Name: ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: למדו ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות. השיטה מאפשרת הערכת יכולת הנדידה של תאי גידול אנושיים באמצעות PCR ספציפי לאדם במודל CAM.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו רוצים להכיר טייסון פודס בע&quot;מ עבור בנדיבות לספק את הביציות המופרות. שארמה ארנולד סייעה במהלך הסרטה של ​​פרוטוקול זה. Trenis פאלמר נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת L. רות פרס Kirschstein הלאומית למחקר שירות (F31 המכון הלאומי לסרטן). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי CCSRI גרנט # 700537 כדי JDL NIH ו / NCI מענק # CA120711 ו-01A1-01A1 CA120711 ל AZ.

1. הכנת ביצים xenografting (גרורות ספונטנית) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי הניח ביצים עוף מופרית מודגרת בתוך חממה מסתובב במשך 10 ימים ב 100 ° F ולחות 60%. ביצים הן מסובבות ארבע פעמים בכל שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום התפתחותי 10 ביצים ממוקמים בצד שלהם במעמד ביצה. מקור אווז צוואר המנורה או אחרת אור מתאים משמש נר את הביצים על ידי זוהר אור לתוך קליפת בסוף בוטה של ​​הביצה שבה airsac ממוקם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וריד chorioallantoic ממוקם ומסומן. וריד זה ממוקם בחלק העליון של קליפת הביצה שבה הוא צומת של מספר כלי דם גדולים. בשלב זה ענף כלי דם יורד למטה, הרחק CAM ומתחבר העובר. תיבת ריבוע 1cm מצוייר בעפרון על קליפת כ 1cm הרחק מנקודת סניף הווריד. האזור כולל סביב הכיכר הוא ניקה ואז באמצעות מקלון צמר גפן טבול יוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות כלי חיתוך מסתובבת (Dremel) מצויד אבן סיליקון קרביד שחיקה (חלק Dremel # 84922) הוא קדח חור דרך בקצה הקהה של הביצה אל שק אוויר. באמצעות כלי זה אותו הוא קדח חור בתוך הריבוע נמשך קודם לכן על גבי הביצה, עצירת קצר של קרום קליפת הביצה. מחט מד 25-מזרק עם ספחת קנס על קצה היא נהגה להכין חור קטן בקרום קליפת נזהרים שלא לקרוע את CAM הבסיסית. CAM היא מנותקת לאחר מכן מן קרום קליפת באזור הכיכר באמצעות שאיבה עדינה שנוצרו בעזרת פיפטה אוטומטית מצויד לצינור ¼ tygon "להציב מול החור airsac. עם החלת יניקה, כיס אוויר מתחת צריך החור בכיכר המסמנים כי CAM הופל בהצלחה הרחק קליפת הביצה. לאחר CAM הוא ירד, החור שק האוויר ואת החור ממוקם בכיכר ליד הווריד chorioallantoic אטום עם חתיכת סרט מעבדה הקלטת. הביצים מוטלות לאחר מכן ב 100 ° F ולחות 60% לתוך חממה נייח לקראת השתלת תאים סרטניים. ראה איור 1 עבור תיאור רציף. </li></ol> 2. הכנת ביצים הזרקה תוך ורידית (גרורות ניסיוני) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי הניח ביצים עוף מופרית מודגרת בתוך חממה מסתובב במשך 12 ימים 100 ° F ולחות 60%. ביצים הן מסובבות ארבע פעמים בכל שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום התפתחותי 12 ביצים ממוקמים בצד שלהם במעמד ביצה. מקור אווז צוואר המנורה או אחרת אור מתאים משמש נר את הביצים על ידי זוהר אור לתוך קליפת בסוף בוטה של ​​הביצה שבה airsac ממוקם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וריד chorioallantoic ממוקם ומסומן. 1cm על ידי מלבן 0.5 ס"מ מצוירת בעיפרון על קליפת הביצה ישירות מעל הווריד. האזור כולל סביב הכיכר הוא ניקה ואז באמצעות מקלון צמר גפן טבול יוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון קטן נוצרת קליפת במיקום נמשך באמצעות המקדח Dremmel (# 118). החלון מוסר לחשוף את קרום קליפת הבסיסית אשר מוצג לאחר מכן שקוף עם טיפה של שמן מינרלי. ראה 5A הנתון תיאור גרפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה החור שק האוויר ואת החור ממוקם בכיכר ליד הווריד chorioallantoic אטום עם חתיכת סרט מעבדה הקלטת. הביצים מוטלות לאחר מכן ב 100 ° F ולחות 60% לתוך חממה נייח לקראת הזרקת תאים סרטניים. </li></ol> 3. הכנת תאים סרטניים עבור השתלת או בהזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור xenografting, תאים את הגידול מנותקים מן הכלים התרבות שלהם באמצעות טריפסין / EDTA ורחץ עם 10 כרכים של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) על מנת להסיר כל התקשורת שיורית, טריפסין, או EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקה IV, תאים בתרבית מנותקים באמצעות פתרון nonenzymatic התא דיסוציאציה, ורחץ עם סרום ללא DMEM. ו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נספרים עם hemacytometer ו resuspended ב PBS