Name: CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 32 s
Description: 학습하세요 CD71/TER119 흐름 세포측정법을 사용하여 마우스 적혈구 전구체를 신선한 조직에서 직접 식별하고 분석하는 방법입니다. 이 기술은 적혈구 생성 과정에서 세포 성숙 단계를 정밀하게 연구할 수 있게 합니다.

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우리는 매사 추세츠 유동세포계측법 코어 감사 : 리차드 Konz, 테드 Giehl, 바바라 고셀린, Yuehua 번지와 태미 Krupoch 있습니다. 이 작품은 NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS)와 NIH CA T32 - 130807 (JRS)에 의해 재정 지원되었다. 당뇨병 내분비학 연구 센터 부여 DK32520 지원의 핵심 자원도 사용되었습니다.

1. 조직의 수확 <ol><li> 2-5 ML 차가운 얼룩 버퍼를 (와 호수 (PBS)가 0.2 % BSA와 5mM 포도당을 추가 인산염 버퍼)이있는 튜브를 준비합니다. 이전 조직 수확 얼음 튜브 보관하십시오. </li><li> 쿨 마우스 적절한 승인 프로토콜에 따라 (예 : CO 2 흡입 자궁 전위 다음). </li><li> 나중에 분석, 혈소판의 예, reticulocyte 백작 CBC 분석을위한 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또는 헤파린 혈액 수집 튜브에 심장 바늘로 혈액을 그립니다. </li><li> 1 단계에서 준비를 별도의 튜브에 각각 마우스의 조직을 배치, 비장과 뼈를 수확. 비장에 쉽게 접근할 수는 왼쪽에서 있습니다. 뼈 - 골수, 수확 하나 또는 둘 모두 대퇴골하십시오. 얼음 수확 조직을 유지. </li><li> 원하는 경우, 비장의 무게. erythropoietic 스트레스 반응을받은 마우스는 비장 중량의 상당한 증가를 보여 가능성이 높습니다. </li></ol> 2. 비장 세포의 준비 <ol><li> 사전 moistened 3 ML 주사기 플런저를 사용하여, 부드럽게 40 μm의 살균 셀 스트레이너 (Fisherbrand 카탈로그 번호 22363547 또는 기타)을 통해 비장, 또는 비장의 일부 (이상적으로, 약 10 8 세포에 해당하는 0.1 그램 이하) 푸시 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치. 이 절차를 수행하는 동안 얼음 튜브 보관하십시오. 2 ML의 얼룩 버퍼의 총 스트레이너를 통해 세포를 씻으십시오. </li><li> 부드럽게 어떤 작은 대단히 짧은 시간을 깰 수있는 긴장 세포 현탁액을 피펫. 필요한 경우, 세포가 다시 변형. </li><li> 원심 분리에 의해 두 번 세포를 씻고 차가운 버퍼에 다시 일시 중지합니다. </li><li> hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 일반적인 수확량은 1-2 X 10 8 셀 / 비장 있습니다. 흐름 cytometry 분석을 위해, aliquote 중 외과의 얼룩 튜브에 샘플 당 1-2000000 세포 (BD 팰컨 폴리스티렌은 왕복 바닥 튜브, 352,008) 또는 U - 96 잘 하단 플레이트 (BD 팰컨 353910). 샘플 얼룩 볼륨은 최종 세포 농도 0.5-1 X 10 7 셀 / ML 또는 1-2로, 200 μl입니다 X 10 6 세포 / 200 μl 샘플. </li></ol> 3. 뼈 - 골수 세포의 준비 <ol><li> 첨부 26G 바늘, 차가운 얼룩 버퍼로 미리 채워진 1 개 또는 3 ML 주사기를 준비합니다. </li><li> 명확하게 뼈 시각화하는만큼 대퇴골에 연결된 근육을 제거합니다. </li><li> 뼈 끝을 가능 날카로운 외과 가위, 대퇴골의 양쪽에서 싹둑, 가까이로 사용합니다. 이것은 대퇴골의 길이를 통해 실행 골수 캐비티로 선두, 각 컷 끝에 작은 구멍을 공개해야합니다. </li><li> 1 단계에서 미리 채워진 주사기를 사용하여 이러한 구멍 중 하나를 통해 바늘을 삽입하고, 부드럽게 튜브로, 다른 끝에있는 구멍을 통해 골수를 플러시. </li><li> 위의 비장에 대해서는 40 μm의의 스트레이너 (섹션 2.1 참조)을 통해 얼굴이 붉어지는 부드러운 pipetting하여 세포와 스트레인을 떼어 놓다. </li><li> 감기 얼룩 버퍼에서 원심 분리하여 세포를 두 번 씻으십시오 </li><li> 세포를 카운트하고 섹션 2.4로 resuspend. 일반적인 수확량은 대퇴골 약 10 7 세포 수 있습니다. </li></ol> 4. 