Name: 単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ単一生細胞におけるmRNA転写動態の測定法。蛍光標識とFRAPを用いてRNAポリメラーゼIIの伸長速度を可視化し、遺伝子発現制御メカニズムの理解に貢献するリアルタイム解析技術です。

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YS - Tは、欧州研究評議会（ERC）、イスラエル科学財団（ISF）（250/06）、ISF - Bikura、イスラエル癌研究基金（ICRF）、科学研究と開発のためのドイツとイスラエル基金（GIFでサポートされています）、米国 - イスラエル二国間科学財団（BSF）、ドイツとイスラエルのプロジェクトの協力（DIP）、そして科学と健康のイスラエルの省庁、およびバー- Ilan大学でライフサイエンスのジェーンスターンLebellファミリーフェローです。 YBはAzrieliのフェローシップの受賞のためのAzrieli財団に感謝です。

<ol><li>Wada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wave+of+nascent+transcription+on+activated+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A wave of nascent transcription on activated human genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).</li>
<li>Brody, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transcription+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Eur+J+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing transcription in real-time.</a> Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).</li>
<li>Lamond, A. I., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+transcription+in+living+color%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II transcription in living color.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).</li>
<li>Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).</li>
<li>Boireau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+cycle+of+HIV-1+in+real-time+and+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells.</a> J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).</li>
<li>Janicki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+silencing+to+gene+expression%3B+real-time+analysis+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells.</a> Cell. 116, 683-698 (2004).</li>
<li>Ben-Ari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+of+an+mRNA+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The life of an mRNA in space and time.</a> J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).</li>
<li>Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+single+mRNPs+in+nuclei+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells.</a> Science. 304, 1797-1800 (2004).</li>
<li>Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins at a glance.</a> J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).</li>
<li>Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+tracking+of+individual+fluorescence+particles%3A+application+to+the+study+of+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics.</a> IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).</li>
<li>Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-allele+analysis+of+transcription+kinetics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells.</a> Nat Methods. 7, 631-633 (2010).</li>
<li>Brody, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+kinetics+of+RNA+polymerase+II+elongation+during+co-transcriptional+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing.</a> PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).</li>
<li>Munoz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+regulates+alternative+splicing+through+inhibition+of+RNA+polymerase+II+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation.</a> Cell. 137, 708-720 (2009).</li>
<li>Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+of+RNA+polymerase+II+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells.</a> Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).</li>
<li>Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+cycle+of+RNA+polymerase+II+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells.</a> J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

生きた細胞でポリメラーゼ運動活性の測定方法は2つの部分に分けることができます。最初の部分は第二部では、データはODEのモデルを用いて分析されるのに対し、測定し、mRNAの転写の動力学的データの取得を可能にする&quot;ウェット&quot;の手順を説明します。5件の研究の数は今や抽出するためのこのアプローチを利用している生きた細胞を5、6、8、12-14の転写動態。これらの研究の主な違いは、FRAPの回復曲線を速度論的パラメータに変換された方法だった。多くの場合、数学モデルが使用されます。モデルは単純な方法で生物学的プロセスを記述する必要がありますし、それがその後、FRAPのデータと比較されます。一度データとモデルの間に良い相関があると、人はそのような薬剤の効果や異なる遺伝子間の比較の測定結果などの追加の生物学的実験によってモデルを検証する必要があります。 追加の運動の結果を得るために、さらに上記の分析を行うことが可能です。例えば、MS2蛍光タンパク質の光活性化フォームを使用して、既に生成されたmRNAの転写産物を光活性化すると転写のサイ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>シグマ</td></tr><tr><td> FuGENE 6トランスフェクション試薬</td><td>ロッシュ</td></tr></tbody></table>

単一生細胞におけるmrnaの転写の動態を測定

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

RNAポリメラーゼII（pol II）の転写活性は、ダイナミックなプロセスであるため、in vivoでの転写過程の動態を測定することは重要である。 pol IIの動力学は、生化学的または分子の方法を用いて測定されている。近年、1-3、新しい可視化手法の開発と、それは一つの生きた細胞でリアルタイムに発生するように転写をフォローすることが可能となっている4ここでは、我々はどのように記述する特定の遺伝子座（DNA）、そのmRNAの製品、および最終のタンパク質産物を蛍光標識し、 生体内で可視化することのできる細胞株を用いた生細胞内の特定の遺伝子ではPol II伸長速度の解析を実行する。5、6 、それは目的の遺伝子のmRNAの実際の転写を検出することが可能である。7、8 mRNAを蛍光mRNA転写産物の3&#39;UTRが24 MS2ステムループを含む生体内でのタギングのmRNAは、のためMS2システムを使ってタグ付けされているそれが転写されるmRNAを標識するYFP - MS2のコートタンパク質に高い特異的結合部位を提供繰り返し、9我々は（FRAP）法を光退色後蛍光回復を使用して転写の動態を監視するには。転写のサイトでYFP - MS2 -タグ付きの新生転写物を退色して、時間をかけてこの信号の回復が続くことによって、我々は新たに作られたmRNAの合成速度を得る5。言い換えると、YFP - MS2蛍光の回復は、世代を反映新しいMS2の蛍光フリーYFP - MS2周辺核質から入る分子による新生の転写産物とそれらの結合の幹ループ。 FRAPの回復曲線は、転写の運動の時間パラメータを取得するために、微分方程式のシリーズが正式な数学的機械論的モデルを用いて分析している。

RNAポリメラーゼII転写反応速度は、生きた細胞内の特定の遺伝子を測定しています。興味のある遺伝子から転写されるmRNAは、蛍光標識と（FRAP）転写伸長の生体内動態が得られる光退色後蛍光回復を使用しています。

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

RNAポリメラーゼII（Pol II）の転写活性はダイナミックなプロセスであり、そのため、...における転写プロセスのキネティクスを測定することは...

