Name: 높은 처리량 현장에서 하이브리드화 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 태아 마우스 하부 비뇨생식기 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 고처리량 현장에서 하이브리드화 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에 필수적인 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

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저자는 조직 바구니 준비에 기술 지원을위한 닥터 란 이순신, 뉴저지의 암 연구소, 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 DK083425 및 DK070219 국립 연구소에 의해 투자되었다.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법을 사용하면 여기에 설명된, 그것은 주요 세포 유형 및 mesenchymal 패드, urothelium, 부드러운 근육, 전립선 꽃봉오리, ejaculatory 덕트 및 질을 포함하여 태아 남성과 여성의 마우스 LUTs의 조직 구획의 모든 mRNAs를 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 50μm 섹션은 조직 구조 (예 : 혈관 등) 해결하기 위해 충분한 두께가되는 장점을 가지고 있지만 일반적으로 전체 마운트 이쉬 동안 발생한 방법론 문제 프로브 트래핑을 피할 정도로 얇은 있습니다. 얼룩이 이전의 출판 연구 평가되어 어디에 모든 새로운 riboprobe은 긍정적인 제어 조직에 부과됩니다. 우리는 얼룩 패턴이 조직에있는 특정 있는지 확인합니다. 우리의 방법의 또 다른 장점은 여러 mRNAs의 패턴이 동일한 LUT 조직에서 인접 조직 섹션에 평가 될 수있다는 것이다. 또한,이 방법은 세포 특정 단백질 마커를 시각화하고 이쉬 프로토콜 스테인드 셀 형식을 식별하는 immunohistochemical 기법 결합 수 있습니다....

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 방지 Digoxigenin 항체, 팹 조각 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> 시약 차단 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM 퍼플 AP 기판, precipitating </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP1600 - 100 </td></tr><tr><td> 세포 배양 플레이트,도 24 </td><td> 코닝 </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11 - UTP </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> 양날 면도날 </td><td> 윌킨슨 소드 </td><td> 클래식 모델 </td></tr><tr><td> Eliminase RNase의 제거 </td><td> Decon 연구소 </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> 시그마 </td><td> F5786 - 1L </td></tr><tr><td> 겔 추출 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,704 </td></tr><tr><td> H 2 O에서 글루 타 알데히드, 25 % 용액 </td><td> 시그마 </td><td> G6257 - 100ML </td></tr><tr><td> 헤파린 나트륨 소금 </td><td> 시그마 </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> H 2 O에서 과산화수소, 30 % 용액 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP2633 - 500 </td></tr><tr><td> Levamisole </td><td> 시그마 </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 빠른 설정 인스턴트 접착제 </td><td> 헨켈 주식 회사 </td><td> 46,551 </td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> M33 - 500 </td></tr><tr><td> Maleic 산성 </td><td> 시그마 </td><td> M0375 - 500G </td></tr><tr><td> Microcentrifuge 튜브, 1.5mL </td><td> Biologix 리서치 회사 </td><td> BP337 - 100 </td></tr><tr><td> Millicell 문화 플레이트 삽입 </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> 분자 분쇄 수지 </td><td> G - Biosciences </td><td> 786 - 138PR </td></tr><tr><td> 인산염의 Paraformaldehyde, 4 %의 솔루션을 살린 버퍼 </td><td> Affymetrix </td><td> 19,943 </td></tr><tr><td> 인산은 칼슘 &amp; MG없이 살린 버퍼 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> 폴리에스터 메쉬, 33 미크론, 12 &quot;X 24&quot; </td><td> 소형 부품 부동산 </td><td> CMY - 0033 - D </td></tr><tr><td> Proteinase K 용액, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195 - 5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder 열 </td><td> Qiagen </td><td> 79,654 </td></tr><tr><td> Q 솔루션 </td><td> Qiagen </td><td> DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 함께 제공 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase 저해제 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> RNEASY 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase없는 DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque 낮은 용융 아가로 오스 </td><td> Lonza </td><td> 50,101 </td></tr><tr><td> 양 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> S2263 - 500mL </td></tr><tr><td> Stericup 필터 유닛, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> 나트륨 azide, 입상 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> S227I - 100 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP358 - 212 </td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> S529 - 500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X 솔루션 </td><td> 연구 제품 국제 </td><td> S24022 - 4000.0 </td></tr><tr><td> 윗첨자 III 첫 스트랜드 합성 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA 효소 </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매 DNA 중합 효소 </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> 트리스 - HCL </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP153 - 1 </td></tr><tr><td> 트윈 20 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP337 - 100 </td></tr><tr><td> 고급 표본 욕실 마이크로톰 진동 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> 효모 tRNA </td><td> 로체 응용 과학 </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 urogenital 트랙트의 mrna의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

