP dans un domaine non-électrique uniforme dans les fréquences spécifiées. Cela permet DEP-force-activé bioactuation et de séparation des cellules et d'autres particules dans des dispositifs microfluidiques en utilisant les PCB abordable et réutilisables comme électrodes. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Lorsque DEP est efficace à des cellules d'actionnement ou de particules, un alignement robustes au sein non uniforme des champs électriques est observée pour les bains statiques ou vitesses de fluide lent. Dans des conditions de vitesses de fluide plus élevée, le comportement des cellules ou des particules dépend de l'orientation relative de l'écoulement axial du champ électrique et la vitesse d'écoulement. En outre, les comportements de cellules et de particules sont également tributaires de l'intensité du champ électrique et le degré de non-uniformité dans le domaine électrique. Les comportements typiques des cellules ou des particules comprennent des chaînes de perles, le cyclisme, décrochage, ou de tourner. Affections qui compromettent ou abolir DEP comprennent la présence de sels ou d'autres molécules dans le liquide ionique, faible intensité de champ électrique, les vitesses d'écoulement excessif, des lamelles qui sont trop épais, ou des solutions conducteur entre la lamelle et les électrodes PCB (par exemple une lamelle craqué peut induire le mélange d'eau et d'huile minérale). Ici, lorsque vous utilisez No.0 lamelles d'épaisseur (80 à 130 um) et une distance entre les électrodes d'(231 um), le gradient du carré de l'intensité du champ électrique appliqué à la-29 cellules HT et des perles est estimé à entre 2 -8 à 6 -8 V 2 / um 3 1. La force DEP peut être estimée en mesurant la vitesse de la particule, manipulés par des DEP dans un fluide statique (Figure 2A-B). En raison de la faible inertie de la particule et de l'environnement très visqueux du canal microfluidique, la force de traînée hydrodynamique sera égal à, mais en sens inverse avec la force DEP. La vitesse moyenne de billes dans la faible conductivité des médias est de 34,5 um / s avec une tension de 93 Vcc DEP et de 1,5 MHz. La force de traînée hydrodynamique peut être calculée avec l'équation suivante 1. F = glisser 6πηRv La viscosité moyenne η des médias faible conductivité à 20 ° C est de 1,27 mPa • s et le rayon R est de 7,5 um perles. La force de traînée hydrodynamique pour la microbille en polystyrène est estimé à 6,19 pN. Afin de démontrer la capacité d'actionner des perles dans les canaux microfluidiques (figure 2C-F), nous avons lancé le débit de la faible conductivité des médias-en employant des flux médiation tension de surface. La vitesse moyenne de billes dans le canal d'entrée unique a été 1540 um / sec, tandis que la vitesse moyenne dans les canaux individuels a été réduit à 565 um / sec (figure 2C). En initiant DEP, les billes ont été retenus dans le canal central, plutôt que d'être rejetées dans le canal latéral. Ainsi, dans ces conditions, les forces de DEP ont été suffisantes pour surmonter la force de traînée du fluide dans les deux canaux latéraux. Le même principe a également été utilisé pour détourner les perles de la Cannel au centre d'un canal latéral simple en changeant simplement l'orientation des canaux et les flux de talon à celle des électrodes PED (Figure 2E-F). En inclinant le électrode métallique sur le côté du canal d'entrée unique, quand DEP a été lancé, les billes ont été guidés vers le côté de la chaîne comme les perles approché le point de bifurcation. Là, les forces de DEP ont été suffisantes pour tirer les billes dans l'un des canaux secondaires, où le flux laminaire continué à les propulser vers le canal (figure 2F). Parce que les cellules et les billes de polystyrène ont de nettes différences dans leur capacité à être polarisée et actionné au non-uniforme des champs électriques, nous utilisons DEP afin de démontrer la capacité d'effectuer la séparation sur-puce de cellules et de perles, simultanément. Nous avons utilisé la structure même canal microfluidique et les électrodes PCB tel que configuré dans la figure 2E-F, mais introduit une suspension de cellules HT-29 et des perles de faible conductivité des médias dans le canal d'entrée unique (figure 3). Lorsque le DEP est introduit, et