ב 1-40 תאים / מ"ל ​​עבור השתלת, או לחילופין resuspended ב 1 מיליון תאים / מ"ל ​​להזרקה IV בסרום ללא DMEM. </li></ol> 4. השתלת תאים סרטניים אל CAM שנחשפו לאחרונה (גרורה ספונטנית) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביצים יוסרו מן החממה ואת חלון קטן הוא חתך במיקום הכיכר נמשך בעבר שבו כיס אוויר חדש נוצר. הדבר נעשה בקלות עם כלי רוטרי מצויד גלגל חיתוך (כלי Dremel עם גלגל חיתוך עגול 409 #). צמד של מחט מלקחיים האף משמש כדי להסיר את קטע קטן של קליפת ולחשוף את CAM הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטוש צמר גפן שקצהו (מותג פישר # 23-400-001) CAM היא הכתה 5 פעמים. קצת דם צריך להיות ברור על הכותנה. מיד לאחר פגיעה CAM, 25μl ההשעיה התא ממוקם על שטח פגום. מספר אופטימלי של תאים הדואר נקבעmpirically אבל יכול לנוע בין 5 ל 0.5X10 1x10 6. החלון ביצה היא סגורה היטב עם קלטת האפרוחים נשארים עומדים במשך 10-15 דקות על מנת לאפשר לתאים להתיישב. לאחר 15 דקות הביצים מוחזרים החממה נייח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולים מותר לגדול במשך 5-8 ימים בהתאם ליישום ספציפי ואת אופי של קו תאים סרטניים בשימוש. ראה איור 1 עבור תיאור רציף. </li></ol> 5. הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים (גרורות ניסויית) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מד מזרק אינסולין 30 100μl ההשעיה תא מוזרק לתוך הווריד allantoic של העובר כל הביצים הוחזרו חממה נייח ונשאר שם במשך 1-7 ימים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות זמן שונות, הריאות או CAM נמוך נקצרים מעובר כל מעובד לצורך זיהוי של תאים סרטניים, כמתואר להלן. </li></ol> 6. גידולים מסיק ורקמות חומוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור לנתיחה מוכן. Assay מזהה תאים גרורתי על ידי לכימות DNA אנושי באמצעות גישה רגישה PCR. לכן חשוב מאוד על מנת למנוע זיהום חיצוני עם ה-DNA. והניתוחים מבוצעים בשטח ייעודי ברחבי והניתוחים הכלים מנקים בין כל חיה. על מנת למנוע זיהום צולבות של דגימות שלך לאורך כל תהליך לנתיחה 3 סטים נפרדים של כלים משמשים: קבוצה אחת לחיתוך את הביצה, סט אחד להסרת הגידול הראשוני ו סט אחד של הסרת איברים פנימיים. בנוסף, ארבעה מיכלי לשטוף משמשים רציפים שטיפה של כלים בין כל חיה. בתוך רצף שוטף אלה הם: 1) מים מזוקקים כפול, 2) מים מזוקקים פעמיים, 3) תמיסת כלור, ו 4) 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביצים יוסרו מן האינקובטור נייחים דגש על קרח במשך 15 דקות כדי להרדים ו להרדים את החיות. החלונות נפתחים כך הגידולים להיות גלוי. פתיחת חלונות גדולים יותר על ידי הסרת חלק קליפת הביצה עשוי להיות נחוץ. הגידולים העיקריים הם resected מ CAM, שקל, ומעובד היסטולוגיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומוס יוסר קליפת הביצה על ידי חיתוך המעטפת רדיאלית לשני חצאים שווים. העובר הוא יצק מן הקליפה לחתוך והועברו צד השד נקי לשקול הסירה. היא חיה עם גזור באמצעות מערך טרי, נקי של כלים. חיה נפתח על ידי חיתוך דרך עצם החזה. לאחר העובר פתוח, חתיכת הכבד משני האונה הימנית או השמאלית נאסף. איברים פנימיים מוסרים לאחר מכן על ידי משיכת בעדינות על הוושט מחוברת קורקבן ועל קיצוץ visera המחברים את האיברים. על מנת לאסוף את הריאות לחתוך כלוב הצלעות הוא פתח את צלחת השד מופרדת ואת הלב מוסר. בשלב זה אפשר לחתוך סביב ארבעת הצדדים של הריאה (העליון הקרוב בראש הצד השמאלי לאורך כלוב הצלעות, החלק התחתון ליד הסרעפת בצד ימין לאורך קנה הנשימה). לשם עקביות, הריאות באותו נאסף כל חיה. דגימות רקמה שנקטפו מאוחסנים ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר או יכול להיות מעובד מיד לבידוד DNA. </li></ol> 7. בידוד DNA הגנום כמותי ניתוח PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדנ"א הגנומי מופק באמצעות רקמות הירוק חלץ Sybr-N-Amp רקמות PCR Kit (סיגמא אולדריץ קטלוג # XNATRG). הדנ"א מופק ניתן להעביר צינור Eppendorf נקי המאוחסן -20 ° C או להשתמש מיד. חשוב לדלל את ה-DNA 1:50 במים nuclease חינם לפני השימוש בו בתגובת PCR הבאים. לחילופין, ה-DNA ניתן לחלץ באמצעות מספר כלשהו של תקן החילוץ פרוטוקולי ה-DNA (Zijlstra et al., 2002). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA האנושי מתגלה ברקמות חומוס באמצעות PCR כמותי מסוים עבור האדם רצפי Alu. באמצעות PCR כמותי Alu ספציפי primers מתבצע באמצעות הגברה ירוק SYBR מתיק Exract-N-Amp. ערכת ה-PCR מגיעה עם תערובת תגובה 2x המכיל SYBR ירוק, חיץ, dNTPS מלחים, פולימראז תקי ואת נוגדן תקי Jumpstart. לערבב התגובה מורכב בכרך האחרון של 15μl, עם 0.4μM של כל פריימר. ברוב המקרים באמצעות DNA חילוץ בדילול 01:50 תספק נתונים כמותיים, לעומת זאת, כמות אופטימלית של ה-DNA עשויה התבנית צריך להיות מותאם באופן אמפירי. עוף primers GAPDH משמשים בקרה פנימית PCR היא לפעול תחת התנאים הבאים עבור רצפי Alu: הפעלת פולימראז על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואחריו 30 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 ש ', 63 ° C למשך 30 s. , 72 ° C למשך 30 s. תנאי תגובה עבור עוף GAPDH זהים לאלה המתוארים עבור Alu אולם ייתכן שיהיה צורך להרחיב את ה-PCR ל -40 מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח כמותי של גרורות מתבצע בשיטת ΔΔCt השוואת קבוצות הניסוי לקבוצת הביקורת (Schmittgen ו Livak, 2008;. Zijlstra ואח', 2002). לחילופין עקומת סטנדרט ניתן להפיק באמצעות סדרה דילול של תאים סרטניים אנושיים חילוץ באמצעות חלץ-N-Amp Kit (Zijlstra et al., 2002). משמעות סטטיסטיים מוערך באמצעות Student T-test או ניתוח אנובה השליטה קבוצות הניסוי. </li></ol> 8. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. העובר עוף גרורות במודל. א) תרשים פאנל four הממחישות את המראה של הדגם חתך בבית שלבים עיקריים: 1. לאחר 10 ימי דגירה. CAM הגיע כמעט הגודל המרבי. העורקים והוורידים נראים בבירור עם הווריד Allantoic נגד ממוצבת העליון של הביצה. 2. הביצה מיד לאחר קידוח שני חורים קליפת הביצה: האחד לתוך airsac ואחד סמוך לנקודת ההתקשרות על הווריד allantoic. 3. המראה לאחר ואקום קל נעשה שימוש כדי לפנות את airsac ושחרר את CAM. תאים סרטניים (כחול) מוחלים CAM ירד. 4. לאחר המאפשר תאים סרטניים מורכבים לגדול, יחד עם הגידול והרקמות מעובר העוף נקצרים לניתוח B) תיאור סדרתי של המודל: 1.. דוגרים על הביצים., 2. סימון המיקום של הווריד allantoic., 3. קידוח חורים קליפת הביצה., 4. הפלת CAM., 5. חיתוך פתח השתלת תאים סרטניים., 6. יישום תאים סרטניים., 7. קירור את הביצים על הקרח לפני איסוף רקמות., 8. מסיק את הגידול לאחר 7 ימים של צמיחה. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. היסטולוגיה של גידולים CAM. רקמות שנלקחו קרום נושאות הגידול chorioallantoic נקבע בפורמלין, מחולק ומעובד עם כתם trichrome. א) HEp3 הגידול לאחר שבעה ימים של צמיחה על CAM. B ו-C להראות אזורים מוגדל מן stroma הן הגידול מראה. ד) הנורמלים CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. ניתוח האורך כמותי של גרורות. גרסאות עבור הראש קרצינומה HEp3 הצוואר עם היכולת גרורתי גבוה או נמוך (HEp3 M (גבוהה) ו HEp3 M (נמוכה) בהתאמה) נותחו על יכולתם להפיץ באמצעות Alu PCR. עשרת החיות נותחו בכל נקודת זמן למשך 7 ימים. דגימות אלה היו לכמת נגד עקומת סטנדרט והביע לאחר מכן כמו # cells/50mg רקמות. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. עיכוב של תאים גרורות ספונטנית חיות שטופלו 1A5 גרורות עיכוב נוגדן. גידולים שנוצרו באמצעות 5X10 5 HEp3 תאים להחיל CAM היום-10 עוברים. שלושה ימים לאחר החלת תאים סרטניים במחצית חיות שטופלו נוגדן אנטי CD151 1A5. הריאות מן הגידול נושאות חיות נבצרו כעבור יומיים נתון כמותי בזמן אמת Alu PCR. כמותי לעומת זאת בזמן אמת PCR של chGAPDH שימש לאשר את קיומו של כמויות שוות ערך של הדנ"א הגנומי מארח (שיטת ΔΔCt שימש להשוות את שתי הקבוצות כמותית (B). <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. הערכת מעצר, צמיחה, intravasation במפל גרורתי. ביסודו של דבר, גרורות לאיבר משנית מוגדרת על ידי תרומות של שלושה היבטים: מעצר שיעור הצמיחה, שיעור intravasation. אלה ניתן לכמת באמצעות שילוב של גרורות ניסיוני (א) ו גרורות ספונטנית (B). שימוש ניסיוני גרורות (א) מעצר מוגדר כמספר התא זוהה הזרקת הודעה 2hr. הישרדות וצמיחה של תאים נעצר נקבע השינוי במספר הזרקת תא שלאחר 24 שעות ביממה. צמיחה מוגדרת בשיעור של התפשטות בימים 3-7. Intravasation נקבעת באמצעות גרורות ספונטנית (ב) שבו מספר תאים intravasated מוגדר להציג את הנטל גרורתי ביום 7 העולה על הערך החזוי על ידי צמיחה של הנטל גרורתי להציג ביום 6. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. הרחבת חזותי של גרורתי CAM. HEp3 תאים להביע GFP היו מוזרק לווריד על 12 יום התפתחותית. ב 1 יום, 3 ו 5 ביצה הוקרב וקטע CAM היה צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. על רקע ירוק כהה נוצר על ידי קליפת הביצה, vasculature גלוי כקווים שחורים, ועל תאים סרטניים נראים כמו כתמים ירוקים בהירים.