태아 간 세포의 준비 <ol><li> 시간 초과 - 임신 여성 생쥐를 준비하려면 저녁에 짝짓기에 마우스를 설정, 10 다음날 오전하기 전에 질 플러그에 대한 검사, 질 플러그가 감지되는 일은 일 0.5 간주됩니다. 베티 직원들은 임신 여성을 식별이 기술에 익숙하지 않은 수사 도움을 드릴 수 있습니다. 임신도 모니터링 마우스 무게에 의해 결정하실 수 있습니다. </li><li> 시간 초과 - 임신 여성 생쥐는 임신의 14.5에 12.5 일에 학살하고 있습니다. 자궁 뿔은 얼음처럼 차가운 문화 매체 또는 얼룩 버퍼를 포함하는 페트리 - 그릇에 제거됩니다. </li><li> 배아는 각 자궁에서 제거되며 태아 간장을 해부합니다. 해부 현미경은 배아 일 12.5 (E12.5) 이하가 필요합니다. </li><li> 간은는 버퍼 pipetting에 의해 기계적으로 dissociated 수 있으며, 96 잘 접시 개별적으로 처리하거나, 또는 실험적인 요구에 따라, 함께 풀링됩니다. </li><li> E13.5에서 태아의 간은 ~ 10 7 세포를했다. 전지는 버퍼를 염색법으로 두 번 씻어과 흐름 cytometric 분석 1-2 X 10 6 세포 / 200 μl 샘플에서 resuspended 있습니다. </li></ol> 5. 유동세포계측법에 대한 항체 염색법 <ol><li> 다음 사항을 포함, 컨트롤 샘플을 제외하고, 모든 샘플에 사용되는 사전 믹스를 얼룩 차 항체를 준비 : <ul><li> 200μg/ml의 최종 농도 ChromePure 토끼 IgG (잭슨, 015-000-003). 병에서 재고 농도를 (이것은 다를 수 있음) 확인합니다. 이것은 마우스 세포에서 FC 수용체를 차단하는 데 사용되며이에 사용할 수 있습니다 다른 종족은 마우스 IgG 또는 쥐 IgG 수 있습니다. 종 선택은 그 종을 사용할 수없는 경우에는 기본 쥐 / 마우스 / 토끼 항체, 이차 항체에 대한 감독의 얼룩 프로토콜의 잠재적인 존재에 의해 결정됩니다차단 항체로 D. 또는 5 % 토끼 혈청 IgG는 정화의 장소에서도 사용할 수 있습니다. 자세한 대안은 단클론 항체 또는 마우스 FC 수용체에서 감독 팹 조각의 사용이다. 아래의 기본 프로토콜은 이차 항체가 포함되지 않습니다 따라서 세 종류의 중 IgG가 사용할 수 있습니다. </li><li> CD71 - FITC, 희석 1:200 (재고 0.5mg/ml, BD - Biosciences, 553,266) </li><li> Ter119 - PE, 1:200 (재고 0.2mg/ml, BD - Biosciences, 553,673)를 희석 </li><li> 추가 항체가 관심의 표면 epitopes에서 감독, 예를 들어 항체가 파 또는 FasL (1,2 참조)에서 감독. 반전 튜브 2-3 배 부드럽게 항체 솔루션을 섞는다. </li></ul></li><li> 각각의 세포 샘플을 미리 믹스 200 μl를 추가하고 부드럽게 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 다음과 같이 제어 세포 샘플을 준비 : <ul><li> '흠​​없는'이 세포가 버퍼를 얼룩의 왼쪽과 세포의 배경 autofluorescence를 제공​​합니다. </li><li> '단일 색상'컨트롤 : 하나의 컨트롤 프로토콜에 사용되는 각각의 항체 / 컬러가 필요합니다. 이러한 컨트롤의 세포는 직접 복합 일차 항체와 중 스테인드 또는 차 항체와 복합 보조 항체 모두 있습니다. 이러한 컨트롤은 채널 사이의 스펙트럼 중복에 대한 해결하기 위해 사용됩니다. </li><li> '형광 빼기 1'(FMO) 컨트롤 : 하나의 제어 프로토콜의 각 항체 / 컬러가 필요합니다 : 세포를 제외하고 프로토콜의 모든 색상 / 항체 물들일 수있는 색상 / 이것은 FMO 컨트롤하는 항체. 특정 채널에 대한 FMO 컨트롤은 해당 채널에 대한 진정한 배경을 제공합니다. 그것은 불특정 같은 isotype의 항체 및 항체 검사 (isotype 제어)와 같은 형광 표시가있는 복합을 포함할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 기본 항체에 품어 샘플 및 관련 컨트롤 45 '1 시간 어둠 속에 (아이스 버킷에 알루미늄 호일 커버를 넣어)에 얼음에 얼룩. </li><li> 부화의 끝에, 4 약 400 XG ° C. 3 '5'에 대한 각각의 샘플 튜브와 스핀에 얼룩 버퍼의 3ml를 추가하여 세포를 씻어 96 잘 번호판을 사용하는 경우, 200 μl의 볼륨에있는 세포가 세 번 씻으십시오. </li><li> 관련있다면, 보조 항체가 얼룩 적용됩니다. 