dans ces conditions, le HT-29 cellules ont été conservées dans les deux canaux de sortie gauche, alors les billes ont été retenus dans le canal de sortie individuelle sur la droite. Ici, les cellules ont un comportement caractéristique «perle de chaînage» comme elles sont collectées dans le canal de sortie gauche. Parfois un bourrelet et la cellule sont attachés ensemble dans lequel ils sont rassemblés, souvent dans les canaux de sortie de la cellule. De cette expérienceal de données, nous déterminons le taux de tri à 713 particules (cellules et des perles) par minute, soit l'équivalent de 14 260 cellules et des perles en 20 minutes. Le nombre de cellules et de perles trouvés utiles et pertinentes pour la biologie moléculaire, l'imagerie, biochimiques et de laboratoire-sur-une-puce applications. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. PCB-DEP, des cellules et des particules dans les canaux microfluidiques. (A) La configuration de l'équipement pour le DEP basé actionnement commence par un générateur de fonctions pour définir la fréquence et l'amplitude du signal électrique, puis un amplificateur de puissance pour augmenter la puissance du signal du champ électrique généré sur le PCB. (B) L'Assemblée dispositif microfluidique pour l'actionnement de l'échantillon se compose de canaux microfluidiques en PDMS irréversiblement lié à un pas. 0 épaisseur (80 à 130 um) lamelle grâce à un plasma d'oxygène, non conducteurs de se baigner les cellules et / ou des perles. (C) Les électrodes PCB utilisé ici se composent de deux régions où les électrodes sont interdigitées pour générer une forte non-uniforme du champ électrique. (D) Le dispositif complété: un PCB avec un dispositif microfluidique trifurqué sur une lamelle unique encart montre l'ensemble du dispositif avec des fils de l'électrode. (CD) Pour l'échelle, les mesures de PCB sont de 8,4 cm (l), 2,1 cm (W), avec 5 mm de large électrodes. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Images représentant des cellules et des perles dans les canaux avant et pendant DEP actionnement. (A) 15 perles um polystyrène fluorescentes dans une solution à faible conductivité des médias dans un canal microfluidique en PDMS, sans flux laminaire (temps écoulé, de 1,23 sec.) (B) Dès l'initiation du DEP, les billes migrer vers les modèles d'électrodes PCB (bandes noires) plutôt que entre les électrodes (temps écoulé, 8,18 sec.) (C) Perles dans les mêmes canaux sous flux laminaire sont répartis entre les trois canaux séparés (le temps écoulé, 5,3 sec), lorsque le DEP est lancé (D), les billes sont actionnés seulement la circulation dans le canal central (temps écoulé, 4.3 sec). (E) En changeant l'orientation des chaînes aux électrodes PCB, les perles peuvent être différemment dirigée vers les canaux latéraux (F) en utilisant DEP plutôt que le canal central, comme indiqué dans (D). (EF) Le temps écoulé est 8.23 ​​sec et 5.16 sec, respectivement. Toutes les barres d'échelle = 100 pm. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Images représentant des cellules et des perles dans les canaux avant et pendant DEP actionnement. (AB) Avant d'entreprendre DEP, une solution mixte d'adénocarcinome du côlon humain (HT-29) et le flux des cellules perles d'un canal à trois canaux de sortie séparés. La flèche ouverte identifie le sens d'écoulement laminaire et les canaux sont décrits avec des lignes pointillées pour l'orientation et des éclaircissements. (CD) par DEP induisant, de perles et les cellules sont sélectivement actionné en canaux séparés identifiés. Cellules HT-29 de sortie du canal central et gauche, tandis que la sortie des perles sur le canal droit. Chaînage perle des perles et des caractéristiques des cellules est observée au cours du DEP actionnement. (A, C) d'imagerie de contraste interférentiel différentiel des cellules et des perles dans des microcanaux rend les perles facilement visibles. Glow Images échelle d'intensité (B, D) des mêmes images DIC (A, C) d'améliorer la visualisation des cellules dans les canaux. Les électrodes en métal réfléchissant ((A, C) à bande légère et (B, D) jaune et vert) fournissent un point de repère important pour l'alignement des microcanaux aux électrodes pour les PED efficaces à base d'actionnement. Barres d'échelle = 100 pm.