<ol><li>Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li>
<li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li>
<li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li>
<li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li>
<li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin%2FMMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li>
<li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+%28PETA-3%2FCD151%29+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

CAM חומוס שימש במשך עשרות שנים כמודל למערכת ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה בסרטן גרורתי התקדמות. הערכה עקרון היכולות גרורתי בוצעו במודל זה על ידי מגוון של קבוצות, כולל ניתוח של תרדמת (אגירה Ghiso et al, 1999;. Ossowski ו רייך, 1983), שיפוץ רקמות (Deryugina et al, 2005;. האן-Dantona . et al, 1999), גרורות (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. הוא ממשיך להיות דוגמנית מאוד אטרקטיבי עבור הביולוגיה סרטן בשל קלות השימוש, יכולתו לקב...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco של הנשר השתנה בינוני (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים (D-PBS) (1X), נוזל </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7.4 </td></tr><tr><td> טריפסין, 0.05% (1X) עם EDTA 4Na, נוזל </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> ספורטסמן האצ&#39; </td><td> ברי היל </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> חממות אלה הם חלק הכי זמינים. עם זאת, וידאו תציג ציוד שונים. </td></tr><tr><td> ספורטסמן חממה </td><td> ברי היל </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel רוטרי כלי </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dremel גלגלי החיתוך לא. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> סיוע Portable פיפטה </td><td> דיג </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> כותנה והרים קלות Applicators </td><td> דיג </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> ביצים מופרות </td><td> שונים </td><td></td><td> הספק שונים רבים יכולים לשמש. ביצים צריכות להיות כ 35-55 גרם. תרנגולות מניח כי אותם צריך להיות בין 36 לבין 55 שבועות. </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> האוסר מדעי, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> סיבים אופטיים מיקרוסקופ המאייר </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 מחט מד </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sybr הירוק חלץ-N-Amp רקמות PCR Kit </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

