Name: 교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 배우세요 FRAP 기술을 이용하여 해마 뉴런 돌기에서 EGFP 단백질 이동성을 정량화하는 방법을. 공초점 현미경과 이미지 분석 소프트웨어를 활용하여 단백질 동역학을 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 청각 및 기타 통신 장애에 국립 연구소 (NIDCD) 교내 프로그램에 의해 지원되었다.

1. 신경 세포의 transfection <ol><li> 폴리 - D - 라이신 - 코팅 MatTek에 문화 배아 일 18 일 (E18) 쥐 hippocampal 뉴런은 35 mm 유리 바닥 요리 1. 체외에서 16-18일에서 (DIV), Clontech CalPhos 포유 동물 Transfection 키트를 사용하여 transfect의 뉴런. 첫째, 1.5 ML있는 문화 매체를 교체 <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">Dulbecco의 수정된 이글 중간</a> transfection하기 전에 35 - mm 요리 0.5 시간당 (DMEM). 나중에 (단계 1.6) 사용할 수있는 살균 15 ML 튜브에서 원래 문화 매체를 저장합니다. </li><li> 무균 H 2 O (Clontech) 100 μl의 총 볼륨에 12.4 μl 2 M의 칼슘 용액 (Clontech) 10 μg pEGFP - N1 플라스미드 DNA를 섞습니다. </li><li> 100 μl 2 단계 1.2)의 혼합물을 추가 × HBS dropwise vortexing이 동안 × 중간 속도 HBS. </li><li> 혼합물은 20 분 실온에서 앉아 후 DMEM - incubated 뉴런에 1.3 단계)에서 최종 혼합물을 추가하자. </li><li> 1-1.5 시간 동안 37 ° C 배양기로 다시 뉴런 놔. </li><li> 인산 칼슘 함유 매체를 제거 후 DMEM 세 번와 세포를 씻으십시오. 원래 문화 매체와 DMEM 매체 인큐베이터, 교류 문화 요리를 반환하기 전에. </li></ol> 2. 척추에 FRAP 실험 <ol><li> 뉴런은 2~4일 transfection 후 FRAP 실험에 사용됩니다. </li><li> 즉시 (MM)를 NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, 포도당 10, 글리신 0.005, CaCl 2 2.6, 및 MgCl가 포함되어 있습니다 미리 예열 Tyrode 솔루션을 추가하여, 35 mm 유리 바닥 요리에서 배지를 교체 이 1.3 (NaOH와 7.4로 조정 PH). </li><li> 자이스 혈구 LSM 710 공촛점 현미경은 FRAP 실험에 사용됩니다. 자이스 혈구 TempModule 시스템은 온도 (37 ° C), 습도 및 작업 시스템의 CO 2 (5 %)을 제어하는 데 사용됩니다. CO 2 탱크가 연결되어 있고 습도를 균형에 사용되는 물 병은, 물로 채워져 있는지 확인합니다. </li><li> 100 × 목표 (αplan - 고차 색지움 100 × / 1.46 오일)와 transfected 성숙 dendrite를 찾습니다. 접시에 transfected 세포가 스파스, 40 원하는 셀 검색 × 목표 (계획 - NEOFLUAR 40 × / 1.3 석유), 다음 100 × 스위치 이미지를 캡처하는 객관적인 경우. </li><li> 5 × 광학 줌 사용 및 이미지 몇 쪽이과 dendrite의 짧은 조각을 위해 256 × 256 픽셀 해상도를. 이미지를 캡처하려면, 0.5 초이 검사를 완료하는 데 걸리는 속도 명목 9 (픽셀 시간이 3.15 μsec 살기)을 사용합니다. 핀홀은 강한 형광을 얻기 위해 2μm로 설정됩니다. 이미지를 복용하면, 전체 이미지를 photobleaching 피하기 위해, 예를 들어 1-5%에 대한 낮은 레이저 전송을 사용하려고합니다. </li><li> 관심 척추를 선택합니다. 