적용 및 최초의 항체가 얼룩에 관해서 씻으십시오. </li><li> 관련있다면, Annexin V와 얼룩은 제조 업체의 지침과 같이 hepes 버퍼를 사용하여 부화의 끝 부분에 적용됩니다. 이 얼룩은 룸 온도에서 15 분 동안 적용, 또는 얼음에서 1 시간입니다. </li><li> 세포는 죽은 세포를 제외, 셀 스며들지 DNA의 염료를 포함하는 솔루션을 얼룩에 흐름 cytometry 분석을 위해 다시 중지됩니다. 여러 DNA의 염료가 Propidium 이우 7 - 아미노 actinomycin D ​​(7AAD) 또는 DAPI를 포함하여, 사용할 수 있습니다. 이들 사이에서 선택은 특정 항체 염색법에 촬영한 채널을 제공 가능한 채널, 그리고 흐름 cytometer에서 사용 가능한 채널에 따라 달라집니다. 7AAD는 BD - Biosciences (559925)에서 얻은하고 제조 업체의 지시에 따라 사용됩니다. DAPI의 얼룩 들어, (로체, 고양이 # 236276) 분말에서 dimethylformamide (DMF)에 1mg/ml의 주식을 -20 ° C에서 보관하고, 버퍼를 얼룩의 1:15,000으로 1:10,000를 희석. </li></ol> 6. 흐름 cytometric 정렬 <ol><li> 세포는 CD71에 대한 항체, Ter119, 혈통의 마커와 같은 흐름 cytometric 분석 (섹션 5) 설명 생존의 염료로 분류됩니다. 라벨 동안 세포 농도가 5 증가 수 X 10 7 / ML. </li><li> 혈통 마스터 믹스를 만들기 위해 다음과 항체의 각각의 동일한 음량을 혼합 : <ul><li> FITC 랫 안티 - 마우스 CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553,848 </li><li> FITC 랫 안티 - 마우스 CD45R/B220 RA3 - 6B2, BD Pharmingen 553,087 </li><li> FITC 햄스터 방지 마우스 CD3e 145 - 2C11, BD Pharmingen 553,061 </li><li> FITC 쥐 방지 마우스 CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557,396 </li><li> FITC 랫 안티 - 마우스 LY - 6G 및 LY - 6C (GR - 1) RB6 - 8C5, BD Pharmingen 553,126 </li><li> (이것은 모든 0.5 MG / ML 각 개별 항체 주식의 1:400 희석하는 것과 동일합니다) 1:80에서 마스터 믹스를 사용합니다. </li></ul></li><li> 저압 정렬 조건과 넓은 노즐을 사용합니다. 아리아에 대한 (BD Biosciences) 우리는 100 μ 노즐, 20 PSI 압력을 사용합니다. </li><li> 수집 버퍼 : PBS는이 20 % 태아 소 혈청을 추가했습니다. </li><li> 정렬 인구의 purities를 확인하려면 (7AAD 또는 이와 유사한 것) 생존의 염료를 포함하는 버퍼의 각 샘플에서 작은 나누어지는을 다시 실행합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : 성인 뼈 - 골수 또는 비장의 CD71/Ter119 얼룩이 표시된 ProE, EryA, EryB 및 EryC (그림 1), 넷 하위 집합의 발달 순서를 식별합니다. Morphologically, 이들은 점점 더 성숙 erythroblasts 일치합니다. 그림 1은 매우 작은 이벤트 (핵, 빨강 전지 포함), 집계 세포와 죽은 세포를 삭제 데이터 분석 단계에서 게이팅 순서를 보여줍니다. 세포 - 표면 단백질의 표현은 Ter119 및 CD71 얼룩 같은 시간에 관련된 항체를 추가하여이 하위 집합 각각에 대해 동시에 측정할 수 있습니다. 그림 1은 죽음 수용체 파 1 셀 표면 표현의 예를 보여줍니다. 이 측정은 EPO와 주입 생쥐에서 실시하거나, 컨트롤 마우스에 식염수에 주입했다. 그것은 EPO는 생체내 1 EryA 인구의 파의 표현을 억제 것이 분명합니다. 세포내 단백질 또는 세포주기 상태를 표현 또한 각 하위 집합에있는 세포에 대해 측정할 수 있습니다. 그림 2는 갓 수확 골수 세포의 대표적인 세포주기 분석을 보여줍니다. 이러한 측정치가 CD71와 Ter119와 함께 세포 표면 얼룩뿐만 아니라, 필요, 세포내 라벨 (토론 섹션을 참조) 세포의 고정과 permeabilization. 태아 간 년 아닌 erythroid 세포는 처음에는 CD41에 대해 아무것도 없습니다 '린 -'세포, 맥 - 1, GR - 1, B220 및 인 경우에는 3 번 CD에 들어 (그림 3)에 게이팅에서 제외됩니다. 나머지 세포은 하위 분할 S0 S5 6 하위 집합로. 