במהלך תאים סרטניים להפיץ גרורות מהגידול הראשוני, לפלוש לתוך הרקמות הסובבות, ומתפשטים לאיברים מרוחקים. גרורה היא תהליך מורכב זה יכול לערב סוגי רקמות רבות, בתקופות משך הזמן משתנה, ולעתים קרובות להתרחש עמוק בתוך איברים, ולכן קשה לחקור ולכמת. בנוסף, יעילות תהליך גרורתי מושפעת שלבים מרובים מפל גרורתית ולכן קשה להעריך את התרומה של היבט אחד של התנהגות תאים סרטניים. כתוצאה מכך, מבחני גרורות מבוצעות לעתים קרובות בחיות מעבדה לספק בהכרח בהקשר מציאותי שבו ללמוד גרורות. למרבה הצער, אלה הם מודלים מורכבים יותר על ידי הפיזיולוגיה המורכבת שלהם. עובר אפרוח הוא מודל ייחודי vivo כי מתגבר על מגבלות רבות ללימוד גרורות, בשל הנגישות של קרום chorioallantoic (רמ&quot;א), היטב vascularized חוץ עובריים רקמות הממוקמת מתחת קליפת כי הוא פתוח xenografting של תאים סרטניים (איור 1). יתר על כן, מאז הוא עובר אפרוח immunodeficient טבעי, CAM בקלות תומך engraftment של רקמות הן נורמליות הגידול. והחשוב מכל, CAM העופות בהצלחה תומך המאפיינים תאים סרטניים ביותר כולל צמיחה, פלישה, אנגיוגנזה, שיפוץ של microenvironment. זה הופך את המודל שימושי במיוחד לצורך חקירה של מסלולים שיובילו גרורות סרטן כדי לחזות את התגובה של סרטן גרורתי כדי הרפוי פוטנציאליים חדשים. זיהוי של תאים המופץ על ידי מינים ספציפיים Alu PCR מאפשרת להעריך כמותית גרורות לאיברים כי הם יישבו על ידי כמה כמו 25 תאים. באמצעות קו קרצינומה האדם Epidermoid תא (HEp3) אנו משתמשים במודל זה כדי לנתח גרורות ספונטנית של תאים סרטניים לאיברים רחוקים, כולל הכבד חומוס ריאות. יתר על כן, באמצעות פרוטוקול Alu-PCR אנו מדגימים את רגישות שחזור של assay ככלי לניתוח לכמת, intravasation מעצר, extravasation, והקולוניזציה כמו אלמנטים בודדים של גרורות.

