Name: Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Impara la vibrodissociazione di neuroni da fettine di cervello di roditore per studiare la trasmissione sinaptica. Questa tecnica consente il controllo farmacologico e la registrazione patch-clamp con imaging in tempo reale dei terminali presinaptici.

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Vorremmo riconoscere Drs. Ping Zhu e Susumu Koyama per la loro assistenza durante la configurazione iniziale della tecnica, e il Dr. Veronica Alvarez per l&#39;assistenza nella formattazione del manoscritto. Questo studio è stato finanziato dalla Divisione di Intramurale Ricerca Clinica e Biomedica del NIAAA.

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vibrodissociation di successo richiede che le fette contengono neuroni sani e che gli spazi interstiziali sono sufficientemente flessibili da consentire neuroni per uscire dalla fetta senza danni tossici. Così, la tecnica funziona in modo ottimale alle prime età post-natale (P1-21), quando fette sano può essere fatto con materiali meno gliali / interstiatial che si trova a fette cervello adulto. Nella nostra esperienza, tuttavia, ottimizzando la preparazione fetta per la sopravvivenza neuronale nella fetta stesso può essere controproducente per la tecnica vibrodissociation. Mentre noi abitualmente preparare fette di registrazione in situ utilizzando freddo aCSF modificata, in cui saccarosio è stato sostituito per gran parte della Na + extracellulare e Ca 2 +, fette preparato per vibrodissociation possono essere preparati (per esempio taglio) nel nostro aCSF registrazione normale. Nel preparare fette per la registrazione da singoli neuroni nelle stesse fette abbiamo anche posto le fette in aCSF normale a 35 ° C subito dopo il sezionamento e lasciarli per 30-60 minuti a questa temperatura prima di tornare a temperatura ambiente. Tuttavia, fette preparato per vibrodissociation vengono spostati immediatamente a temperatura ambiente subito dopo taglio. Queste procedure forniscono un rendimento più elevato di neuroni sani dopo vibrodissociation, forse a causa della mancanza del tessuto interstiziale ditta che permette ai neuroni di essere più facilmente scosso allentato dalla stessa fetta. Non abbiamo modo esaustivo esame delle condizioni di preparazione fetta, come di routine ottenere neuroni sufficienti per la nostra registrazione ed esperimenti di imaging in un dato giorno. E &#39;possibile che ulteriori modifiche, come i cambiamenti nello spessore fetta o procedure preincubaton, potrebbe essere fatto per aumentare la produzione di neuroni sani. Trattamenti proteasi molto mite sono state provate in uno sforzo per aumentare la resa delle cellule e ottenere la tecnica di lavorare in animali anziani. Tuttavia, immancabilmente anche il trattamento della proteasi mite sembra disturbare la funzione sinapsi. Così, mentre la combinazione di proteasi e di dissociazione meccanica possono ancora essere trovati al lavoro non si è dimostrato affidabile in neuroni proencefalo fino ad oggi. Va inoltre notato il rendimento relativamente basso di neuroni sani dopo vibrodissociation significa che la tecnica è soprattutto utile per lo studio abbondante sottotipi neuronali, soprattutto i neuroni di proiezione. La disponibilità di GFP-esprimere i topi in cui le piccole sottopopolazioni neuronali possono essere facilmente identificate aumenta la possibilità di studiare questi neuroni più rari. Tuttavia, a meno resa neuronale può essere migliorata notevolmente l&#39;accumulo di dati su questi neuroni è probabile che sia relativamente lento. Varie fasi hanno dimostrato di essere decisivo per il caricamento di successo di neuroni con il calcio-sensing coloranti. L&#39;esposizione a AM-esterificati tintura viene eseguita a 37 ° C, e abbiamo avuto successo nel tentativo di tintura di carico a basse temperature. La concentrazione dei coloranti devono essere ottimizzati in termini di tempo di carico e la temperatura in quanto sembra che più alta concentrazione di colorante di caricamento abbassa la concentrazione di calcio nel boutons presinaptico. Abbiamo osservato che a concentrazioni più elevate di carico diminuisce la frequenza e l&#39;ampiezza delle sIPSCs. Quando si carica sensibile al calcio, coloranti in terminali presinaptici di neuroni vibrodissociated, bisogna fare attenzione perché la capacità tampone del boutons piccolo presinaptico può essere diverso nel soma e le dimensioni dei boutons non sono coerenti. Neuron contenenti i piatti vengono lavati con HEPES-buffered soluzione esterna seguente colorante di caricamento e il tempo di recupero dopo il lavaggio è cruciale. Inoltre, per fare una buona tenuta per tutta la registrazione da cellula, le cellule devono essere accuratamente lavati per sbarazzarsi di molecole di colorante non interiorizzato dalla membrana cellulare esterna. Oltre a utilizzare i neuroni vibrodissociated per l&#39;imaging cellulare elettrofisiologia e di vivere, tecniche immunocitochimiche può essere applicato anche a queste cellule 11,12. Le celle possono essere facilmente fissate e colorate con una varietà di anticorpi, e marcatori cellulari di altri. L&#39;utilizzo di queste cellule fornisce una preparazione pulita per la visualizzazione di espressione della proteina in GABAergico terminali presinaptici. Utilizzando topi che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto il controllo di promotori specifici per i neuroni GABAergici consente al ricercatore di identificare i singoli terminali sinaptici nella preparazione vibrodissociated (Figura 1). Marcatori fluorescenti immagini di questo tipo può consentire misurazioni morfologiche nei terminali utilizzando laser a base di microscopia e più recenti tecniche come STED (Emission Microscopy stimolazione Depletion). Visualizzazione con coloranti che riportano ciclismo delle vescicole sinaptiche è possibile anche con questa preparazione. Akaike e collaboratori hanno etichettato terminali GABAergici con il colorante styryl, FM1-43 per visualizzare i terminali nelle cellule viventi 4. Dovrebbe anche essere possibile effettuare cella singola transcriptasi inversa PCR per profilo di espressione di RNA in vibrodissociatedneuroni. Questa tecnica è utilizzata abitualmente per enzimaticamente dissociati neuroni e neuroni cresciuti in coltura cellulare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Voce </td><td> Azienda </td><td> Catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Vibrante Slicer Tissue </td><td> Leica Microsystems Inc. </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Cellule Dish Cultura (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Fondo di Vetro Piatti </td><td> Willco-piatto </td><td> GWSB-5040 Oppure GWSB-3522 </td><td> 0,16-0,19 vetro mm di spessore per l&#39;imaging </td></tr><tr><td> Manipolatore piezoelettrico </td><td> EXFO-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Potrebbe anche usare relè, ecc </td></tr><tr><td> SD9 Piazza impulsi dello stimolatore </td><td> Grass Technologies </td><td> SD9K </td><td> Per l&#39;attivazione manipolatore piezoelettrico </td></tr><tr><td> Dissezione stereoscopio </td><td> Selvatico Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> Anche usare un&#39;altra stereoscopio </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipetta estrattore </td><td> Sutter strumento </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Sottile parete di vetro Capillari </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> TW-150F-4 </td><td> Per la fiamma micropipetta di vetro sigillato e patch micropipetta </td></tr><tr><td> Sei Canale perfusione Valve Control Systems </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 o VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusione Fast-Passo </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertito con obiettivi 20-63x </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Camera </td><td> ANDOR Tecnologia </td><td> ixon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Eccitare fluorescenza illuminazione Light Source </td><td> EXFO Photonics Solutions Inc. </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM indicatore di calcio </td><td> Molecular Probes </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e immagine terminali presinaptici