태아 간장 세포의 정확한 패턴 (토론 섹션을 참조) 배아 나이에 따라 달라집니다. E13.5 태아 간에 S3의 부분 집합의 대표적인 세포주기 분석 (그림 4) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 마우스 비장의 CD71/Ter119 erythroid의 하위 집합 A.의 게이팅 전략 :.. 비장 세포를 처리하고 CD71, Ter119 및 파에서 감독 항체로 분류되었습니다. 이 그림은 데이터 수집 단계 다음과 같은 분석 전략을 보여줍니다. 히스토그램이 모든 인수 이벤트를 보여줍니다. 대각선 게이트 doublets 또는 더 큰 합산 제외하고 단일 세포 될 가능성이 이벤트를 나타냅니다. 이 게이트에있는 세포는 더 히스토그램 II에서 분석하고 있습니다. 여기에 아주 작은 이벤트 가능성이 핵이나 먼지는 제외됩니다. 문이 세포는 막 - 투과 apoptotic 세포 가능성이 높습니다 DAPI - 긍정적인 세포, 추가 분석에서 제외됩니다 히스토그램 III에 표시됩니다. 히스토그램 IV가 가능한 비장 세포의 결과 인구를 보여줍니다. ProE 게이트는 CD71 높은 Ter119 중간 세포가 포함되어 있습니다. Ter119 높은 세포는 더욱 막대 그래프로 분석 아르 V. 여기 CD71 높은 세포는 덜 성숙, 대형 'EryA'erythroblasts (CD71 높은 Ter119 높은 FSC 높은)와 작은 더 성숙한 'EryB'erythroblasts (CD71 높은 Ter119 높은 FSC 낮은)로 세분화 아르 . 가장 성숙한 erythroblast 부분 집합은 EryC (CD71 낮은 Ter119 높은 FSC 낮은)입니다. 히스토그램 VI는 기저 상태의 생쥐 (식염수에 주입), 그리고 EPO의 단일 복용과 함께 주입 생쥐에 특히 EryA 부분 집합의 셀 표면 파의 표현을 나타냅니다. 파 항체와 얼룩 것은 CD71/Ter119 얼룩과 동시에 진행되었습니다. 표시된 하위 집합의 각 정렬 세포의 B. Cytospin 준비가. 전지는 Giemsa 물들일과 Diaminobenzidine와 후자는 브라운 헤모글로빈과 얼룩이 생성되었습니다. Cytospin 데이터는 원래 리우 외 출판되었습니다., 피가. 2006 7월 1일, 108 (1) :123 - 33. Epub 2006 3월 9일. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 마우스 골수에서 CD71 높은 Ter119 높은 erythroblasts의 세포주기 분석. 마우스는 BrdU와 intraperitoneally을 주입했고, 비장이나 뼈가 골수는 30~60분 나중에 수확했다. 세포 고정과 permeabilized과 (고정, permeabilization 및 BrdU - 얼룩 프로토콜 제조 업체의 지시에 따라되었습니다), CD71 및 Ter119에 대한 스테인드 것에 BrdU에 감독 단클론 항체 자신의 복제 DNA에 BrdU의 설립에 대한 스테인드했다 외에 하였다. BrdU 양성 세포주기의 S - 단계에 있습니다. 계면 세포가 BrdU - 부정하며 DNA 염료 7AAD을 사용하여 G1이나 G2 / M 단계로 해결될 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 마우스 태아의 간장에서 CD71/Ter119 erythroid의 하위 집합 A.의 게이팅 전략 :.. 태아 간 세포는 CD71, Ter119에 대한 라벨이 붙지만, 비 erythroid 혈통 표시 ( '린')에서 감독 FITC - 라벨 항체의 칵테일. 가능한 세포 (7AAD 음수) 린 표현 분석되었고, 린 - 전지 더욱 S0에 S5 erythroid의 하위 집합으로 세분화됩니다. 영거, E13 태아 간가 성숙 S4/S5 하위 집합에있는 세포의 부재에 의해 표시된 덜 성숙 erythroblasts,로 구성되어 있습니다. 표시된 하위 집합의 각 정렬 세포의 B. Cytospin 준비가. 전지는 Giemsa 물들일과 Diaminobenzidine와 후자는 브라운 헤모글로빈과 얼룩이 생성되었습니다. Cytospin 데이터는 원래 P되었습니다팝 외에 ublished, 플로스 Biol 8 일 (9) :. e1000484가. 도이 : 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 태아 간 erythroid의 하위 집합의 세포주기 분석. 임신한 생쥐는 BrdU와 함께 주입했고, 태아의 간은는 permeabilized, 고정, 30~60분 나중에 수확하고, CD71, Ter119 및 BrdU에 대한 항체 물들일되었습니다. S3 세포의 세포주기 상태가 표시됩니다.