本実験の全体的な目的は、特定の遺伝子から転写される様子をリアルタイムで観察し、生細胞内におけるRNAポリメラーゼIIの転写ダイナミクスを測定することです。特定の遺伝子配列における転写を追跡するため、遺伝子構築物をヒト細胞株に安定的に導入します。この遺伝子はゲノム内のランダムな1箇所に複数コピー導入され、当該の特定遺伝子がタンデムに配列した遺伝子座を形成します。遺伝子発現が活性化されると、RNAポリメラーゼIIが遺伝子にリクルートされ、DNA鎖に沿って下流へ移動し、mRNA分子を生成します。転写されたmRNAを標識して検出するため、蛍光タンパク質YFP-MS2の結合部位となる一連の固有配列（MS2リピート）が遺伝子配列に融合されています。MS2ステムループが形成される速度は転写速度に対応しており、光退色後蛍光回復（FRAP）またはFPを用いて、進行中の転写を視覚的に検出します。強力なレーザービームを転写活性部位に照射してYFP MS two分子を光退色させ、蛍光の回復を追跡します。蛍光信号が回復する速度は、RNAポリメラーゼIIの転写速度を反映しています。これにより、転写部位におけるYFP MS two強度の増加の測定値を示す回復曲線が得られます。時間の経過に伴い、これらのデータから転写キネティクスを抽出することができます。得られた結果は、in vivoにおけるRNAポリメラーゼIIの伸長速度を測定できること、およびそれが従来のin vitroでの測定値よりも大幅に速いことを示しています。生化学的なアプローチなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、単一の生存細胞内における特定の遺伝子のキネティクスを測定できる点にあります。これらの手法により、私たちの体のあらゆる細胞で起こっているmRNA転写という最も基本的なプロセスについての知見を得ることができます。これらの手法には、最初に準備すべきいくつかのステップがあるため、視覚的な実演が重要です。私たちは顕微鏡下で細胞を用いて実験を行い、その後、生細胞内の特定の遺伝子におけるRNAポリメラーゼIIの伸長速度論を解析するために、コンピュータソフトウェアを用いたデータ解析を行います。このプロトコールでは、安定的に組み込まれたbeta actin遺伝子、そのmRNA産物、および最終的なタンパク質産物を蛍光標識できるヒトU2 OS細胞株を使用します。ここに示しているのは、U2 OS細胞に組み込まれたCFP beta actin遺伝子構築物の概略図です。最小CMVプロモーターからの転写誘導は、ドキシサイクリンの存在下で逆テトラサイクリン転写活性化因子がテトラサイクリン応答配列（TRE）に結合することで達成されます。転写されたmRNAには、CFP Beta Actonのコーディング配列と、YFP MS2融合タンパク質が結合す

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています...

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

全細胞RNAは、短期的RNA合成と崩壊の変化と同様に、RNAプロセシングの動態を研究するための貧乏人のテンプレートが用意されています。ここでは、これらの制限を克服することができ、新たに転写されたRNAのチオール特有のビオチン化および精製し、4  -...

細胞培養におけるRNA合成、処理およびディケイの高解像度遺伝子発現プロファイリングのための新規転写されたRNAの代謝標識

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。...

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。...

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

ここで説明されているプロトコルは、4-チオウラシルが付いた酵母から精製した新しく合成された mRNA のゲノムワイドな定量化に基づいています。このメソッドは、mrna から非 mRNA 合成を測定することができ、したがって、RNA のポリメラーゼ II...

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

ここでは、ピペットエレクトロポレーション技術に結合した誘導発現系を用いて、一次肺胞上皮細胞における転写物の転写後変調を研究するために使用できるツールを提示する。...

原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム

このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。...

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

このプロトコルは、新しいレポーター遺伝子システムと、一分子感受性を有するDNA二本鎖破断時の転写を検出するための実験的セットアップを提示する。...

DNA二重鎖破断時の転写活性の生細胞イメージング

このプロトコルは、蛍光発生RNAアプタマーであるホウレンソウ2とブロッコリーの動態を決定するための2つの方法を提示します。最初の方法では、プレートリーダーを使用してin vitro...

蛍光発生RNAアプタマーの in vitro および細胞ターンオン動態の決定

学ぶ単一生細胞におけるmRNA転写動態の測定法。蛍光標識とFRAPを用いてRNAポリメラーゼIIの伸長速度を可視化し、遺伝子発現制御メカニズムの理解に貢献するリアルタイム解析技術です。

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

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