Name: 배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 배우세요 배아 줄기 세포에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 FRAP 및 FLIP 광표백 기법을 활용한 방법입니다. 이 실시간 영상 기술은 살아있는 세포 내 단백질 이동성과 고정성 분율을 정량화하여 전통적 추출법으로는 얻을 수 없는 염색질 가소성에 대한 통찰을 제공합니다.

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우리는 중요한 의견과 매일 문제 해결 photobleaching 실험, 특히 Meshorer 연구실의 구성원, 샤이 Melcer, 안녕 Alajem, Edupuganti Raghu RAM, Badi 스리랑카 Sailaja, 애나 Mattout 및 알바 비란 감사드립니다. EM은 조셉 H. 및 벨 R. 브라운은 생명 과학의 수석 강사이며, 이스라엘 과학 재단 (ISF 943/09), 건강의 이스라엘 교육부 (6007) 유럽 연합 (IRG - 206872 및 238176)에 의해 지원됩니다 이스라엘 암 연구 재단, 히브리어 대학과 이스라엘 Psychobiology 연구소의 내부 Applicative 의료 기금.

1. ES 세포를 도금 T = 0 시간 MEF 도금 <ol><li> 문장 라이브 영상 μ - 슬라이드 8 자 (ibidi, 뮌헨, 독일) 젤라틴이나 chambered 커버 안경에서 (연구실 - 테크, 로체스터, NY) 또는 유리 바닥 문화 요리 (MatTek, 애쉬, MA). 50-30 분두고 무료 젤라틴 멀리 대기음. </li><li> 시드 22,000 MEFs / 잘 DMEM 250 μl 총 볼륨의 [10% 태아 소 혈청 (FBS)와 보충]. 세포 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C 5 % CO2)의 성장을 허용합니다. </li></ol> T는 = 6 시간 ES 세포 도금 <ol start="3"><li> 기음 DMEM. </li><li> 종자는 / 잘 ES 세포 미디어 250 μl 총 판매량 15,000 R1 세포와 잘 코팅 각 MEF은 [​​10% ESC 등급 태아 소 혈청 (FBS), 1 MM 나트륨 pyruvate, 0.1 MM 불필요한 아미노산, 0.1 MM의 β -와 보충 메르 캅 토 에탄올, 1000 U / ML 백혈병 억제 인자 (난생)], 다음날 30 % 50% 합류를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 2. ES 세포 Transfecting T는 = 24 시간 과도 transfection <ol><li> 250와 함께 μl / 잘 신선한 ES 세포 미디어의 ES 세포 미디어를 교체합니다. </li><li> 1.5 ML 멸균 시험관에서, 100 μl 혈청 무료 미디어 [Opti - 멤 (Gibco)] 후 바로 혈청을 무료로 미디어에 10 μl 대중 교통 - LT1 transfection 시약 (Mirus)을 추가를 추가합니다. 부드러운 pipetting으로 혼합하고 50-20 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 1.5 μg의 GFP 융합 플라스미드 DNA (H1e, H1o 또는 HP1) 희석을 통과 - LT1 시약을 추가합니다. 부드러운 pipetting으로 혼합하고 15-30 분 실온에서 알을 품다. </li><li> / 잘 transfection 혼합물의 13.5 μl를 추가합니다. 소용돌이는 μ - 슬라이드 8 - 음도 분산을 위해. 24 시간 신선한 ES 세포 미디어 250 μl로 이전 ES 세포 미디어를 교체 후. </li></ol> 3. FRAP 및 뒤집기 공연 T는 = 48-72 시간 <ol><li> 실험이 어떤 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에서 수행할 수 있지만 정상 FRAP / 플립 실험 이후, 많은 연속 이미지를 찾았습니다, 그것은 수집 속도를 수있는 회전 디스크 공촛점 현미경을 사용하는 것이 좋습니다 그리고 보장이란 말야 표백 바람직하지 않은 샘플의 초기 의도 표백 이벤트 다음 발생합니다. 여기, 우리는 요코 CSU - X 회전 디스크 헤드와 디스크 공촛점 시스템 (www.Andor.com)을 돌고있는 혁명를 사용하는 것이 좋습니다. 이 시스템은 포인트 스캐닝 시스템을 갖춘 전문 FRAPPA 모듈을 사용하여 photobleach 수있는 듀얼 용량을 가지고 있으며, 빠르게 회전하는 디스크를 사용하여 이미지를 수집하기 위해 빛을 다시 전환할 수 있습니다. 실험을 photobleaching에 사용되는 가장 일반적인 세​​ fluorescing 단백질은 GFP, YFP 체리입니다. GFP 또는 YFP를 사용하는 경우, ~ 488 nm의 레이저가 필요합니다. 체리 들어, ~ 560 nm의 레이저를 사용합니다. 모든 경우에, 우리는 고체 레이저를 사용하는 것이 좋습니다. 