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</ol>

동물 실험은 매사 추세츠 의과 대학 IACUC위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

흐름 cytometric 방법은 세포 표면 마커, 단백질 발현, 세포 생존, phospho 특정 항체 3 세포주기 상태를 사용하여 세포 신호를 포함하여 형광 - 복합 특정 항체 혹은 리간드와 검색 수있는 세포 기능의 동시 조사 수 있습니다. 이러한 성능은 신선하게 고립 erythropoietic 조직의 맥락에서, 분화 단계 특정 하위 집합의 개수 각 만들 수 있습니다. 이 방법은 따라서 erythropoietic 자극의 다양한 반응이나 유전자 돌연변이의 결과로, erythropoietic 시스템의 서로 다른 수준에서 기능 및 분자 변화를 평가하실 수 있습니다. 대한 항체 교차 반응없이도 및 교차 반응은 조직 특정 수 있습니다. 그것도 NULL 또는 노크 다운 세포 모델을 사용, 심지어는 이전 테스트 항체를 위해, 확인하는 것이 erythropoietic 조직의 맥락에서 그들의 특이성 중요합니다. 특정 er...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 파 - 비오틴 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidin - APC </td><td> 분자 프로브 </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 μm의 무균 셀 스트레이너 </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> 외과의 얼룩을위한 폴리스티렌 왕복 하단 튜브 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U - 96 바닥 잘 플레이트 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure 래빗 IgG </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71 - FITC (재고 0.5mg/ml) </td><td> BD - Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119 - PE (재고 0.2mg/ml) </td><td> BD - Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD - Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI 분말 </td><td> 로체 </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC 랫 안티 - 마우스 CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC 랫 안티 - 마우스 CD45R/B220 RA3 - 6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC 랫 안티 - 마우스 CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC 랫 안티 - 마우스 LY - 6G 및 LY - 6C (GR - 1) RB6 - 8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC 햄스터 방지 마우스 CD3e 145 - 2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU 흐름 키트 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexin V - 비오틴 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

cd71/ter119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 erythroid progenitors의 제품 식별 및 분석

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

적혈구 조혈의 연구는 이전 조혈 및 erythroid progenitors에서 형성하는 방법 빨간색 세포 이해하는 것을 목표로하고있다. 특히, 빨간색 셀 형성 율이 그의 합성 조직 hypoxia에 의해 트리거되는 호르몬 erythropoietin (EPO)에 의해 규제됩니다. EPO의 급속한 증가에 적절한 조직 산소 결과, erythropoietic 속도 증가를 주도하는 위협 erythropoietic 스트레스 반응으로 알려진 과정. 붉은 세포를 순환의 숫자의 증가는 결과 조직 산소 전달을 향상시킵니다. 효율적인 erythropoietic 스트레스 반응 따라서 생존과 같은 높은 고도, 빈혈, 출혈, 화학 요법 또는 줄기 세포 이식과 같은 생리 학적 및 병리 학적 조건에서 회복하는 것이 중요합니다. 마우스 적혈구 조혈 및 스트레스 반응의 연구에 중요한 모델입니다. 마우스 최종 (성인 타입) 적혈구 조혈은 신생아 비장에서 성인 비장 및 골수에서 배아 일 12.5과 15.5 사이의 태아 간에서 이루어진다. 조직에 erythroid progenitors를 식별하는 방법의 클래식 EPO 함유 반 고체 미디어 도금 때 붉은 세포 식민지을 일으키다 이러한 세포의 능력에 의존하고 있습니다. 그들 erythroid 전구체의 자손은 형태학의 기준에 따라 구분됩니다. 나도 이러한 고전적인 방법을 분자 연구를위한 차별화 단계 특정 erythroid 세포의 큰 숫자에 액세스할 수 없습니다. 우리가 직접 갓 절연 마우스 조직의 맥락에서 분화 단계 특정 erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질을 식별하고 공부의 흐름 cytometric 방법을 제시한다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119에 의존하고, 흐름 cytometric &#39;전달 - 분산형&#39;매개 변수에, 이것은 세포의 크기의 함수입니다. CD71/Ter119 분석은 생체내에 erythropoietic 스트레스를 자신의 응답을하는 동안 erythroid progenitors을 연구하는 데 사용할 수있는 예를 들어, 빈혈 마우스 또는 마우스로 낮은 산소 조건에서 지내게. 또한 적혈구 조혈에 수정된 분자 경로의 구체적인 역할을 평가하기 위해 직접 유전자 변형 성인 마우스 또는 태아의 조직에 erythroid progenitors의 연구를하는 데 사용할 수 있습니다.

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

적혈구 생성 연구의 목적은 초기 조혈 및 적혈구 전구세포로부터 적혈구가 어떻게 형성되는지 이해하는 것입니다. 구체적으로, ...의 속도는...