낮은 urogenital 트랙트 (LUT)의 개발은 복잡한 프로세스입니다. 이 복잡 androgenic 신호와 상피 - mesenchymal 상호 작용의 1,2에 의존 태아 남성 요도에서 전립선 형성하는 동안 입증합니다. 전립선 개발을 담당하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 부적절 같은 양성 전립선 증식과 전립선 암 등 전립선 질환을 야기할 나중에 삶에 reawakened 아르 성장 메커니즘을 보여줄 수 있습니다. 개발 LUT는 해부학적인 몸의 구조도 복잡합니다. 신진 시간 전립선은 16.5 일 게시 개념 (DPC)에 시작하여 많은 세포 유형이 존재한다. Vasculature, 신경 및 평활근은 mesenchymal 기질 내에 3. 이 기질은 multilayered 상피와 주변 androgen 수용체 의존 paracrine 신호 4 태아 전립선에 상승을 제공합니다. stromal androgen의의 신분 수용체 - 응답 전립선 개발 및 이들 유전자에 대한 응답으로 전립선의 상피 ductal 형태가 완전히 이해되지하는 메커니즘에 필요한 유전자. 정확하게 세포 유형을 식별하고 그들 내의 특정 요소의 표현을 집중하는 능력은 더욱 전립선 개발을 이해하는 필수적입니다. 원위치 하이브리드화 년 (이쉬) 조직 내에서 mRNAs의 국산화에 대한 수 있습니다. 따라서이 방법은이를 통해 잠재적인 전립선 개발 규제를 elucidating, 패턴 및 신호 분자와 그 수용체의 표현의 타이밍을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 진동 마이크로톰 - 컷 섹션을 사용하여 태아 마우스 LUT의 mRNA 발현 패턴을 식별하는 높은 처리량 이쉬 기술을 설명합니다. 이 방법은 다른 이쉬 프로토콜을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다. 슬라이드을 준수 얇은 섹션에 이쉬 수행하는 것이 기술적으로 어렵습니다, 모두 cryosections 및 파라핀 섹션은 종종 약한 신호 해상도로 결과를하면서 cryosections 자주 가난한 구조 품질을 가지고 있습니다. 전체 마운트 조직에 이쉬 수행하면 프로브 트래핑이 발생할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 높은 처리량 기술은 세부 조직 아키텍처를 공개 두꺼운 상처 부분을 활용합니다. 수정 microfuge 튜브는 이쉬 절차를 수행하는 동안 부분을 쉽게 처리하실 수 있습니다. 4 mRNA의 성적의 최대함으로써 비용과 효율성 극대화를 줄이고, 최대 단일 실행에서 검색된 24 mRNA의 성적을 가진 단일 17.5dpc LUT에서 심사하실 수 있습니다. 이 방법은 여러 치료 그룹 따라서 해석 데이터에 대한 모든 편견을 제거, 동일하고 하나의 단위로 처리할 수 있습니다. 대부분의 pertinently 전립선 연구원이 방법은 전립선 ductal 네트워크에 상승을 제공 태아 쥐 요도의 낮은 높은 어번던스 mRNA의 성적의 공간과 시간적 위치를 제공합니다.

여기, 우리는 효율 높은 처리량을 설명<em&gt; 현장에서</em태아 마우스 전립선 조직 섹션을 개발 mRNA의 표현의 패턴을 시각화를위한&gt; 하이브 리다이 제이션 (봐야죠) 방법입니다. 방법은 쉽게 다른 마우스 조직에서 또는 다른 종 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하기 위해 적용할 수 있습니다.

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 Urogenital 트랙트의 mRNA의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