우리의 실험에서, 우리는 ~ 1 μm의 자신의 척추 헤드 지름과 버섯 쪽이을 선택합니다. </li><li> FRAP 실험을 수행하려면 488 레이저 라인에서 50 % (15 MW)와 아르곤 레이저의 파워는 30 MW입니다 [표백 후, 표백하기 전에 정격 100 % 레이저 전송에 관심을 10 번의 척추를 5 컨트롤 이미지를 가지고, 약 3-4 MW는 488 레이저 라인]를 통해 현미경에 도달하고 즉시 표백 후 이미지의 시리즈를 캡처합니다. 본 실험의 경우, 이미지는 표백 후 15 초 동안 매 일초를 점령하고 있습니다. 시간 간격은 다른 타겟팅 단백질 및 다른 실험 설계 (그림 1)에 따라 조정되어야합니다. </li><li> 이미지를 저장합니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> ImageJ 소프트웨어와 이미지를 엽니다. </li><li> 관심 척추가 물에 뜨지 않는다 그래야, ImageJ에서 - (→ → '번역'및 / 또는 '엄격한 신체'스택에 조각 정렬 '플러그인'→ '걸어갔다 스택')은 정렬 도구를 사용하여 이미지의 스택 정렬 다른 단어 - 그것은 이미지에 동일한 위치에 남아 있습니다. </li><li> ImageJ의 '강도 V 타임 모니터'도구 ( '플러그인을 사용하여 관심있는 척추 (F S), transfected지만, 표백하지 않은 영역 (제어), 그리고 시간 경과 이미지에서 배경 영역 (F B)의 상대 형광 강도를 측정 '→'스택 - 걸어갔다 '→'강도 V 타임 모니터 '). 제어 영역은 잘 집중 말초 dendrite의 조각 될 수 있습니다. 배경 지역이 아닌 형광등 지역입니다. </li><li> 전에 (F C0)와 (F C) photobleaching 후 제어 영역의 형광을 비교하여 photobleaching 속도를 (R)을 계산. R = F C / F C0. </li><li> 다음과 같이 대상 척추의 형광 강도 (F)를 정상화 : F = (F S - F B) / R. </li><li> 커브가 한 단계 지수 Graphpad의 프리즘 소프트웨어의 방정식 (그림 2) 또는 인접해있는 대상 척추의 형광 강도에 맞게R 유사한 소프트웨어. </li><li> 모바일 분율 (F M) 다음과 같은 등식으로 고정되어 분수를 (F I) 계산 : F M = F ∞ / F 0, 어디 F ∞ 전체 복구 후 형광 강도이며, F 0 photobleaching 전에 형광 강도입니다. F I = 1 - F M. </li></ol> 4. 대표 결과 : 본 연구에서는, 우리는 성숙한 hippocampal 뉴런에 FRAP 실험을 수행합니다. 18-22 DIV에서 버섯 쪽이 이미 형성됩니다. 우리의 방법을 사용하여 같은 척추와 같은 작은 영역에서 형광 강도의 동적 변경, 녹음 수 있습니다. EGFP의 형광 복구 프로세스를 분석하기 위해, 우리는 표백하기 전에 컨트롤로 5 이미지 다음 즉시 15 초 동안 표백 후 매 일초 한 이미지를 가져가라. 이미지의 해상도가 정량 분석​​을 위해 충분합니다. 태그 형광 단백질의 형광 복구 프로필이 높은 재현성 있습니다. 우리는 또한 간략하게 ImageJ 및 Graphpad의 프리즘 소프트웨어를 사용하여 형광 단백질의 모바일 및 고정되어 분수를 정의하는 방법을 보여줍니다. 우리가 여기에 표시 FRAP 방법 및 분석은 크게 신경 과학, 세포 생물학 연구와 다른 연구에서 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 교양 hippocampal 신경 세포에서 척추에 EGFP 형광의 FRAP 측정. 빨간 화살촉은 photobleaching의 시간을 나타냅니다. 사진은 전에 동일한 영역을 (사전) 대표와 photobleaching 0, 1, 5, 10, 15 초 후. 척추, 제어 및 배경의 지역은 문자 각각 S, C와 B와 함께 표시됩니다. 뉴런은 실험 기간 동안 37 ° C에서 유지되었다. 스케일 바, 1 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 15 초 동안 EGFP 형광의 FRAP 곡선. 녹색 라인은 원래의 곡선을 보여주는, 빨간색 선은 표준 곡선을 보여줍니다. 곡선에있는 점들은 FRAP 매 일초을 보여줍니다. 곡선은 한 단계 지수 방정식으로 장착되었습니다. photobleaching 전에 평균 형광 100 %로 계산되었다. 본 실험에서는 모바일 분수 (MF)는 94%이고 고정되어 분수 (IF) 6 %입니다.