다음 실험의 전반적인 목표는 갓 채취한 마우스 조직에서 적혈구 전구세포를 직접 식별하는 것입니다. 이를 통해 마우스의 조혈 시스템이 변화하는 시기에 이들 세포의 분자적 특성을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 배아 발달 과정이나 저산소 스트레스에 대한 반응 중에 마우스의 태아 간, 성체 비장 또는 골수에서 먼저 조혈 조직을 분리한 후 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.다음으로 세포 표면 마커인 CD 71 및 TER 119에 대한 항체와 세포 생존율 또는 세포 주기 상태 측정 등 관심 있는 다른 마커들을 사용하여 세포를 라벨링합니다. 이후 라벨링된 세포 현탁액을 유세포 분석기로 분석하여 성숙 단계가 서로 다른 특정 적아세포 서브셋을 식별합니다. 이러한 특정 서브셋은 세포 분리를 통해 정제할 수 있습니다. 그 후, 각 적아세포 성숙 서브셋에 대해 세포 및 분자 분석을 수행할 수 있습니다.갓 분리한 조혈 조직 내에서 특정 성숙 단계의 적혈모구를 직접 식별할 수 있는 능력은 생리적 피질 내의 세포를 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 따라서 이 방법은 서로 다른 성숙 단계의 고단계 적혈모구가 생체 내(in vivo)에서 어떻게 반응하는지 연구할 수 있게 합니다. 생쥐가 자극을 받으면 적혈구 생성 속도가 가속화됩니다.예를 들어, 고산 지대를 모사한 저산소 조건이나 에리스로포이에틴(erythropoietin) 호르몬의 주입 등이 있습니다. 당사는 다중 파라미터 유세포 분석법을 사용하여 복잡한 조직 환경 내에서 적아세포(erythroblasts)를 식별하고, 이들의 신호 전달, 생존 및 세포 주기 상태를 동시에 연구합니다. 또한 신선한 조직에서 특정 성숙 단계의 적아세포를 직접 분리하여 유전자 발현 수준, 염색질 상태 또는 기타 분자적 기능을 탐색할 수 있습니다.마우스의 확정적 적혈구 생성은 성체 마우스의 비장과 골수에서 일어납니다. 따라서 안락사시킨 마우스로부터 이 조직들을 채취합니다. 마우스를 안락사시킨 후 심장 천자를 통해 EDTA 또는 헤파린 혈액 수집 튜브에 혈액을 채취하며, 이 혈액은 추후 헤마토크릿 수치, 망상적혈구 수치 또는 CBC 분석에 사용됩니다.수확한 비장과 대퇴골을 각각 차가운 염색 완충액(staining Buffer)이 들어 있는 별도의 튜브에 넣습니다. 필요한 경우 수확한 조직을 얼음 위에 보관하십시오. 비장의 무게를 측정합니다.적혈구 생성 스트레스 반응을 겪는 마우스는 비장 무게가 유의미하게 증가하는 경향을 보입니다. 이후, 마우스 배아에서 이전에 입증된 절차에 따라 수확한 조직으로부터 비장 세포와 골수 세포를 준비합니다. 확정적 적혈구 생성은 배아기 12.5일에서 15.5일 사이에 태아 간에서 일어납니다.임신 12.5~14.5일째의 시기 조절 임신 암컷 마우스를 준비하여 태아 간 세포를 얻습니다. 시기 조절 임신 암컷 마우스를 안락사시킨 후 자궁각을 얼음이 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 차가운 배양 배지 또는 염색 완충액을 사용합니다.배아 12.5일 또는 그 이전 단계의 태아 간을 해부하여 자궁에서 배아를 적출하려면 해부 현미경이 필요합니다. 먼저 각 배아를 자궁각에서 분리합니다. 그런 다음 자궁벽을 조심스럽게 절개하여 양막낭 안에 있는 배아를 꺼냅니다.양막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 태아의 간은 훨씬 작은 심장 아래에 위치한 가장 큰 붉은색 복부 조직입니다. 태아의 간을 적출하려면, 핀셋을 사용하여 간의 양옆에서 배아를 고정한 뒤 간을 복부 밖으로 밀어내어 배지로 옮깁니다.간을 신선한 염색 완충액이 담긴 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 모든 태아 간의 박리 및 신선한 염색 완충액 튜브로의 이동이 완료되면, 피펫팅을 통해 간을 기계적으로 해리한 후 해리된 세포를 40 micron 나일론 메쉬 스크린으로 여과합니다. 원심분리를 통해 세포를 두 번 세척하며, 이때 상층액은 제거하고 염색 완충액으로 다시 현탁합니다.두 번째 세척 후, 세포를 trypan blue로 염색하고 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 수를 셉니다. E 13.5의 태아 간에는 약 10⁷개의 세포가 있습니다. 유세포 분석을 위해 세포를 200 µL 샘플당 1~2 × 10⁶개의 세포 농도로 재부유시킵니다.본 비디오 프로토콜에서는 유세포 분석을 위한 항체 염색 과정을 태아 간세포만을 대상으로 하여 시연합니다. 이 절차를 시작하기 위해, 마우스 세포의 FC 수용체를 차단하기 위한 정제된 rabbit IgG, CD 71 FETR one 19 PE 및 세포 표면 단백질 fast를 표적으로 하는 항체를 포함하는 1차 항체 염색 프리믹스를 준비합니다. 