하부 요로생식기(lower urogenital tract, LUT)의 발달은 매우 복잡한 과정입니다. 이러한 복잡성은 태아 남성의 ...로부터 전립선이 형성되는 과정에서 입증됩니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 태아 생쥐의 하부 비뇨생식기 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 PCR로 생성된 템플릿으로부터 digoxigenin으로 표지된 리보 프로브(ribo probe)를 합성함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 진동 마이크로톰(vibrating microtome)을 사용하여 두껍게 절단된 섹션을 제작하는 것입니다.세 번째 단계는 맞춤형 바스켓에 담긴 하부 비뇨생식기 경로 절편에서 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 수행하는 것입니다. 결합된 리보 프로브(ribo probe)를 BM purple 침전 알칼리성 인산분해효소 기질을 이용하여 면역조직화학적으로 검출함으로써 mRNA를 시각화합니다. 최종적으로, 현미경 관찰을 통해 태아 생쥐의 하부 비뇨생식기 경로 내에서 저발현 및 고발현 mRNA 전사체의 공간적, 시간적 국소화를 확인할 수 있습니다.면역조직화학법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 ribo probe를 생성하기 쉽고 마우스 전체 게놈의 대부분의 mRNA를 인식하도록 만들 수 있다는 점입니다. 이 방법은 태아 마우스의 생식 비뇨기 발달 과정 중 mRNA 발현 패턴에 대한 통찰을 제공하지만, 다른 장기 시스템, 종 및 발달 단계에도 적용될 수 있습니다. 조직을 agar에 매몰시키는 과정은 습득하기 어려울 수 있으며, 방향의 미세한 차이가 일관되지 않은 결과로 이어질 수 있으므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 조직을 준비하기 최소 하루 전에 지름 12 millimeter의 milli cell culture plate에서 막을 제거하여 버리십시오. 이때 남은 링은 몰드 역할을 하게 되며, 이 링들을 RNase 억제제 용액에 담가 하룻밤 동안 적셔 둡니다.프로토콜 수행 당일에, 단계별 메탄올로 재수화된 마우스 하부 비뇨생식기를 해부합니다. PBS tween으로 세척하면서 방광의 약 2/3를 제거하고, 남은 하부 비뇨생식기 조직을 PBS tween에 보관합니다. 이제 처리된 링 몰드를 유리 현미경 슬라이드 위에 배치하고, 62 °C의 4% 저융점 아가로스 용액을 채운 후 약 2분 동안 식힙니다.이제 하부 요로 조직의 물기를 완전히 제거한 후 agarose 용액에 담급니다. 핀셋을 사용하여 조직이 링의 상단과 하단 중간에 위치하도록 방향을 조정합니다. agarose가 굳을 때까지 4 °C에서 배양기에 넣어 보관합니다.조직을 절편화하기 전, 용매와 물로 헹구어 맞춤형 wilkinson blade를 준비합니다. 이중 날을 길이 방향으로 나누어 두 개의 단일 날로 분리합니다. 그다음, 마이크로톰 날을 사용하여 Wilkinson blade를 지지합니다.이를 위해 먼저, 마이크로톰 칼날을 윌킨슨(Wilkinson) 칼날의 길이에 맞게 자릅니다. 그런 다음 Lock Tite 접착제를 사용하여 마이크로톰 칼날을 윌킨슨 칼날의 절단면에서 약 3~4mm 떨어진 위치에 접착합니다. 이제 보강된 칼날을 진동 마이크로톰에 장착하고 칼날 각도를 35도로 설정합니다.욕조에 PBS를 채우고 주변을 젖은 얼음으로 채워 디럭스 시편 욕조(deluxe specimen bath)를 준비합니다. 플러그에 임베딩된 조직을 장착하기 전에, 링 몰드에서 조직을 꺼내 바닥 표면을 블록 건조시킵니다. 그런 다음 Loctite 접착제를 사용하여 건조된 표면을 마운팅 디스크에 접착합니다.디스크를 진동 절편기(vibrator)에 삽입하고, 절편 두께를 50 microns로, 속도를 2로, 칼날 진폭을 4로 조정합니다. 조직 절편을 자르는 동안, 둔단 핀셋을 사용하여 각 절편을 0.5 mL의 ice cold PBS tween이 채워진 24-well 배양 플레이트로 옮깁니다. 절단 후, IN situ hybridization을 시작하기 전에 스프링 가위로 각 조직 절편 주변의 aros 대부분을 제거합니다. 절편은 2 mM sodium azide가 포함된 PBS tween 내에서 4 °C로 최대 48시간 동안 보관할 수 있습니다.먼저, 마이크로 원심분리 튜브의 바닥 부분을 100 µL 표시선에서 잘라내어 맞춤형 샘플 바스켓을 제작합니다. 튜브의 절단 부위를 불꽃으로 가열하여 플라스틱이 부드러워질 때까지 기다립니다. 그런 다음, 부드러워진 플라스틱을 메쉬 사각형 위에 단단히 누릅니다.굳을 때까지 기다린 후 남은 메쉬를 잘라냅니다. 가열된 18 gauge 바늘을 사용하여 각 튜브 뚜껑에 두 개의 구멍을 뚫어 바스켓을 완성합니다. 24 well 플레이트의 뚜껑에 12 millimeter 구멍 24개를 일정한 간격으로 뚫어 샘플 바스켓을 담을 트레이를 제작합니다.각 구멍이 웰 바로 위에 위치하도록 배치한 후, 수돗물을 0.5인치 높이로 채운 덮개가 있는 하이브리다이제이션 챔버를 60.5°C로 예열하기 시작하십시오. 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 2mL의 PBS tween을 첨가하여 인 시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 시작하십시오. 