<ol><li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li>
<li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins%3A+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca%282%2B%29-ATPase+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li>
<li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+binding%3A+proper+and+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

FRAP 분석은 크게 생체내 및 시험 관내 1-2 연구에 사용되고 있습니다. 이 기술은 일반적으로 이용 GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="융합 단백질">융합 단백질을</a> 그것도 빨간 알가의 융합 단백질 3을 사용할 수 있지만. 이 분석은 민감하고 GFP - 태그 단백질의 이동성을 특징하는 데 사용할 수 있습니다. 의미 FRAP 분석을 생산하기 위해서는 이전과 FRAP 실험 도중 불필요한 photobleaching을 방지하는 것이 중요합니다. 이것을 달성하기 위해 두 가지 방법이 있습니다. 첫째, 검색 및 실험 신경 세포를 관찰하는 과정이 빨리되어야합니다. 특히, 오랫동안 100X 목적으로 뉴런의 관찰 크게 형광 표백제로 닦았을. 둘째, 높은 레이저 전원과 상용 스캔은 종종 photobleaching의 가능성을 높일 수 있습니다. 그러므로, 그것은 통제 지역에서 photobleaching 율을 계산하고 실험 지역에서 FRAP 곡선을 정상화하기 위해 필요합니다. 정규화 방법 (자세한 내용은 단계 3.3-3.5 참조) 프로토콜에 설명되어있다. photobleaching 단계는 또한 좋은 FRAP 결과를 확보 중요합니다. 본 실험에서는, 우리는 100 % 표백 레이저 전송에 관심이 10 배의 척추 있습니다. 이 조건은 표백 고정 준비 배경 수준으로 척추의 형광을하기에 충분합니다. 따라서, 우리는 photobleaching 후 0초에서 배경 같은 번호로 형광 강도를 설정합니다. 첫 번째 스캔의 속도에 따라 형광 복구의 상당량은 이미 관심의 단백질이 높은 휴대 때 감지 수 있습니다. 많은 형광 단백질 프로브는 FRAP과 단백질 역학을 연구하기 위해 개발되었습니다. 보완 접근 photoactivatable GFP (PA - GFP) 또는 photoconvertible 변종을 사용하는, 예를 들어 있습니다. 함께 FRAP 기술과 함께,이 도구는 라이브 셀 이미징 연구 4-6위한 필수가되고있다.

<table><tbody><tr><td>35 mm 유리 바닥 디쉬 </td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>CalPhos 포유류 형질전환 키트</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 플라스미드</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 공초점 현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss TempModule 시스템</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>미국 국립보건원</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 소프트웨어</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

교양 hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 photobleaching 후 형광 복구 (frap)

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP는 GFP - 태그 단백질의 이동성을 계량하는 데 사용되었습니다. 강한 여기 레이저를 사용하여 GFP - 태그 단백질의 형광은 관심 지역에 표백됩니다. 지역의 외부에서 표백하지 않은 GFP - 태그 단백질 관심의 영역으로 diffuses 때 지역의 형광은 복구합니다. 단백질의 이동성은 다음 형광 복구 속도를 측정하여 분석합니다. 이 기술은 단백질 이동성과 회전율 속도를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 교양 hippocampal 뉴런의 (녹색 형광 단백질 강화) EGFP 벡터를 표현한다. 자이스 혈구 710 공촛점 현미경을 사용하여, 우리는 하나의 척추에 GFP 단백질의 형광 신호를 photobleach 다음 photobleaching 후 형광 회복을 기록 시간 경과 이미지를 가져가라. 마지막으로, 우리는 ImageJ와 Graphpad의 소프트웨어를 사용하여 영상 데이터를 분석하여, 쪽이에서 GFP의 모바일 및 고정되어 분수의 비율을 예상하고있다. 이 FRAP 프로토콜은뿐만 아니라 데이터를 분석하는 방법으로 기본 FRAP 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다.

FRAP는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 교양 세포에있는 단백질의 이동성을 계량하는 데 사용되었습니다. 우리는 photobleaching 후 형광 복구 비율을 분석하여 GFP의 모바일 / 고정되어 분수를 조사. 본 연구에서는, FRAP는 hippocampal 뉴런의 쪽이에서 수행되었다.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP은 GFP-태그 단백질의 이동성을 정량화하는 데 사용되어 왔습니다. 강한 여기 레이저를 사용하여 GFP-태그 단백질의 형광을 표백시키면...