튜브를 2~3회 반전시켜 항체 용액을 부드럽게 혼합한 후, 이전에 준비한 태아 간세포 샘플에 1차 항체 염색 프리믹스 200 µL를 첨가하고 피펫팅을 부드럽게 수행하여 세포를 재부유시킵니다.다음으로, 6개의 대조군 세포 샘플을 준비하십시오. 세포의 배경 자가형광을 확인하기 위해 염색 완충액에 그대로 둔 미염색 샘플, 채널 간의 스펙트럼 중첩을 보정하기 위해 프로토콜에 사용된 각 항체 또는 색상별 단일 색상 샘플(본 실험에서는 TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotin 및 streptavidin A PC), 그리고 fast biotin의 실제 배경값을 제공하기 위해 fast biotin을 제외한 프로토콜 내의 모든 색상 또는 항체로 염색한 seven A A DA fluorescence minus one 대조군 샘플이 필요합니다. 샘플과 관련 대조군을 1차 항체 염색액에 넣고 얼음 위 암소에서 45분에서 1시간 동안 배양하십시오.배양 단계가 끝나면, 각 시료 튜브에 염색 버퍼 3 mL를 추가하여 세포를 세척하고 4 °C에서 약 400 ×g로 3~5분 동안 원심 분리합니다. 그다음, PC에 strep avid를 처리하고 튜브를 얼음 위에서 30~45분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, 첫 번째 항체 염색 때와 동일하게 세포를 세척합니다.마지막으로, 사멸 세포를 제외하기 위해 세포 투과성 없는 DNA 염색약인 seven a a d가 포함된 염색 용액에 세포를 재현탁합니다. 이제 샘플을 유세포 분석에 사용할 준비가 되었습니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 유세포 분석 이벤트의 정확한 게이팅 분석을 통해 적아구 하위 집단을 신뢰성 있게 식별하는 것입니다.이를 위해서는 정밀한 기기 설정, 적절한 대조군 샘플 준비, 스펙트럼 중첩에 대한 세심한 보정, 그리고 이후 사멸 세포, 응집체 및 매우 작은 이벤트들을 제외하는 게이팅 과정이 필요합니다. 데이터 분석 시작 단계에서, 염색되지 않은 샘플과 단일 색상 대조군 샘플을 사용하여 각 색상 조합에 대한 스펙트럼 중첩 보정을 설정합니다.이 예제에서는 FITC 형광이 PE 채널로 얼마나 유입되는지, 그리고 보정(compensation) 후에 이러한 스펙트럼 중첩이 어떻게 교정되는지 보여드리겠습니다. 먼저, 비염색 대조군을 사용하여 FITC 양성 및 PE 음성 영역을 정의합니다. 다음으로, FITC 단일 색상 대조군을 사용하여 PE 채널로의 스펙트럼 유입을 시각화할 수 있습니다.FlowJo 소프트웨어를 이용한 디지털 보정 후, PE 채널의 spillover fit E 신호를 최소화합니다. 보정이 완료되면 사멸 세포, 응집체 및 작은 이벤트를 제거할 수 있습니다. 응집체와 세포 이중체(doublet)는 forward scatter height와 forward scatter area를 플로팅하고 좁은 대각선 게이트 내의 이벤트를 선택하여 제거합니다.dapi 세포 투과 불가 DNA 염색약에 대해 음성인 세포를 선택하여 사멸 세포를 제거합니다. DAPI 음성 생존 세포 게이트는 전방 산란광이 매우 낮은 핵이나 데브리(debris)와 같은 매우 작은 이벤트들도 함께 제외합니다. 다음으로, 태아 간 세포의 게이팅 전략을 보여드리겠습니다.갓 수확한 세포를 CD 71 TUR one 19 및 비적혈구 계통 마커를 표적으로 하는 ZI 표지 항체 칵테일로 표지하였습니다. 본 예시에서는 샘플의 스펙트럼 중첩에 대한 보정이 이미 완료되었으며, 응집체, 사멸 세포 및 매우 작은 이벤트를 제외하도록 게이팅이 수행된 상태입니다. 계통 양성 fitzy 염색을 제외한 모든 색상이 포함된 FMO 샘플을 사용하여 fitzy 히스토그램을 그리고 계통 음성 세포 게이트를 정의합니다. 다음으로, 이 게이트를 ZI 결합 계통 마커로 염색한 태아 간 세포 샘플에 적용합니다.Lineage 음성 세포를 선택하여 Y축에는 CD 71을, X축에는 TER 19를 표시하여 도식화합니다. 이제 X축을 기준으로 세포를 S zero에서 S five까지의 하위 집단으로 나눌 준비가 되었습니다. Lin 제거된 S zero 하위 집단은 주로 EPO 의존성이 시작되기 전의 CFUE 잠재력을 가진 세포들로 구성됩니다.S one 서브셋은 주로 세포 주기의 S기에 있는 EPO 의존성 CFUE 세포를 포함합니다. S two 서브셋 세포는 콜로니 형성 능력을 상실하고 헤모글로빈을 발현하기 시작하며, S3 서브셋 세포는 주로 호염기성 적아세포입니다. S four 및 S five 서브셋은 후기 적아세포를 포함합니다. 여기에는 CD 71 및 TER one 19 표적 항체로 처리 및 라벨링된 비장 세포와 사망 수용체 fast 히스토그램으로부터 데이터를 획득한 후의 분석 전략이 나와 있습니다.