Name: Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Leer een geautomatiseerd high-throughput platform voor celijnontwikkeling om therapeutische eiwitten te produceren met hoge productiviteit en klonaliteit. Deze methode verbetert efficiëntie en reproduceerbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Gastheercel transfectie <ol><li> Seed 2 x 10 6 CHO-cellen in DXB11 T75 Corning celkweek kolf in 15 ml groeimedium (MEMA met nucleotiden en nucleosiden (Gibco, catalogusnummer 12571), aangevuld met 10% γ-bestraalde gekenmerkt foetaal runderserum (CFBS) (Hyclone, catalogusnummer SH30071.03) en 10 ml / L van 45% glucose-oplossing (Sigma, catalogus nummer G8769)) een dag voor de transfectie. </li><li> Op het moment van transfectie, voor te bereiden transfectie complexen als volgt: <ol class="lalpha"><li> Verdunnen 8 ug DNA in 800 ul van de groei medium zonder serum in een steriele microcentrifugebuis. Meng voorzichtig. </li><li> Verdun 40 pi Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) in 800 ul van de groei medium zonder serum in een polystyreen buis. </li><li> Voeg de verdunde DNA om de verdunde Lipofectamine ™. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Verwijder het groeimedium van de cellen in T75 en te vervangen door 6,4 ml van de groei medium zonder serum. Voeg de 1,6 ml van transfectie complexen aan de kolf. Meng voorzichtig door het schommelen van de plaat. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C in een CO 2 incubator gedurende 6 uur. </li><li> Voeg 8 ml groeimedium aan de kolf en incubeer bij 37 ° C in een CO 2 incubator 's nachts. </li><li> Verwijder medium door aspiratie en voeg vers groeimedium aan de kolf. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO 2 incubator 's nachts. </li><li> Vervang het groeimedium met selectie medium (MEMA medium zonder nucleotiden of nucleosiden (Gibco, catalogusnummer 12561), aangevuld met 10% γ-bestraalde gedialyseerd foetaal runderserum (dFBS) (Hyclone, catalogusnummer SH30079.03) en 10 ml / L 45 % glucose-oplossing (Sigma, catalogus nummer G8769)). </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO 2 incubator voor 2-3 weken. </li></ol> 2. Klonen door Flow Cytometry geactiveerde celsortering <ol><li> Verjagen cellen van de kolf en centrifugeer bij 800 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen in selectie medium aangevuld met 2% boviene serumalbumine en fluorescent gelabeld anti-humaan IgG-antilichaam op 1:20 verdunning. </li><li> Incubeer op ijs gedurende 15-30 minuten en vervolgens twee keer wassen met koud PBS. Resuspendeer cellen in 1x PBS in een polypropyleen buis. </li><li> Bereid je voor aseptische sorteren op een BD FACSAria ™. Bereid 96-well celkweek plaat die 200 ul selectie medium in elk putje bevat. </li><li> Aseptisch belasting van de buis met cellen en analyseren op BD FACSAria ™, de resultaten record voor gekleurd en ongekleurde cellen, respectievelijk. </li><li> Stel de poorten en instellingen om enkele cellen van het gewenste profiel van fluorescentie vlekken te sorteren in 96-well plaat (s). <ol class="lalpha"><li> Getransfecteerde cellen worden eerst geanalyseerd op basis van voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing. Een poort voor de levende cellen is gemaakt op basis van voorwaartse verstrooiing, die een cel grootte en zijwaartse verstrooiing, die een cel complexiteit of granulariteit maatregelen maatregelen. </li><li> De cellen die vallen onder deze poort worden vervolgens onderzocht op PE-kleuring. PE negatieve gate is ingesteld voor onbesmet getransfecteerde cellen of gekleurde gastheercellen. Als gekleurde getransfecteerde cellen worden onderzocht door FACS, is de "High PE" poort dan wordt afgebakend in de top 5% van alle cellen die positief zijn voor PE-kleuren omvatten. </li></ol></li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C incubator voor twee weken. </li></ol> 3. Documentatie van kolonie vorming door CloneSelect ™ Imager Document kolonie vorming in 96-well platen op CloneSelect imager ™ op dag 0, dag 3, dag 7 en dag 13 na de FACS-sortering. Het beeld documentatie zal zorgen voor de selectie van klonen afgeleid van een enkele cel. Een kritische stap in deze documentatie is het krijgen van de focal plane goed aangepast voor de dag 0 meting, omdat er slechts een