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Meccanica dissociazione dei neuroni del sistema nervoso centrale ha il vantaggio che boutons presinaptica rimangono attaccati al neurone isolato di interesse. Questo consente per l&#39;esame della trasmissione sinaptica in condizioni in cui gli ambienti extracellulare ed intracellulare postsinaptici possono essere ben controllate. Una vibrazione a base di tecnica senza l&#39;uso di proteasi, noto come vibrodissociation, è la tecnica più diffusa per l&#39;isolamento meccanico. Una micropipetta, con la punta fuoco lucidato alla forma di una pallina, viene inserito in una fetta del cervello fatto da un P1-P21 roditori. La micropipetta è vibrato parallela alla superficie fetta e abbassare lo spessore della fetta con conseguente liberazione di neuroni isolati. I neuroni isolati sono pronti per lo studio in pochi minuti di vibrodissociation. Questa tecnica ha dei vantaggi rispetto all&#39;uso di colture primarie neuronali, fettine di cervello e neuroni isolati enzimaticamente tra cui: la produzione rapida di vitale, neuroni relativamente matura adatto per studi elettrofisiologici e di imaging, controllo superiore dell&#39;ambiente extracellulare libero dall&#39;influenza delle cellule vicine; idoneità per esperimenti farmacologici ben controllati con l&#39;applicazione rapida di droga e superfusione cellulare totale e migliorato lo spazio-clamp nelle registrazioni relativi ai neuroni in fetta o preparati colture cellulari a cellula intera. Questa preparazione può essere utilizzato per esaminare sinaptica fisiologia, farmacologia, la modulazione e la plasticità. Imaging in tempo reale di entrambi gli elementi pre-e post-sinaptici nelle cellule viventi e boutons è possibile anche utilizzando i neuroni vibrodissociated. Caratterizzazione dei costituenti molecolari degli elementi pre-e post-sinaptici può essere ottenuta anche con approcci immunologici e di imaging-based.