자동 무대를 갖는 것은 유용하지만, 필요하지 않습니다. 라이브 세포가 몇 군데 있기 때문에, 그것 (우리가 LIS에서 하나를 사용하여, 스위스) 환경 챔버를 사용하는 데 필수적이며, 제어 산소, ​​습도, CO 2 및 온도. FRAP는 영상이 필요한 최소한의 레이저 전원 (일반적으로 형광 수준이 적합 10 % 지역에)로 이루어집니다 동안 최대의 레이저 강도를 사용하여 수행됩니다. 적절한 파장의 형광으로 세포를 관찰하고 60X 기름 침지 렌즈를 사용하여 GFP를 표현하는 셀을 선택합니다. 올바른 subcellular 분포를 확인하십시오. 때때로 표현 수준이 너무 높은 경우, 단백질의 지방화는 nucleolus 다른 구획에 '유출'수 있습니다. 이러한 세포가 선택되지 않습니다. </li><li> 지금 이미징 프로토콜을 설정 euchromatin 또는 heterochromatin (응축 GFP foci로 볼)에 다음 photobleaching 전에 photobleach 3-5 프레임을 수집하고 MS 250-1000 간격으로 photobleach 후 90-120 프레임을 수집 H1e - GFP, 1000 MS, H1o 및 HP1 - GFP, 250 MS (간격 시간 변경이 매우 역동적인 단백질은 짧은 간격 시간을 필요로하는 단백질 역학에 따라). 우리는 일반적으로 20-40 μseconds (1-2 반복)의 레이저 펄스와 photobleaching에 대한 80~100% 레이저 강도를 사용하지만,이 숫자는 분석 단백질과 표현 수준에 따라 변경할 수 있습니다. photobleaching 적절한 때, 당신은 GFP의 형광의 "블랙홀"을 준수해야합니다. 블랙홀은 점차 형광 다음과 같은 복구와 함께 다시 채워집니다. 회전 디스크가 초당 60 주변 이미지 (하나의 휴대폰으로 확대하면 좋은 형광 강도와)까지 얻을 수 있지만, 우리는 낮은 이미지 품질과 잠재력을 증가 phototoxicity로 인해 이러한 높은 속도로 시스템을 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 플립 실험, 다른 영상 프로토콜을 설정 : 이미지를 수집하는 동안 같은 자리에서 표백 반복 시작 후, 표백하기 전에 3-5 프레임을 수집합니다. H1o - GFP, 표백을 위해 H1e - GFP, 표백제 매 5 초마다 2 초, 그리고 HP1 - GFP 표백마다 1 초하십시오. 블리치D 전체 실험에​​ 걸쳐 반복적으로 이미지를 수집합니다. </li><li> 두 기법, 20-30 세포의 과정을 반복합니다. 통계 목적, 선호 다른 일에 실험을 3 회 이상 반복합니다. 동질적인 인구와 올바른 설정, 표준 편차는 (&lt;5 %) 일반적으로 낮습니다. FRAP 및 뒤집기 모두 들어, 표백 영역의 크기와 모양은 복구 역학에 영향을 미칩니다 및 실험 시간 상수 있어야합니다. 또한, 두 세포와 비교하는 경우, 동일한 프로토콜을 사용해야하며 전지는 전력 레이저 및 기타 조건이 변동될 수 있으며 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 당일에 순차적으로 분석해야합니다. </li></ol> 4. FRAP 및 뒤집기 데이터 분석 <ol><li> 모든 FRAP 프레임이 수집에서는,의 형광 강도를 측정하는 ROI (투자 수익 (ROI) B = 표백 지역), 배경 영역 (ROI BG), 그리고 전에 시간의 함수로하고 표백 후 비 표백 핵 영역 (ROI NB). 표백 영역이 무시할 때 전체 핵이 정상화 목적으로 선택할 수 있습니다. </li><li> / (ROI NB - 투자 수익 (ROI) BG) - (ROI BG 투자 수익 (ROI) B) / (pbROI B - pbROI BG) / (pbROI NB - pbROI BG), PB 사전 표백 나타냅니다 : 매주 시점 들어, 수식에 따라 데이터를 정상화. 사전 표백 이미지 당신은 약 1의 값을 얻을 것입니다. 표백제 후 첫 번째 이미지는 블리치 깊이를 나타냅니다. 실제 블리치 깊이 값을 1에서 값을 뺍니다. 모든 세포와 각 실험에서 평균 20-30 전지 반복합니다. </li><li> 수집된 모든 플립 프레임에서 (ROI NB = 비 표백 지역, 투자 수익 (ROI) BG = 배경) 이외의 표백 핵 영역에서 형광 강도, 그리고 배경 영역을 측정합니다. 플립 데이터의 계산은 FRAP 곡선과 유사합니다, 오직 분석 ROI (투자 수익 (ROI) NB)는 계산에 사용되지 않은 실제 표백 지역 다를되어야합니다 (ROI NB - 투자 수익 (ROI) BG) / (pbROI NB - pbROI BG) . 그것은 정규화의 목적 이웃 셀 (ROI N = 이웃 세포)를 사용하는 것도 가능합니다 : (ROI NB - 투자 수익 (ROI) BG) / (ROI N - 투자 수익 (ROI) BG) / (pbROI NB - pbROI BG) / (pbROI N - pbROI BG ). 데이터 수집에 따라, 그것은 컴퓨터 시뮬레이션으로 실험 데이터를 맞게 수 있습니다. 이것은 좋은 근접, 모바일 분수, 고정되어 분수와 반 최대와 계산할 수 있습니다. 