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La manipulation des cellules dans des dispositifs microfluidiques est souhaitable pour le tri ou le placement sélectif de cellules individuelles ou pour les études de population. 2 à flux laminaire est utilisée en conjonction avec des vannes et des pompes pour manipuler des cellules au sein des dispositifs microfluidiques. Cependant, ces méthodes seules sont difficiles et nécessitent des procédés de fabrication détaillées et les compétences 3 centrifugation permet de simplifier les exigences pour le placement des cellules, mais l'imagerie simultanée constitue un défi;. Par ailleurs, l'architecture de canal pour la centrifugation doit être considérer attentivement lors de la conception des manipulations souhaitées et compte tenu des effets des forces centripètes. 4 pinces laser peut être utilisé pour le placement des cellules, mais la méthode est coûteuse et ne se prêtent pas au tri cellulaire à haut débit. 5 Pourtant, la DEP a été démontré comme un système efficace de «pinces électriques" pour le placement de cellule effective, la caractérisation et la manipulation 6,7. Plus précisément, la DEP a été utilisé pour la capture sélective et le tri des cellules sur puce pour le traitement des cellules vivantes et mortes, 7-10 et pour recueillir des cellules sur des capteurs de résonance pour la mesure de la masse cellulaire. 11 Nous avons déjà démontré que, en augmentant le DEP vigueur sur les bactéries ou les perles dessus de la force de traînée fluidique, la concentration sur la puce et le piégeage des billes de polystyrène et de Listeria monocytogenes V7 peut être accompli. 12 populations mixtes de E. coli et L. bactéries monocytogenes peut également être réalisé et publié grâce à des impulsions DEP. Par ailleurs, les grosses particules peuvent être capturées différemment et concentrée sur les électrodes sur la base des particules de grande taille, alors que les petites particules ne sont pas la capture mais ils sont retirés avec l'écoulement fluidique. 13 Quand les forces DEP ne surmontent pas les forces fluidiques traînant sur ​​les particules, les perles ou de la cellule n'est pas capturé, mais plutôt déplacée dans le courant fluidique. Comme le montre la figure 2C, perles peuvent être concentré dans la région centrale du courant de fluide suffisante pour retenir les perles dans le canal central. Cela pourrait être dû à l'effet combiné de la particule-particule au sein de l'influence du champ électrique, vitesses de fluide plus grande que les forces DEP traînant, la combinaison de ces derniers, ou quelque autre effet indéfini. Les nouvelles avancées dans DEP contact permettent de maximiser la capture et la manipulation de cellules avec le champ minimum requis, protégeant ainsi les types de cellules, la plus grande mesure, lors de la manipulation du DEP. DEP 1,9 Contactless promets offre à la communauté de la microfluidique pour le tri, la collecte et le positionnement des cellules au sein des dispositifs microfluidiques. Nous prévoyons que la demande accrue pour, et l'application de la DEP pour la manipulation au sein de dispositifs microfluidiques, de nouvelles découvertes et innovations élargira la compréhension et l'influence des forces de DEP. Les PCB peuvent être fabriqués par des procédés à haut volume à un prix abordable avec un délai de fabrication rapide, ce qui les rend bonnes plateformes pour la commercialisation. En outre, les PCB sont faciles à utiliser et accessible pour les scientifiques dans un éventail de disciplines pour des manipulations de cellules sur puce et de tri. Lors de l'aménagement des électrodes contenant des BPC, il faut tenir compte de la désirée de particules / cellule trajectoire. Les facteurs clés à considérer sont la taille des particules et le type (perles et / ou cellulaire), le type de cellules, la taille de microcanaux, vitesse d'écoulement, l'espacement des électrodes (qui détermine l'intensité du champ électrique), l'épaisseur de la lamelle, et la conductivité du fluide. Ces facteurs influencent la force nécessaire et disponible pour manipuler la particule ou cellule, et, finalement, l'efficacité de séparation. Notre protocole présenté ici démontre une