Questa relazione dimostra una tecnica per isolamento meccanico di singoli neuroni vitali mantenendo attaccato boutons presinaptica. Vibrodissociated neuroni hanno il vantaggio di una produzione rapida, eccellente controllo farmacologico e migliorato lo spazio-clamp senza influenza dalle cellule vicine. Questo metodo può essere utilizzato per l&#39;imaging di elementi sinaptica e di patch-clamp registrazione.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

La dissociazione meccanica dei neuroni dal sistema nervoso centrale presenta il vantaggio che i bottoni presinaptici rimangono attaccati al neurone isolato di...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare neuroni che conservano bauli sinaptici staccati ma ancora adesi, consentendo un controllo farmacologico e un miglioramento del space clamp, eliminando al contempo l'influenza delle cellule vicine. Questo risultato si ottiene preparando sezioni cerebrali acute da ratti o topi dal giorno postnatale P1 a P21, contenenti l'area cerebrale di interesse, per isolare successivamente singoli neuroni. Le sezioni acute vengono posizionate in una piastra e una micropipetta di vetro sigillata a fiamma viene fatta vibrare all'interno dell'area di interesse, muovendo la punta attraverso la sezione, il che libera neuroni singoli.Si lascia ai neuroni il tempo di attaccarsi al fondo della piastra. Successivamente, la piastra contenente i neuroni dissociati dai fibroblasti viene trasferita su un microscopio per esaminare la fisiologia sinaptica, la farmacologia, la modulazione, la plasticità, nonché l'immagine in tempo reale e la caratterizzazione degli elementi pre- e post-sinaptici nella cellula vivente; i risultati ottenuti mostrano le caratteristiche fisiologiche e farmacologiche delle risposte sinaptiche e i cambiamenti associati nella funzione del terminale presinaptico, grazie a registrazioni in modalità whole cell con sigillo stretto e microscopia a fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le registrazioni da fette cerebrali, da neuroni in coltura o da neuroni dissociati enzimaticamente, è che il robusto attacco sinaptico consente il controllo e la visualizzazione degli elementi presinaptici, mentre la struttura postsinaptica relativamente compatta permette un miglior clampaggio del voltaggio e un controllo eccezionale dell'ambiente extracellulare.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché il rendimento in neurociti sani può variare notevolmente a seconda di diverse condizioni, come l'età dell'animale, i parametri di vibrazione e l'area di interesse nella sezione. Inoltre, le registrazioni cellulari hanno una durata inferiore rispetto a quelle effettuate su vetrini convenzionali. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi di dissociazione mediante VI sono difficili da apprendere, essendo complesso descrivere con precisione la distanza di movimento e la penetrazione all'interno della sezione. Per prepararsi al taglio delle sezioni cerebrali, preparare un liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) saturo con carbogeno per 15 minuti.Successivamente, aggiungere cloruro di calcio a due millimolari e cloruro di magnesio a un millimolare. Dopo aver anestetizzato e decapitato un animale di et&agrave; postnatale P1-P21, rimuovere il cervello, quindi tagliarlo nell'orientamento desiderato in modo da includere la regione di interesse. Fissare il cervello dissezionato su una piastra e immergerlo in una camera riempita con liquido CSF.Quindi montare la camera su un taglia-cervelli e sezionare il cervello in fette spesse da 250 a 400 micrometri ciascuna, utilizzando una lama vibrante. Posizionare le fette in un liquido CSF e saturarlo con carbogeno in una camera di pre-incubazione per almeno un'ora. Per preparare una micropipetta di vetro sigillata a fiamma, innanzitutto tirare una micropipetta standard per patch clamp con diametro della punta di due micrometri su un micropipettatore di tipo flaming brown o equivalente.Posizionare la punta della pipetta microlitrica nella fiamma di un becco Bunsen per circa due secondi, in modo da formare una sfera fusa con un diametro compreso tra 200 e 300 micrometri. Successivamente, posizionare la pipetta sigillata a fiamma su un supporto del micromanipolatore, che possa essere rapidamente vibrato lateralmente con un'escursione compresa tra 100 e 200 micrometri, utilizzando un relè bimorfo piezoelettrico o un dispositivo equivalentemente efficace. Preparare una soluzione salina tamponata in abbondanza.Regolare la soluzione con idrossido di sodio a pH 7,4 e l'osmolarità con saccarosio a circa 300 milliosmoli. Quindi riempire una piastra per colture di 35 millimetri di diametro con abbondante soluzione salina tamponata. Posizionare una sezione nella