우리는 여기서 FRAP 분석의 수학 및 통계 측면을 토론하고 다른 훌륭한 출판물 4-9로 독자를 참조하지 않습니다. 표백 깊이는 사전 표백제 (100 %) 신호 및 표백 후 첫 이미지 사이의 거리 (Y - 축)에를 말합니다, 모바일 분율은 표백제 깊이와 사이의 거리 (Y - 축)에를 말합니다 복구 신호를 반응 속도론은 고원을 도달하고, 고정되어 분수가 회복 신호와 사전 표백제 (100 %) 신호 사이의 거리 (Y 축)에 (인물 1B와 2B 참조)을 말합 때. 이 분석 외에도, 데이터에 맞는 좋은 수학적 모델이 있습니다. 단일 지수, 방정식에 대한  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="방정식" width="80" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식"> t 시간이 어디에 있는지, A는 1 - A는 모바일 분수입니다 고정되어 분수이며, K는 해제 상수 분리이며, 데이터에 맞게 사용할 수 있으며, 바인딩의에서 속도의 직접적인 추정 (K 해제)는 수 뿐만 아니라 협회 속도를 계산하는 데 사용할 수있는 매개 변수에 대해, 취득. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. A와 HP1 (왼쪽), H1o (가운데)과 R1 ES 세포에서 H1e (오른쪽)의 B 쇼 대표 FRAP 곡선. 단순하고 명확 그림에 대한 1A는 정상화하고 계산 전에 단세포의 원시 데이터를 보여줍니다. 노란색 곡선은 표백 지역에 해당하는, 보라색 커브가 아닌 표백 핵 영역 (표백 영역이 무시할 때 전체 핵이 정상화의 목적으로 선택할 수 있습니다)에 해당하고, 빨간색 라인은 배경 형광에 해당 이 경우 최소한. 수직 화살표는 표백제 시간을 나타냅니다. 정규와 평균 데이터는 그림 1B에 표시됩니다. HP1 (적색)와 비교 H1 (파란색)의 느린 복구를합니다. 또한 H1e 변종 (진한 파란색)은 H1o 변종 (하늘색)보다 느립니다. 모바일 및 고정되어 분수와 블리치 깊이가 HP1에 대해 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 2. A와 B를 비교 euchromatin 쇼 대표 FRAP 곡선 (그림R1의 ES 세포의 HP1의 heterochromatin (오른쪽)와 함께) 떠났다. 마찬가지로 1 그림, 그림 2A는 단일 세포의 원시 데이터를 보여줍니다, 노란색 곡선은 표백 지역에 해당하는, 보라색 커브가 아닌 표백 핵 영역에 해당하고, 빨간색 선은 배경 형광에 해당합니다. 수직 화살표는 표백제 시간을 나타냅니다. 정규와 평균 데이터는 그림 2B에 표시됩니다. euchromatin (조명 적색)와 비교 heterochromatin (어두운 빨강)의 느린 복구를합니다. 모바일 및 고정되어 분수와 블리치 깊이는 euchromatin에 대해 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3.. H1o R1 ES 세포의 전형적인 플립 실험은 그림 3A (원료, 취소 정규화된 데이터)와 B (정규 및 평균 데이터)에 표시됩니다. 본 실험에서는 자주색 곡선이 아닌 표백 핵 영역에 해당하는, 녹색 라인은 이웃 세포 핵에 해당하며 빨간색 선은 배경 형광에 해당합니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포 집단 또는 고정 세포, FRAP 실험에서 정화 염색질을 포함 대부분의 사용 가능한 기술과 달리 살아있는 세포에서 염색질 단백질 역학의 변화를 따릅니다. 우리는 염색질 단백질 역학 염색질 소성 좋은 지표가된다는 것을 발견. 그러나, 그것이 융합에게 GFP와 관심의 유전자를 필요로하기 때문에, 형광 태그의 추가는 단백질의 기능을 방해할 수 있습니다. 따라서, 사전 FRAP 진행하는 융합 단백질이 엄격하게 그것의 네이티브 대응과 같은 속성과 기능을 보장하기 위해 테스트해야합니다. 골드 표준 녹아웃 셀 라인에서 GFP - 융합과 내생 단백질의 기능을 보완하는 것입니다. 그러나, 녹아웃 셀 라인은 항상 사용할 수 없습니다 많은 경우에 단백질의 부재는 분명 표현형이 없습니다. 그럼에도 불구하고, 하나는 적절한 부분 교환을 보장하기 위해 내생 단백질에 비해 모든 융합 단백질의 subcellular 배포, 자사의 표현 수준의 바인딩 파트너를 테스트할 수 있습니다. 일단 확인, GFP ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 머크 </td><td> 1.04078 </td></tr><tr><td> Opti - 멤 </td><td> Gibco </td><td> 31,985 </td></tr><tr><td> 대중 교통 - LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> μ - 슬라이드 8 - 잘 </td><td> ibidi </td><td> 80,826 </td></tr></tbody></table>