באמצעות PCR כמותי, אנו מדגימים כיצד המודל ומבוססת חומוס CAM ניתן להשתמש כדי לנתח את כמותית גרורות של תאים סרטניים אנושיים לאיברים רחוקים.

במהלך גרורות, תאי סרטן מתפשטים מהגידול הראשוני, פולשים לרקמות סביבות ומגיעים לאיברים מרוחקים. גרורות הן תהליך מורכב...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להעריך באופן כמותי את יכולת הגריעות של תאי סרטן באמצעות קרומי הוריד של העובר (CAM) כמודל של קסנוגרפט. דבר זה מושג תחילה על ידי דגירה של ביצים מופרות עד להגעה של CAM בוגר. השלב השני של הפרוצדורה הוא הזרקה תוך-ורידית או השתלה מקומית של תאי גידול כקסנוגרפט אל ה-CAM.לאחר פרק זמן שהוגדר באופן ניסיוני, נאסף רקמה לניתוח, ולאחר מכן נמדד הכמות של הגריורה באמצעות PCR ספציפי לבני אדם עבור רצף האלל האנושי והתוצאות נותחו. שמי טרנט פאלמר. אני סטודנט לתואר מתקדם במעבדה של ד"ר אנדרה זילסטרה.אדגים את מודל השבח הזרימה (xenograft) ואת מודל הגריעות הספונטנית, בעוד שהמנטור שלי, ד"ר Zilstra, ידגים את ההזרקה תוך-ורידית ואת מודל הגריעות הניסויי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מודלים קיימים הוא המהירות והקלות שבהן חוקר יכול ללמוד באופן כמותי את הגריעות של תאי גידול אנושיים, כאשר חוקרים יכולים להכין כ-120 חיות ולהשלים את הפרוטוקול מההתחלה ועד לסיומו בתוך שבועיים.בשל הנגישות של עובר האפלוס וקלות המניפולציה, ניתן להרחיב את המערכת בקלות ליישומים נוספים בשיטת X ovo. זאת ביצענו בשנים האחרונות, ונושא זה מהווה את מוקדן של סרטונים נוספים ב-JoVE. ביצים מופרות של תרנגולות שהונחו לאחרונה מדגגות במדגרה מסתובבת ארבע פעמים לשעה למשך 10 ימים.ביום העשירי, העבירו את הביצים על צדם על מעמד ב

quantitative-analysis-of-cancer-metastasis-using-an-avian-embryo-model

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר שיטת מיקרו-הזרקה להעברת תאי סרטן השד לחלל הפריביטלין של עוברי דגי זברה טרנסגניים. לאחר הדגירה, אנו מדמיינים את העובר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בפלישה של תאים סרטניים, הפצתם וגרורות.

zPDX-אנליזה של פולשניות: חקירת התנהגות פולשנית של תאי סרטן גרורתיים בעוברי זברה Xenografts

בסרטון זה, אנו מתארים השתלה של תאים סרטניים על קרום כוריואלנטואי של תרנגולת כדי ליצור מודל in ovo. המודל משתיל בהצלחה את תאי סרטן השחלות כדי לחקור את התקדמות הסרטן הגינקולוגי.