piastra per colture e visualizzarla mediante un microscopio stereoscopico da dissezione a 250 x di ingrandimento utilizzando un filo piegato.Tenere la sezione sul fondo della piastra per dissociare le cellule. Posizionare la punta della micropipetta sigillata a fiamma sulla superficie della sezione. Attivare il micromanipolatore in modo che la punta vibri lateralmente da 10 a 30 hertz con una distanza di escursione di circa 100 micrometri.Abbassare la punta della micropipetta nella sezione con il micromanipolatore in modo che attraversi l'intera profondità entro 30 secondi. Ripetere questo passaggio secondo necessità per massimizzare il numero di neuroni isolati. Successivamente, rimuovere la punta dalla sezione.Prendere la sezione con la pinzetta e agitarla delicatamente nella soluzione. Successivamente, rimuovere completamente la sezione dalla soluzione. Lasciare che le cellule si depositino sul fondo della piastra per almeno 10 minuti.Posizionare la piastra contenente i neuroni sul portacampioni di un microscopio invertito e visualizzarli con un obiettivo da 1x a 63x. Cercare neuroni con membrane lisce, prive di blebbing, e con nuclei visibili ma non eccessivamente grandi. Se si utilizza l'ottica a contrasto di fase, cercare neuroni con aspetto chiaro al contrasto di fase e una leggera tinta giallastra, ma non troppo blu.Utilizzare un micropipettatore a trazione con fiamma (ad esempio, un flaming brown o strumento equivalente) per preparare una micropipetta standard per patch; la resistenza della punta della pipetta deve essere compresa tra due e quattro megaohm. Riempire la micropipetta per patch con una soluzione intracellulare a base di cloruro di cesio per la misurazione delle risposte sinaptiche oppure con una soluzione intracellulare a base di cloruro di potassio per la misurazione delle proprietà intrinseche della membrana e dei potenziali d'azione. Eseguire la tecnica del patch-clamp in configurazione whole cell sul neurone utilizzando tecniche elettrofisiologiche standard.Registrare innanzitutto le correnti postsinaptiche spontanee utilizzando un protocollo di acquisizione dati senza interruzioni. Successivamente, applicare 200 nan di animale o tetrodotossina e/o una soluzione extracellulare a basso contenuto di calcio per registrare le correnti postsinaptiche miniature e modificare il contenuto molecolare extracellulare. I farmaci di interesse vengono caricati singolarmente in uno dei canali di un tubo di vetro quadrato fuso con punta, posizionato vicino al neurone di interesse.Un singolo barile viene esposto al neurone mediante un micromanipolatore azionato da un motore passo-passo che si muove lateralmente per consentire lo scambio della soluzione in 10-100 millisecondi. Osservare i bns scaricati ad alta magnificazione con un obiettivo ad alta apertura numerica in un microscopio basato su videocamera o a fotoni multipli. Qui viene mostrata l'immagine di un neurone e dei bns acquisita con una videocamera a accoppiamento di carica a moltiplicazione elettronica.La potenza della sorgente luminosa per l'eccitazione è stata attenuata al 1,2% mediante un filtro neutro di densità 1,0 e un filtro a diaframma regolato al 12% dell'uscita durante le registrazioni in voltage clamp. Utilizzando una soluzione intracellulare a base di cloruro di cesio, si osservano correnti sinaptiche spontanee per visualizzare la fusione delle vescicole. Nei battoni presinaptici, abbiamo utilizzato topi che esprimono il costrutto sinaptico florina sotto il controllo del promotore TH1.Il florina sinaptica è una costruzione molecolare in cui la florina eclittica, un mutante della GFP con sensibilità al pH potenziata, è collegata alla proteina della membrana associata alle vescicole in seguito alla fusione vescicolare. Questo motivo viene esposto all'ambiente extracellulare più neutro, con conseguente aumento della fluorescenza in punti corrispondenti a vescicole e terminali presinaptici. La dissociazione in fibroblasti di neuroni ippocampali da questi topi consente la visualizzazione di punti fluorescenti di dimensioni e localizzazione attese per terminali GABAergici durante il tentativo di questa procedura.È importante ricordare che, per ottenere neuroni sani, è necessario assicurarsi di avere sezioni sane. Pertanto, la preparazione di sezioni cerebrali acute rappresenta una fase fondamentale di questa procedura. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'immunohistochimica o la RT-PCR su singola cellula, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali proteine e specie di mRNA sono espresse nei bottoni sinaptici o nei neuroni postsinaptici.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere neuroni isolati sani e utilizzarli per l'elettrofisiologia e l'immagine in tempo reale.