configuration efficace pour initier DEP pour microsphères et de séparation des cellules. Pour les applications potentielles, les utilisateurs doivent correspondre à l'architecture de la conception canal microfluidique avec les chemins de débit souhaité pour les cellules et les perles, ainsi que les motifs d'électrodes afin d'optimiser l'efficacité de chaque application. Distance entre les électrodes et l'épaisseur de la lamelle peut être utilisé selon les directives précédemment rapportés lors de la conception de l'aménagement canal microfluidique 1. La conductivité et la permittivité de la cellule / de particules et le milieu environnant doit être suffisamment différentes pour faciliter le DEP positive ou négative, tout en gardant les cellules intactes. La polarité du DEP pour une particule sphérique peut être déterminée à partir de la partie réelle d'une valeur complexe des éléments suivants de Clausius-Mosotti facteur à l'ω la fréquence de la tension de la DEP. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="Équation 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="L'équation 1"> L'équation 1 Dans cette équation ε est la permittivité, σ est la conductivité, et ε * est permittivité complexe. Les indices p et mdésignent les particules et les médias, respectivement. Quand une cellule a une plus forte permittivité que les médias, ou la partie réelle du facteur de Clausius-Mosotti devient positive, la particule devient plus polarisé que le milieu environnant. Grâce à un champ électrique non uniforme, la polarisation de la particule devient non uniforme et cela crée un DEP positive (+ DEP) la force qui attire la cellule vers la région avec une intensité plus élevée du champ électrique. Si une cellule a une faible permittivité que le milieu environnant, ou la partie réelle du facteur de Clausius-Mosotti devient négative, il va subir DEP négatif (-DEP), et la cellule est forcée vers la région du champ minime. Si la cellule et les médias ont à peu près la même permittivité complexe, aucune force ne peut être généré à manipuler la cellule. Pour cette raison, l'eau pure est un support privilégié pour la manipulation de particules DEP. Cependant, pour éviter le stress osmotique sur la cellule de l'eau pure, des médias à faible conductivité a été formulé pour maintenir la conductivité inchangé, mais d'augmenter l'osmolarité pour diminuer le stress osmotique vers les cellules. Conventionnel milieux de culture cellulaire ou des tampons physiologiques, tels que DMEM ou PBS, ont une conductivité élevée, ce qui n'est pas adapté pour la manipulation du DEP. Nous avons aussi précédemment démontré que les cellules peuvent être capturées sur des capteurs avec DEP en utilisant les médias faible conductivité. Après une brève période pour la fixation des cellules, des médias à faible conductivité peut être remplacé pour les médias nécessaires culture cellulaire pour soutenir la croissance de cellules pour les jours de 11. De notre expérience, des perles fluorescentes sont très lumineuses à l'égard de la fluorescence de cellules vivantes, donc il peut être un défi pour correspondre à l'intensité bourrelet à l'intensité d'une cellule vivante et fluorescentes. Pour améliorer la visualisation à la fois des cellules et les perles, nous avons utilisé la microscopie DIC sur un microscope droit pour l'imagerie à la fois. Pour afficher les cellules et les perles, nous avons présenté les données à une intensité d'éclat-échelle de l'image, qui conserve les données dans un large spectre de couleurs pour faciliter la visualisation. Ainsi, lors de la conception de l'étude d'intérêt, les paramètres d'imagerie et les ressources doivent être considérés. En résumé, nous démontrons la capacité d'actionner sélectivement les perles et les cellules en canaux séparés à l'aide du DEP. Avec l'utilitaire croissant de canaux microfluidiques pour la biologie cellulaire, la biochimie et les applications de bio-ingénierie, DEP est une option souhaitable pour la collecte de cellules, de placement et de tri. La fabrication des PCB électrodes est peu coûteux et pratique, les électrodes sont faciles à utiliser, et le temps de fabrication rapides sont idéales pour l'application de la DEP.