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 assays (frap 및 플립)를 photobleaching

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 Photobleaching에서 형광 손실 (플립)는 좋은 공간과 시간적 해상도를 가진 살아있는 세포의 단백질 역학 연구를 활성화합니다. 여기 FRAP 및 마우스 배아 줄기 (ES) 세포에 H1과 HP1 포함 염색질 단백질의 플립 assays을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. FRAP 실험에서 세포는 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 그에 파생 상품 (YFP, CFP, 체리 등) 융합 관심의 단백질과 중 transiently 또는 안정, transfected 있습니다. transfected, fluorescing 세포에서 강렬한 초점 레이저 빔을 관심의 비교적 작은 영역 (ROI)을 표백제. 레이저 파장은 융합에 사용되는 형광 단백질에 따라 선택됩니다. 레이저 빛이 irreversibly 투자 수익 (ROI)에있는 분자의 형광 신호를 표백제와 즉시 표백 다음, 표백 영역에서 형광 신호의 복구 - 표백하지 않은 분자와 표백 분자의 교체에 의해 중재가 - 시간 저속 이미징을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 생성된 형광 복구 곡선은 단백질의 이동성에 대한 정보를 제공합니다. 형광 분자가 고정되어있다면, 어떤 형광 복구 관찰되지 않습니다. 보완적인 접근에서, Photobleaching에서 형광 손실 (플립)은 레이저 빔을 반복 같은 자리를 표백제와 신호 강도가 다른 fluorescing 세포 단위로 측정됩니다. 뒤집기 실험 따라서 오히려 형광 복구보다 신호 부패를 측정하고 세포 구획 사이 였죠 단백질의 이동성뿐만 아니라 단백질을 확인하는 데 유용합니다. 과도 바인딩은 염색질 결합 단백질의 일반적인 속성입니다. 각 염색질 단백질의 주요 분율이 일정한 상태에서 특정 순간에 염색질에 바인딩되어 있지만, 바인딩은 일시적이며 대부분의 염색질 단백질 초의 순서에 체류 시간, 염색질에 대한 높은 매출 있습니다. 이러한 속성은 게놈의 표현 1 높은 소성을 생성하기위한 열쇠입니다. 염색질 단백질 (heterochromatin 단백질 1 (HP1), 링커 히스톤 H1 및 핵심 histones 포함)의 동적 교환이 높습니다 어디 Photobleaching 실험 따라서 특히 ES 세포에서 염색질 구조 단백질 GFP - 퓨전 버전을 사용 염색질 소성을, 결정하기 위해 특히 유용합니다 2,3 차별화된 세포보다.

우리는 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 배아 줄기 (ES) 세포에서 염색질 단백질 역학을 모니터 (플립) Photobleaching에서 형광 손실을 포함하여 photobleaching 방법을 설명합니다. 염색질 소성을 연구하는 방법 중 하나가 될 것으로 간주됩니다 염색질 단백질 역학은, pluripotent 세포 향상됩니다.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

광탈색 후 형광 회복(Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) 및 광탈색 유도 형광 소실(Fluorescence Loss In Photobleaching, FLIP) 기술을 통해 살아있는 세포 내 단백질 역학을 ...과 함께 연구할 수 있습니다.