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Dimostriamo l'uso della pistola gene di introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni in fettine di cervello di roditori e primati non umani di età diverse. In questo caso particolare, noi usiamo topi adulti (3-6 mesi) e adulti scimmie cynomologus (9-15 anni). Questa tecnica, originariamente descritta dal laboratorio del Dr. Lichtman...

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

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Uno studio elettrofisiologico delle sinapsi retinogenicolate e corticogenicolate in fette di cervello di topo

Questo video dimostra la procedura per studiare l'efficienza sinaptica nella corteccia entorinale laterale (LEC) stimolando optogeneticamente gli assoni della corteccia prefrontale mediale (mPFC) e registrando le risposte dei neuroni piramidali nella LEC. Questo metodo combina le registrazioni patch-clamp con l'attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica.

Stimolazione optogenetica e registrazione elettrofisiologica di eventi sinaptici in fette di cervello di ratto

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Analisi microscopica delle sinapsi in fette di ippocampo di topo mediante immunofluorescenza

La registrazione delle correnti di Ca2+ sulla membrana frontale di rilascio presinaptico è la chiave per una comprensione precisa dell'ingresso di Ca2+ e del rilascio di neurotrasmettitori. Presentiamo una dissociazione acuta del midollo spinale della lampreda che produce assoni reticolospinali isolati funzionali, permettendo la registrazione direttamente dalla membrana facciale di rilascio dei singoli terminali presinaptici.

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Le registrazioni di patch-clamp e il riempimento simultaneo di biocitina intracellulare di neuroni accoppiati sinapticamente in fette cerebrali acute consentono un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere le fasi tecniche essenziali della registrazione elettrofisiologica da microcircuiti neuronali e la loro successiva analisi morfologica.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Descriviamo le procedure per l'elaborazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici ad alta risoluzione per l'analisi morfolometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. I micrografi ottenuti con questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia di un certo numero di altri componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali.

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Questo protocollo presenta un metodo robusto e dettagliato per ottenere sinaptosomi altamente puri, vescicole sinaptiche e altre frazioni sinaptiche dal cervello del topo. Questo metodo consente la valutazione dei processi sinaptici, compresa l'analisi biochimica della localizzazione e della funzione delle proteine con risoluzione compartimentale.

Frazionamento subcellulare per l'isolamento di componenti sinaptici dal cervello murino

Impara la vibrodissociazione di neuroni da fettine di cervello di roditore per studiare la trasmissione sinaptica. Questa tecnica consente il controllo farmacologico e la registrazione patch-clamp con imaging in tempo reale dei terminali presinaptici.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici (Video) | JoVE Journal

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

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