<table><tbody><tr><td>Kit Sylgard 184 (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard</td></tr><tr><td>Fil électrique 16 awg</td><td>Belden</td><td>8521</td><td>(Type MW) Mil-W-76C-PVC</td></tr><tr><td>Verre de couvre-objet Gold Seal</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260320</td><td>Épaisseur n° 0, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Emporte-pièce Miltex pour biopsie</td><td>VWR international</td><td>95039-104</td><td>Miltex, tailles variées</td></tr><tr><td>Électrodes sur carte électronique personnalisée (PCB)</td><td>Bay Area Circuits</td><td>Pièces personnalisées</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Fisher Scientific</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>Eau déionisée</td><td>Alimentation en eau DI du laboratoire</td><td>Aucun</td><td>Utiliser de l’eau DI filtrée</td></tr><tr><td>D-Glucose anhydre, granulaire, qualité AR</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>4912-06</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose, cristallisé</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>8360-06</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles polymériques fluorescentes</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS07F/9277</td><td>Microbilles Dragon green de 15&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Ligne cellulaire HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38D</td><td>Adénocarcinome du côlon humain</td></tr><tr><td>Tripsine 0,05 % EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Microscope droit Eclipse E600FN</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Caméra d'imagerie haute vitesse Phantom V310</td><td>Phantom</td><td>V310</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de recherche droit BX51</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Caméra couleur haute résolution SpotFlex</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>FX1520</td><td></td></tr><tr><td>Générateur de fonctions</td><td>Agilent Technologies</td><td>3325A</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur de puissance RF</td><td>EIN</td><td>2100L</td><td></td></tr></tbody></table>

perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Dispositifs microfluidiques ont avancé des études cellulaires en fournissant un environnement dynamique fluidique sur l&#39;échelle de la cellule pour étudier, manipuler, trier et compter les cellules. Cependant, la manipulation de la cellule au sein du domaine fluidique reste un défi et nécessite des protocoles de fabrication complexe pour former des valves et des électrodes, ou les demandes d&#39;équipement spécialisé comme des pinces optiques. Ici, nous démontrons que conventionnelles cartes de circuits imprimés (PCB) peuvent être utilisés pour la manipulation sans contact de cellules en employant diélectrophorèse (DEP) pour la manipulation des billes et des cellules dans les champs de flux laminaire pour bioactuation, et pour la séparation des cellules et billes de microfluidique multicanaux périphériques. Tout d&#39;abord, nous présentons le protocole pour l&#39;assemblage des électrodes DEP et dispositifs microfluidiques, et la préparation des cellules pour le DEP. Ensuite, nous caractérisons l&#39;opération DEP avec des billes de polystyrène. Enfin, nous montrons des résultats représentatifs de la séparation de perles et de cellules dans un dispositif multicanal microfluidique. En résumé, la DEP est une méthode efficace pour manipuler des particules (billes ou de cellules) dans des dispositifs microfluidiques.

Diélectrophorèse (DEP) est une méthode efficace pour manipuler des cellules. Cartes de circuits imprimés (PCB) peuvent fournir des électrodes bon marché, réutilisables et efficace pour la manipulation sans contact des cellules au sein des dispositifs microfluidiques. En combinant PDMS basée sur des canaux microfluidiques avec des lamelles sur les PCB, nous démontrons la manipulation de billes et de cellules et de séparation au sein multicanal dispositifs microfluidiques.

Perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire

Les dispositifs microfluidiques ont fait progresser les études cellulaires en fournissant un environnement fluidique dynamique à l'échelle de la cellule pour l'étude, la manipulation, le tri...