מודל סרטן מבוסס קרום עוף Chorioallantoic: מודל In Ovo לחקר גידולים וגרורות של תאים סרטניים

סרטון זה מדגים את ההליך של הזרקה תוך ורידית של תאים סרטניים לתוך כלי הדם של קרום כוריואלנטואי תרנגולת כדי ליצור מודל גרורות סרטניות CAM. התאים המוזרקים יוצרים בסופו של דבר מושבות מפוזרות של תאים חד-סרטניים, מה שמאפשר לחקור פלישה וגרורות של סרטן.

הזרקה תוך ורידית של תאים סרטניים לתוך כלי הדם של קרום כוריואלנטואי עוף: הליך להקמת מודל סרטן קרום כוריואלנטואי לחקר פלישה לסרטן וגרורות

כאן, ניטור בזמן אמת של חילוף החומרים של תאי הגידול, בשילוב עם מודל ממברנה כוריו-אלנטואית של עובר עוף (CAM) של גרורות, משמשים להערכת מטרות/סוכנים אנטי-סרטניים חדשים על יכולתם לעורר רגישות לתאי גידול לכימותרפיה הפוגעת ב-DNA.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

כאן, אנו מתארים דגמים דג הזברה xenograft באמצעות שני אתרים הזרקה שונים, כלומר, חלל צינור perivitelline של קיביה, כדי לחקור את התנהגות פולשנית ולהעריך את הפוטנציאל intravasation ו extravasation של תאי סרטן שד אנושיים, בהתאמה.

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

ברור גרורות תא כליות קרצינומה של תאים היא מחלה ללא מודל בעל חיים כולל לחקירה יסודית מראש. פרוטוקול זה ממחיש שני מודלים של בעלי חיים חדשניים עבור המחלה: מודל העכבר המושתל אורתולמריחה ומודל ממברנה של עוף כוראלואלי, שניהם הפגינו גרורות בריאות הדומה למקרים קליניים.

השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה

אנו מציגים את המודל ממברנה העוף כוראואליאלי כחלופה, השתלה שולחן, במודל vivo עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית תאים לסרטן וגידולים הנגזר החולה.

שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן

הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

זוהי שיטה יעילה לסנן מדכאים או נהגים של גרורות סרטן. תאים, המועברים בספריית ביטויים, מוזרקים לתוך כלי הקרום chorioallantoic עוף כדי ליצור מושבות גרורתיות. מושבות שיש להם ירידה או פולשניות מוגברת הם excised, מורחב, reinjected כדי לאשר פנוטיפ שלהם, ולבסוף, מנותח באמצעות רצף תפוקה גבוהה.

גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי

בדיקת CAM-Delam להערכת היכולת הגרורתית של תאים סרטניים היא מהירה יחסית, קלה וזולה. השיטה יכולה לשמש לחשיפת המנגנונים המולקולריים המווסתים את היווצרות הגרורות ולבדיקת תרופות. בדיקה אופטימלית לניתוח דגימות גידול אנושיות יכולה להיות שיטה קלינית לטיפול מותאם אישית בסרטן.

בדיקת CAM-Delam לציון תכונות גרורתיות על ידי כימות דלמינציה ויכולת פלישה של תאים סרטניים

למדו ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות. השיטה מאפשרת הערכת יכולת הנדידה של תאי גידול אנושיים באמצעות PCR ספציפי לאדם במודל CAM.

ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות

גלה סרטונים נוספים