하나는 획득된 모든 이벤트를 보여주며, 여기서 대각선 게이트는 더블렛이나 더 큰 응집체를 제외하고 단일 세포일 가능성이 높은 이벤트를 나타냅니다. 이 게이트 내의 세포들은 여기의 두 번째 히스토그램에서 추가로 분석됩니다. 핵 또는 데브리스일 가능성이 높은 매우 작은 이벤트들은 제외됩니다.게이팅된 세포들은 히스토그램 3에 표시되어 있으며, 여기에서 막 투과성이 있는 세포사멸 세포일 가능성이 높은 DAPI 양성 세포들은 추가 분석에서 제외됩니다. 히스토그램 4는 그 결과로 얻어진 생존 비장 세포 집단을 보여줍니다. pro eGate에는 CD 71 high TER one 19 Intermediate 세포들이 포함되어 있으며, tur R one 19 high 세포들은 히스토그램 5에서 추가로 분석됩니다.여기서 CD 71 고발현 세포는 덜 성숙한 넓은 영역인 a 적아구와 더 작고 더 성숙한 A B 적아구로 세분됩니다. 가장 성숙한 적아구 하위 집단은 ARI C입니다. TER R one 19 및 CD 71과 동시에 관련 항체를 추가함으로써 이러한 각 하위 집단에 대한 세포 표면 단백질의 발현을 동시에 측정할 수 있습니다. 염색 히스토그램 6은 기저 상태의 생쥐와 E ppo를 단회 투여한 생쥐에서 특히 area, A 하위 집단의 세포 표면 사멸 수용체 fast 발현을 보여줍니다.결과는 EPO가 해당 영역에서 fast 발현을 억제한다는 것을 나타냅니다. 각 서브셋에 속한 세포들에 대해 세포 내 단백질의 in vivo 발현군이나 세포 주기 상태를 측정할 수도 있습니다. 이 대표적인 세포 주기 분석에서는 마우스의 복강 내에 BRDU를 주입하고 30분에서 60분 후에 골수를 채취하였습니다.CD 71 및 TER one 19 염색 외에도, 복제 중인 DNA로의 BRDU 통합 여부를 확인하기 위해 세포를 염색하였습니다. BRDU 양성 세포는 세포 주기의 S-phase에 해당합니다. Interface 세포는 BRDU 음성이며 G one 또는 G two M phase로 구분될 수 있습니다. DNAD seven A A D를 사용하여 PRO E area A A B 및 A EC 서브셋 각각에서 세포를 분리할 수 있습니다.여기서는 세포 크기의 감소, 핵 응축, 그리고 헤모글로빈 발현을 반영하는 갈색 착색의 증가와 함께 순차적인 성숙 과정을 보여주는 사이토신 표본들이 제시되어 있습니다. 마지막으로, E 13.5 태아 간의 S3 하위 집단에 대한 대표적인 세포 주기 분석 결과가 여기에 나타나 있습니다. 임신한 마우스에 BrdU를 주입하였습니다.태아 간을 적출하고 30~60분 후에 고정 및 투과화 처리한 다음, CD 71, TER one 19 및 BRDU에 대한 항체로 염색하였습니다. S-phase 세포가 BRDU 양성인 것을 통해 S3 세포의 세포 주기 상태를 분석하였으며, DNA 염색약인 seven A a d로 염색하여 DNA 함량을 정량화하였습니다.본 연구에서 설명하는 사이토메트리 접근법을 이용하면 세포 표면 마커 및 기타 단백질의 발현, 특정 인산화 항체를 이용한 세포 생존 및 세포 신호 전달, 그리고 세포 주기 상태와 같은 세포 기능을 동시에 조사할 수 있습니다. 따라서 이를 통해 다양한 자극에 대한 적혈구모세포(erythroblast)라는 서로 다른 성숙 단계의 분자적 반응이나 유전적 변이의 영향을 조사할 수 있습니다. 유세포 분석을 통한 성숙 하위 집단은 세포 표면 마커의 발현과 전방 산란광(forward scatter)을 기준으로 정의된다는 점에 유의해야 합니다.일반적으로 각 서브셋의 세포들은 다양한 마우스 모델에서 유사한 형태학적 적혈모구 단계에 해당한다는 것을 확인했습니다. 하지만 새로운 마우스 모델을 조사할 때는 이를 검증하는 것을 권장합니다. 각 서브셋의 세포를 분리하여 형태를 관찰함으로써 이를 확인할 수 있습니다. 또한, 각 서브셋의 세포를 분리하여 RNA 또는 전사체 분석에 사용할 수 있는데, 분리 실험 시 세포에 가해지는 전단 응력을 최소화하기 위해 낮은 분리 압력과 넓은 노즐을 사용하십시오.또한 각 소팅 실험 후에 세포 순도와 생존율을 확인하는 것을 권장합니다. 마지막으로, 특정 서브셋의 빈도 변화를 감지했을 때, 이것이 해당 서브셋 내 세포 수의 실제 변화로 인한 것인지 아니면 다른 서브셋의 변화로 인한 것인지 판단하는 것이 중요합니다. 따라서 서브셋 빈도를 측정하는 것 외에도, 각 서브셋의 절대 세포 수를 항상 함께 측정해야 합니다.

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Research

연구

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CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

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