이 절차의 전반적인 목표는 관심 영역에서 단백질의 FRAP을 측정하여 강화 녹색 형광 단백질의 이동성을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배양된 쥐 해마 뉴런에 EGFP 벡터를 형질전환합니다. 다음으로 Zeiss 710 공초점 현미경을 사용하여 관심 있는 스파인에서 FRAP 기록을 수행합니다.이후 Image J 및 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 광퇴색 속도를 계산할 수 있습니다. 최종적으로 공초점 현미경을 통해 배양된 해마 뉴런 돌기의 EGFP 이동성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 Chazen이 본인(Ronald Pet), Ya, Wang Bahar Kisha, 그리고 2009년 10월에 별세한 원저 논문의 교신저자 Robert Ol과 협력하여 개발하였습니다.우리는 이 영상을 고인의 기억에 바칩니다. 이 방법은 관심 영역 내 특정 단백질의 회전율(turnover rate)과 같이 단백질 역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 poly-D-lysine이 코팅된 mattec 35 millimeter 유리 바닥 디쉬에서 배아 18일차 쥐 해마 뉴런을 in vitro에서 16~18일 동안 배양함으로써 시작합니다. transfection을 시작하기 전에 clone tech Cal Foss mammalian transfection kit를 사용하여 뉴런을 transfection하십시오.나중에 사용하기 위해 원래의 배양 배지를 멸균된 15 milliliter 튜브에 보관하십시오. 형질전환 30분 전에 각 35 millimeter 디시에 1.5 milliliters의 DOL eco 수정 이글 배지(modified eagle medium)를 채웁니다. 다음으로, 10 micrograms의 P-E-G-F-P-N one 플라스미드 DNA를 12.4 microliters의 2 molar 칼슘 용액과 혼합하고 멸균수로 총 부피를 100 microliters로 맞춥니다.DNA 혼합물을 2x HEPES buffered saline 100 µL에 한 방울씩 천천히 첨가합니다. 한 방울을 넣을 때마다 버퍼를 볼텍싱합니다. 최종 혼합물을 실온에서 20분 동안 방치한 후, 버퍼 DNA 용액을 DMEM에서 배양 중인 뉴런에 첨가합니다.뉴런을 37°C에서 1시간에서 1시간 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 배양 접시에서 인산칼슘이 포함된 배지를 제거하고 DMEM으로 세포를 세척합니다. DMEM 세척 과정을 총 3회 반복합니다.인큐베이터로 되돌리기 전에 DMEM 배지를 원래의 배양 배지로 교체합니다. 형질전환 2~4일 후에 뉴런을 frack 실험에 사용합니다. 우선, 35 millimeter 글라스 바닥 디시의 배양 배지를 즉시 예열된 Tyro 용액으로 교체합니다.프랙(frack) 실험에는 Zeiss LSM 710 공초점 현미경이 사용됩니다. Zeiss 온도 모듈 시스템은 작업 시스템의 온도, 습도 및 이산화탄소 농도를 유지합니다. 이산화탄소 탱크가 연결되어 있는지, 그리고 습도 조절에 사용되는 물병에 물이 채워져 있는지 확인하십시오.현미경 설정이 완료되면, 100 x 대물렌즈를 사용하여 형질전환된 성숙한 수지상돌기를 찾습니다. 배양 접시 내의 형질전환된 세포 밀도가 낮을 경우, 40 x 대물렌즈로 원하는 세포를 찾은 후 100 x 대물렌즈로 전환하십시오.이미지를 캡처하려면 5배 광학 줌과 256 x 256 픽셀 해상도를 사용하십시오. 여러 개의 가시(spine)가 있는 짧은 수지상 돌기 조각을 촬영합니다. 이미지 캡처 시에는 0.5초가 소요되는 공칭 속도 9를 사용하십시오.스캔을 완료하려면 핀홀을 2 µm로 설정하여 강한 형광을 얻으십시오. 이미지를 획득할 때는 이미지 전체의 광퇴색을 방지하기 위해 레이저 투과율을 1~5% 정도로 낮게 설정하여 사용하십시오. 다음으로, 본 실험에 사용할 관심 영역의 척추를 선택하십시오.랩 실험(wrap experiment)을 수행하기 위해 가시 머리 직경이 약 1 µm인 버섯형 가시(mushroom spines)를 선택합니다. 표백 전 대조군 이미지를 5장 촬영한 후, 관심 대상인 가시를 공칭 100% 레이저 투과율로 10회 표백하고, 표백 직후 일련의 이미지들을 캡처합니다. 시간 간격은 타겟 단백질과 실험 설계에 따라 조정해야 합니다.본 실험에서는 탈색 후 15초 동안 매초 이미지를 캡처합니다. 그다음, 데이터 분석을 위해 이미지를 저장합니다. Image J 소프트웨어로 이미지를 열고, 관심 있는 척수가 움직이지 않고 동일한 위치에 유지되도록 align 도구를 사용하여 이미지 스택을 정렬합니다.이미지에서 형광 표백이 되지 않은 형질전환 영역인 관심 가시(spine)의 상대적 형광 강도를 측정합니다. Image J의 intensity versus time 모니터 도구를 사용하여 타임랩스 이미지의 배경 영역을 측정합니다. 형광이 없는 영역을 배경 영역으로 설정하고, GraphPad Prism 소프트웨어 또는 이와 유사한 소프트웨어를 사용하여 형광 강도를 1상 지수 방정식(one phase exponential equation)으로 곡선 적합(curve fit)합니다. 마지막으로, 표시된 형광의 이동성 분율(mobile fraction)과 비이동성 분율(immobile fraction)의 백분율을 계산합니다.배양된 해마 뉴런의 스파인에서 측정한 EGFP 형광의 FRAP 측정 결과입니다. 스파인 대조군 영역과 배경 영역이 표시되어 있으며, 빨간색 화살표는 광퇴색(photo bleaching) 시점을 나타냅니다. 동일 영역의 사진을 광퇴색 전과 광퇴색 후 0, 1, 5, 10, 15초 시점에 각각 촬영하였습니다.15초 동안의 EGFP 형광 FRA 곡선이 나타나 있으며, 곡선 상의 점들은 매 초의 FRA를 나타냅니다. 곡선은 1단계 지수 방정식으로 피팅되었습니다. 광퇴색 전의 평균 형광은 100%로 계산되었습니다. 본 실험에서 이동성 분율은 87%이고 비이동성 분율은 13%A입니다.이 영상을 시청하신 후에는 FRAPPE 기술을 사용하여 GFP 태그 단백질의 이동성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