바스켓이 장착된 준비된 덮개로 이 플레이트를 덮으십시오.이제 조직 절편을 상온에서 바스켓으로 옮긴 후, PBS tween이 포함된 6% hydrogen peroxide에서 쉐이킹 인큐베이션을 수행합니다. 이어서 PBS tween으로 여러 번 세척하고, proteinase K로 인큐베이션한 후, 다시 고정 과정을 거쳐 추가 세척을 진행합니다. 샘플 준비를 마무리하기 위해, 각 웰에 2 mL의 가온된 pre-hybridization buffer를 넣고 가열된 하이브리다이제이션 챔버 내에서 최소 1시간 동안 인큐베이션합니다. 각 웰에 0.5 µg의 labeled RIBA Probe를 첨가하여 하이브리다이제이션을 시작합니다.그런 다음, 가열된 하이브리디제이션 챔버 내부에서 하룻밤 동안 배양을 계속합니다. 다음 날, 용액 1에서 용액 2로 점진적으로 교체하며 조직을 세척한 후, RNAse로 처리합니다. 이어서 용액 3으로 세척하고, TBS tween과 조직 블로킹 버퍼로 세척한 뒤 조직 블로킹 버퍼 내에서 조직을 배양합니다.배양 기간이 종료되면 anti dig 항체를 항체 흡수 버퍼에 넣고 4°C에서 최소 2시간 동안 배양하십시오. 항체 용액을 10,000 RPM에서 1분 동안 원심 분리합니다. 불용성 성분을 제거하기 위해 항체 용액 버퍼 2 mL에 Senna를 추가하십시오.이제 블로킹 버퍼에서 조직을 꺼내 준비된 항체 용액에 넣어 배양합니다. 실험 3일 차에 하이브리드화 챔버에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 조직을 TBST로 여러 번 세척합니다.그다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 1 mL의 NTM buffer로 조직을 10분 동안 세척합니다.그런 다음 용액을 lava sole MBM purple이 포함된 TMT로 교체합니다. 튜브를 암소에 보관하고, 이후 며칠 동안 색 발현 상태를 모니터링하며 필요에 따라 용액을 교체합니다. 색이 완전히 발현되면 조직을 lava sole이 포함된 TMT로 짧게 세척한 다음, paraformaldehyde가 포함된 PBS에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 조직을 표백하고 세척합니다. 이제 절편을 영상화할 준비가 되었습니다. 하부 생식기계 조직은 요도 정중선이 aros 플러그의 평평한 표면과 평행하도록 아가에 임베딩되었습니다.이러한 방향 설정으로 시상면 절편을 얻었습니다. 특수 제작된 샘플 바스켓은 먼지와 입자성 물질로부터 섬세한 조직 절편을 보호했습니다. 이는 수일에 걸친 C two 하이브리디제이션 과정 중에 수행되었습니다.또한 모든 절편의 손실을 방지했습니다. 저발현 mRNA를 검출하는 데 필요한 장시간의 배양 과정 동안 배경 염색을 제한하는 것은 까다로운 일입니다. 하지만 sodium azide를 첨가하고 이후 여과 과정을 거침으로써 배경 염색이 제한된 것으로 보입니다.또한, 시료를 발색 용액에 장시간 배양했을 때 배경 염색에서 눈에 띄는 차이가 나타나지 않았습니다. 이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 6일 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후에 면역조직화학염색과 같은 다른 방법을 수행하여 mRNA의 발현 패턴이 단백질의 발현 패턴과 상관관계가 있는지 확인할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 mRNA 발현 패턴과 발달 중인 생쥐 하부 생식관을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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생물학

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

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비 침습 M-모드 초음파 심장 검진 법에 의한 마우스의 심장 박동의 자궁 측정

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단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

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마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

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조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

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우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

배우세요 태아 마우스 하부 비뇨생식기 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 고처리량 현장에서 하이브리드화 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에 필수적인 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

높은 처리량 현장에서 하이브리드화 방법

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