L'objectif général de cette procédure est de manipuler des cellules et des billes à l'intérieur de dispositifs microfluidiques en utilisant la diélectrophorèse ou DEP à l'aide de cartes de circuits imprimés ou PCB. Cela est réalisé en concevant et en préparant tout d'abord les électrodes PCB et les canaux microfluidiques. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer l'assemblage microfluidique PCB ainsi que les solutions de billes et de cellules.La troisième étape de la procédure consiste à remplir les canaux avec un milieu de faible conductivité, puis à charger les billes et les cellules. La dernière étape de la procédure est de relier l'assemblage de circuit imprimé à l'amplificateur de puissance et au générateur de fonctions, puis d'initier la DEP. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant la séparation et la manipulation de cellules et de billes dans des dispositifs microfluidiques grâce à l'utilisation de la DEP.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car l'utilisateur doit comprendre les principes de la DEP afin de concevoir un électrode efficace fonctionnant avec un dispositif microfluidique pour la manipulation des cellules ou des billes souhaitées. En revanche, l'utilisation de circuits imprimés (PCB) comme électrodes rend la manipulation des cellules et des billes dans des dispositifs microfluidiques accessible à divers domaines scientifiques. La première étape de cette procédure consiste à concevoir les électrodes en circuit imprimé, ou PCB, avec la géométrie souhaitée afin de générer un champ électrique non uniforme.Lorsque la conception est terminée, commandez les puces d'électrodes de circuit imprimé personnalisées auprès d'un fabricant commercial. Une fois que le circuit imprimé personnalisé est arrivé, ouvrez-le et inspectez-le pour cette démonstration. Le circuit imprimé mesure 8,4 centimètres de long sur 2,1 centimètres de large.Les électrodes métalliques ont une largeur de cinq millimètres. Dans cet exemple, les électrodes comportent deux longues bandes métalliques et deux régions transversales de 4,5 millimètres de longueur où les électrodes sont entrelacées. Ces régions entrelacées génèrent un champ électrique fort et non uniforme afin d'établir une connexion entre le stimulateur et l'électrode du circuit imprimé.Placer un fil de calibre 16 à l'extrémité de l'électrode. Utiliser un fer à souder chaud pour maintenir le fil en place sur la zone métallique du circuit imprimé. Cela chauffe le fil.Tenez le fil de soudure contre le fil chauffé et laissez une petite quantité de soudure pénétrer dans le fil. Une fois le fil rempli de soudure, retirez le fer à souder tout en maintenant le fil en place pendant que la soudure refroidit. Répétez le processus de soudage pour l'autre connexion électrique sur le circuit imprimé.L'étape suivante consiste à préparer des canaux microfluidiques avec le motif de branchement souhaité. À l'aide de techniques standard de microfabrication, créez un moule maître pour définir les canaux en utilisant une plaquette de silicium et une résine photosensible SU-8. Ce moule maître comporte un canal d'entrée et trois canaux cibles.La largeur des canaux est de 100 micromètres et la hauteur des canaux est de 27 micromètres. Une fois le moule maître créé, mélanger l'élastomère polyméthyl LAANE ou PDMS avec un agent de réticulation selon un rapport massique de 10 à 1 pendant cinq minutes. Verser le PDMS liquide sur le moule maître SU huit préfabriqué et éliminer les bulles d'air en exposant le PDMS liquide au vide pendant trois minutes.Répétez le processus sous vide si nécessaire afin d'éliminer complètement toutes les bulles. Un courant de gaz azote peut être utilisé pour éliminer les bulles excédentaires si besoin. Durcissez le PDMS dans une étuve à 70 degrés Celsius pendant deux heures.Utilisez une lame de rasoir pour retirer le laboratoire P-D-M-S-S avec les canaux microfluidiques du wafer. Veillez à ne pas casser le wafer en gardant l'espace des canaux vers le haut. Utilisez un poinçon biopsique pour percer des trous permettant l'introduction de fluides et de cellules dans le dispositif microfluidique. Coupez.Tout excès de PDMS. Inspectez le dispositif microfluidique pour vous assurer qu’il est exempt de poussière et de débris. Utilisez du ruban adhésif 3M Scotch Magic pour nettoyer le PDMS.Exposer les canaux en PDMS et une lame de couverture numéro zéro, d'une épaisseur comprise entre 80 et 130 micromètres, au gaz de plasma pendant 1,5 minute. Retirer le dispositif en PDMS et la lame de couverture du nettoyeur à plasma dans une boîte de Pétri ; réaliser une liaison par plasma en plaçant les canaux microfluidiques en PDMS face vers le bas sur la lame de couverture. Chauffer l'ensemble microfluidique sur une plaque chauffante réglée à 100 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. La dernière étape dans la préparation du dispositif microfluidique consiste à positionner les canaux en PDMS et la lame de couverture au-dessus des électrodes du circuit imprimé (PCB).Commencez par déposer environ 10 microlitres d'huile minérale sur la carte PCB. Afin d'assurer un bon contact entre la carte PCB et la lame de couverture, placez l'ensemble du canal microfluidique, comprenant la lame de couverture, sur la carte PCB huilée, côté lame de couverture. En