fluorescence-recovery-after-photobleaching-frap-fluorescence-tagged

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서에서 우리는 photobleaching 후 다중 광자 형광 복구를 사용하여 확산 계수를 측정하기위한 절차를 설명합니다. 우리는 샘플에 대한 광학 경로를 따라 레이저를 정렬하고 적절한 실험 매개 변수를 결정함으로써 시작되며, 다음 발생을 계속하고 마지막으로 피팅 형광 복구 곡선.

Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정

우리는 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 배아 줄기 (ES) 세포에서 염색질 단백질 역학을 모니터 (플립) Photobleaching에서 형광 손실을 포함하여 photobleaching 방법을 설명합니다. 염색질 소성을 연구하는 방법 중 하나가 될 것으로 간주됩니다 염색질 단백질 역학은, pluripotent 세포 향상됩니다.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

많은 최근의 연구는 뇌 pathologies와 관련된 시냅스 단백질에 돌연변이가 확인되었습니다. 기본 교양 피질 뉴런이 돌기 척추의 형태와 운동성에서 이러한 질병 관련 단백질의 영향을 조사 큰 유연성을 제공합니다.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

우리는 photobleaching 실험 라이브 셀 후 형광 복구에 대 한 포괄적이 고 실용적인 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 aggresome 같은 유발된 구조에 노란색 형광 단백질 태그 p62의 이동성 측정 하는 데 사용 됩니다, 하지만 그것은 현미경 시스템 및 형광 단백질의 다양 한에 적용할 수 있습니다.

Aggresome 같은 유도 구조에서 Photobleaching의 황색 형광 단백질 태그 p62 후 형광 복구

배우세요 FRAP 기술을 이용하여 해마 뉴런 돌기에서 EGFP 단백질 이동성을 정량화하는 방법을. 공초점 현미경과 이미지 분석 소프트웨어를 활용하여 단백질 동역학을 연구할 수 있습니다.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

더 많은 동영상 탐색