다음 실험의 전체적인 목표는 배아줄기세포 내의 염색질 단백질 역학을 관찰하는 것입니다. 이는 GFP 융합 플라스미드 DNA를 eESL에 형질전환하여 형질전환된 세포 내에서 형광 표지된 염색질 단백질을 발현시킴으로써 수행되며, 회복 또는 손실을 측정하기 위해 FRAP 또는 FLIP을 실시합니다. 광퇴색 후 단백질의 역동적인 거동을 관찰하여 가동성 및 비가동성 단백질 분율을 결정합니다.FRAP 및 FLIP 분석을 바탕으로 염색질 단백질 동역학의 차이를 보여주는 결과가 도출되었습니다. Salsa 세제를 사용하여 염색질 단백질을 추출하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단일 살아있는 세포에 적용 가능하다는 점입니다. 따라서 염색질과 염색질 단백질 사이의 결합을 실시간으로 관찰할 수 있으며, 주어진 집단 내의 이질성을 결정할 수 있습니다.멸균 기술을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포 또는 meth 세포를 플레이팅하는 것으로 시작합니다. 배양 후드 내에서 젤라틴으로 코팅된 라이브 이미징 8-웰 마이크로 슬라이드를 준비합니다. 실온에서 5~30분 동안 젤라틴 코팅이 고정되도록 둔 다음, 남은 젤라틴을 흡입하여 제거합니다.이제 코팅된 각 웰에 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM 배지 내의 meth 세포 22,000개를 분주합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 6시간 동안 세포를 배양합니다. DMEM 배지를 흡입하여 제거한 후, 첨가제가 포함된 ES 배지 내의 R one 배아줄기세포 15,000개를 각 meth 코팅 웰에 분주합니다.조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하여 세포의 밀도가 50% 정도가 되도록 합니다. 다음 날, 세포의 밀도는 30%에서 50% 사이가 되어야 합니다. 먼저 기존의 ES 배지를 250 µL의 신선한 ES 배지로 교체합니다. 그다음, 1.5 mL 멸균 시험관에 무혈청 배지 100 µL와 Transit 10 µL를 순서대로 넣어 transfection 혼합물을 준비합니다.LT transfection 시약을 1분량 준비합니다. 튜브를 조심스럽게 파이펫팅하여 섞고 실온에서 5~20분 동안 배양합니다. 5~20분 후, 1.5 µg의 GFP 융합 플라스미드 DNA를 첨가하고 조심스럽게 파이펫팅하여 섞습니다.그 후 실온에서 15분에서 30분 동안 더 배양합니다. 트랜스펙션 혼합물이 준비되면, 각 웰에 13.5 µL씩 첨가하고 마이크로 슬라이드를 가볍게 흔들

photobleaching-assays-frap-flip-to-measure-chromatin-protein-dynamics

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

FRAP는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 교양 세포에있는 단백질의 이동성을 계량하는 데 사용되었습니다. 우리는 photobleaching 후 형광 복구 비율을 분석하여 GFP의 모바일 / 고정되어 분수를 조사. 본 연구에서는, FRAP는 hippocampal 뉴런의 쪽이에서 수행되었다.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

RNA 효소 II transcriptional 운동은 살아있는 세포에서 특정 유전자를 측정합니다. 관심의 유전자에서 베꼈는데 mRNAs는 찬란 태그와 (FRAP) transcriptional 신장의 생체내 반응 속도론에있는가를 얻을 수있다 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하고 있습니다.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

우리는 여기에서 pH 에 민감한 녹색 형광 단백질 변이체, pHluorin의 사용을 설명, 축 슨 유도 수용체의 스파티오-측두동역학을 연구 하는 세포 표면에 인신 매매. pHluorin 태그 수용체는 병아리 배아의 전기 기공을 사용하여 세포 배양 및 생체 내에서모두 표현된다.

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

우리는 메추라기 배아 모델 시스템에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현을 허용하는 방법으로 메신저 RNA (mRNA) 전기 를 보고합니다. 이 방법은 형광성 으로 세포를 표지하고 전기 개공 직후 시간 경과 현미경 검사법에 의해 생체 내 움직임을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

배우세요 배아 줄기 세포에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 FRAP 및 FLIP 광표백 기법을 활용한 방법입니다. 이 실시간 영상 기술은 살아있는 세포 내 단백질 이동성과 고정성 분율을 정량화하여 전통적 추출법으로는 얻을 수 없는 염색질 가소성에 대한 통찰을 제공합니다.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

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