contactant délicatement l'huile, appuyez doucement sur l'ensemble microfluidique pour garantir un contact optimal et réduire au minimum les bulles d'air, qui pourraient nuire à la visualisation des cellules et des billes.Une autre étape importante consiste à préparer le mélange de milieu à faible conductivité, composé de 8,5 % de saccharose et de 0,3 % de glucose (poids/volume) dans de l'eau déionisée. Le dispositif microfluidique est désormais prêt à l'emploi : à l'aide d'une pipette, remplissez chaque canal microfluidique avec 15 à 20 microlitres du milieu à faible conductivité, si nécessaire. Utilisez une aspiration sous vide pour éliminer les bulles d'air présentes dans les canaux.L'étape suivante consiste à introduire les particules de test dans le dispositif microfluidique. Cette démonstration utilise une suspension de 550 billes de polystyrène par microlitre de milieu à faible conductivité, car les billes peuvent se déposer avec le temps ; suspendez donc les billes par agitation. Ensuite, à l’aide d’une pipette, introduisez 200 microlitres de la suspension de billes de polystyrène dans le canal.L'étape suivante consiste à préparer les électrodes, à relier la sortie d'un générateur de fonctions à l'entrée d'un amplificateur de puissance CA, puis à connecter la sortie de l'amplificateur aux fils des électrodes. Recouvrir tous les fils électriques et les surfaces du dispositif avec du ruban isolant afin de protéger les utilisateurs d'une éventuelle exposition aux chocs électriques.Régler le générateur de fonctions pour produire un signal sinusoïdal de sortie compris entre un et 1,5 mégahertz. Démarrer la DEP afin d'entamer le tri des cellules et des billes dans ce dispositif. Le canal d'entrée se trouve à droite, et les trois canaux cibles se séparent au niveau du jonction trifurquée.Les électrodes PCB correspondent aux bandes noires sans écoulement laminaire et sans DEP. Les billes sont essentiellement stationnaires lors de l'initiation du DEP, mais en l'absence d'écoulement. Les billes migrent vers les électrodes PCB et s'éloignent de l'espace entre les électrodes lorsque l'écoulement laminaire est activé.Mais lorsque le DEP est désactivé, les billes circulant dans les canaux d'entrée sont réparties entre les trois canaux cibles. Lorsque le DEP est activé et que l'écoulement laminaire est en marche, les billes sont dirigées de manière à ne circuler que dans le canal central. Dans les vidéos suivantes, le dispositif microfluidique a été tourné au-dessus des électrodes PCB, ce qui a entraîné un changement d'orientation des canaux.En ce qui concerne les électrodes de PCB. Le canal d'entrée, qui était auparavant perpendiculaire aux électrodes de PCB, est désormais presque parallèle aux électrodes lorsque l'écoulement laminaire est activé. Mais en l'absence de DEP, les billes pénètrent également dans les trois canaux cibles.Lorsque la DEP est initiée, les billes s'approchent du point de trifurcation et la force de DEP attire les billes dans le canal latéral situé au-dessus de l'électrode. Cette série d'images dans la vidéo montre un mélange de cellules d'adénocarcinome du côlon humain ou cellules HT 29 et de billes fluorescentes dans le dispositif microfluidique. Sur cette image DIC, la flèche ouverte indique la direction de l'écoulement laminaire, et les canaux sont délimités par des lignes en pointillés.Les électrodes métalliques réfléchissantes apparaissent comme une bande claire en arrière-plan ; la microscopie à contraste interférentiel (DIC) est utilisée pour visualiser les billes en cours d'émission lumineuse. Intensité de l'échelle. Les images permettent de rendre les cellules plus visibles.Cette figure est l'identique de l'autre image, sauf qu'elle est présentée sous forme d'image d'intensité en échelle de luminosité, afin de visualiser aussi bien les cellules que les billes. Les électrodes métalliques réfléchissantes apparaissent sous forme de bandes jaunes et vertes sur cette figure. Avec le DEP, les billes sortent par le canal droit, comme indiqué sur l'image DIC, tandis que les cellules HT29 sortent par les canaux central et gauche, comme montré sur l'image en échelle de luminosité avant l'activation du DEP. Une solution mixte de cellules et de billes s'écoule depuis un canal d'entrée vers trois canaux cibles distincts.Après avoir induit la DEP, les billes et les cellules sont activées sélectivement vers des canaux distincts. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de commencer à mettre en œuvre l'électrophorèse à cadran pour la manipulation de cellules et de billes dans des dispositifs microfluidiques.

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Perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire (Vidéo) | JoVE Journal

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