cel in elk putje op dat punt. Het is zeer belangrijk dat de beelden van de individuele cellen zijn in focus en een poging om scherp te stellen op hen kan misleidend zijn op zijn best. De focal plane kan aanzienlijk verschillen tussen merken van platen en mogelijk zelfs van veel te veel van hetzelfde merk. Dus een vooraf vastgesteld focal plane moet worden gebruikt. Dit kan worden bereikt door te focussen op testen micro-parels of hoge dichtheid cellen afgezet op platen van dezelfde partij wordt gebruikt. Als alternatief kan volgroeid platen van dezelfde partij worden gebruikt voor dit doel. Na de FACS sorteren, is het ook belangrijk te laten de cellen genoegen nemen met een minimum van 2 uur voor imaging, zodat ze zullen worden 'vaste' in positie op de plaat. 4. Screening en selectie van hoog productieve klonen <ol><li> Document monster positie in de ontvangende 96-well assay platen. </li><li> Overdracht hoeveelheden van 20 ul supernatans (verdunnen indien nodig) in de 96-well assay platen door de Tecan Freedom EVO ® liquid handling systeem. Deze flexibele en capabele robotic platform is aangepast voor deze en andere geautomatiseerde celcultuur werk. Speciale programma's werden geschreven om de beste te benutten en de Freedom EVO robotische mogelijkheden voor cellijn ontwikkeling te vergroten. Een voorbeeld hiervan is het instellen van de Tecan om CloneSelect ™ Imager gegevens te interpreteren voor de bemonstering putten met enkele kolonies. Andere programma's waren nodig om extra celcultuur taken, zoals uitvoeren om de geschikte verdunningen van de genomen monsters, te interpreteren, catalogus en sample handmatig gemarkeerd platen te maken, indien nodig, op te schalen hoog producerende klonen, enz. Veel van deze programma's eenvoudig worden toegepast op de 384 en platen, alsmede de oorspronkelijke 96 goed formaat. </li><li> Productie van antilichamen in de monsters wordt geanalyseerd door een sandwich menselijk IgG opsporen van ELISA (Pierce, Rockford, IL) op de Tecan Freedom EVO ® liquid handling systeem. <ol><li> Monsters en standaard (Humane myeloma IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) werden geladen op de pre-coated Bio Coat anti-humaan IgG testplaten (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> De platen werden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende twee uur, gevolgd door drie PBS wasbeurten. </li><li> ImmunoPure Geit anti-humaan IgG, (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) werd toegevoegd aan de plaat bij een 1:2000 verdunning en geïncubeerd gedurende een uur bij kamertemperatuur. </li><li> De platen werden drie keer gewassen met PBS voor het toevoegen van ABTS substraat (Pierce, Rockford, IL) en werden lezen op een bord lezer met behulp van absorptie bij 405 nm voor de detectie. </li></ol></li><li> Selecteer zeer productieve klonen en evalueren de productiviteit in suspensie cultuur. Voor de fed-batch cultuur, werden de cellen geïnoculeerd op 0.3X106 cellen / ml in eiwit vrij medium JRH onmiddellijk voordeel 65.578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS), aangevuld met 5 g / L soja hydrolysaat (DMV International, catalogusnummer SE50MAF-UF, veel nummer) en geïncubeerd bij 37 ° C met 7,5% CO 2. De cultuur voortgezet en werden aangevuld met 2 g / L glucose (Sigma, catalogus nummer G8769, lotnummer 098K2329) als glucose-plus lactaat concentratie in de cultuur bereikte minder dan 2 g / L, en gevoed 2 mM glutamine (Gibco, catalogus nummer 25030, lotnummer 568177) als glutamine bereikte onder de 200 mg / L (metabolieten gemeten door YSI Bioanalyzer). Fed-batch culturen werden beëindigd op dag 14 en de productie van antilichamen werd gemeten door omgekeerde fase HPLC. </li><li> Genetische karakterisering van kandidaat-klonen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) 5. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van de ontwikkeling van antilichamen producerende klonen met de high throughput methode is weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Getransfecteerde cel zwembad was gekleurd met fluorescent gelabelde anti-humaan IgG-antilichaam (Figuur 1A), geanalyseerd en gesorteerd op BD FACSAria ™ (Figuur 1B). Kolonie vorming in 96-wells plaat werd in beeld gebracht op CloneSelect Imager ™ (figuur 1C). Celkweeksupernatant werd bemonsterd uit putten die enkele kolonie bevatten en getest door ELISA op de Tecan Freedom EVO ® liquid handling systeem (figuur 1D). Zeer productief klonen werden gevonden van cellen die het oppervlak hoger gehalte aan antilichamen gereflecteerd door kleuring met fluorescerende gelabeld anti-humaan IgG tentoongesteld. Bij het vergelijken van klonen gegenereerd uit twee populaties van de eerste getransfecteerde cel zwembad, een groot verschil in productiviteit in de fed-batch cultuur werd waargenomen (figuur 2). Voor de top twee klonen gegenereerd op basis van de celpopulatie met een hoge oppervlakte-antilichaam expressie (PE hoog), de specifieke productiviteit varieerde 50 tot 70 pg / cel / dag. Overwegende dat het antilichaam de productiviteit was ~ 20 pg / cel / dag voor de top twee klonen gegenereerd op basis van de celpopulatie met een lage oppervlakte antilichaam expressie (PE laag). Bovendien cellijnen ontwikkeld door FACS sorteren zijn meer stabiel ten opzichte van de productie van antilichamen dan die welke werden gekloond door middel van handmatige kalken verdunning (Figuur 3A). De specifieke productiviteit van de top kloon, "Clone 1", gegenereerd door handmatige kalken verwatering daalde van ~ 30 naar ~ 10 PCD pcd na kweken voor 80 cellen verdubbelingen. Aan de andere kant, de bovenkant subkloon gegenereerd door FACS-sortering, "Clone 2", was in staat om de specifieke productiviteit rond de 20 PCD gedurende ten minste 100 cellen verdubbelingen. Door fluorescente in situ hybridisatie (FISH), hebben we aangetoond Clone 1 zien was als een gemengde populatie van fenotype A (85%) en fenotype B (15%). In tegenstelling, FACS gesorteerd kloon (kloon 2) bleek een meer homogene bevolking, met 99,5% van de cellen bleek te zijn fenotype A (Figuur 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Ontwikkeling van de productie cellijnen voor de productie van monoklonale antilichamen uit CHO-cellen. A) Oppervlakte kleuring van de initiële getransfecteerde cel zwembad met fluorescent gelabelde anti-humaan IgG-antilichaam. B) Het sorteren van de celpopulatie met een hoge fluorescentie-intensiteit (PE hoog) en lage fluorescentie-intensiteit (PE laag) in 96-well plaat. C) documenteren kolonievorming van dag 0 tot dag 13 na het zaaien op CloneSelect Imager ™. D) Screening klonen met behulp van ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Surface geassocieerd antilichaamniveau correleert met antilichaam productiviteit van de cel. Klonen met hoge en lage fluorescentiekleuring werden beide ontwikkeld tot cellijnen en geëvalueerd in fed-batch cultuur. Volumetrische titer en specifieke productiviteit werden vergeleken tussen de top twee klonen van elkaar bevolking. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Klonen gegenereerd op basis van FACS-sortering vertonen een hogere genetische homogeniteit en kloon stabiliteit. A) antilichaam productie van stabiliteit in batch cultuur voor ~ 80 cellen verdubbelingen van de cultuur verstreken tijd. Δ, werd kloon gegenereerd door beperkende verdunning, waar de cellen werden uitgezet bij 2000 cellen / putje, 1000 cellen / putje en 500 cellen / putje. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Zwarte Driehoek" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Zwarte driehoek"> , Werd kloon gegenereerd door middel van FACS op een cel / well. B) Transgene integratie site in CHO-cel chromosoom wordt geïdentificeerd door Fluorescent in situ hybridisatie.

<ol><li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells%3A+improvement+through+gene+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li>
<li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li>
<li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting%3A+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li>
<li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li>
<li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation%3A+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytomery%22%5BJournal%5D)">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li>
<li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grenn+fluorescent+protein+%28GFP%29+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li>
<li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li>
</ol>

De auteurs van dit artikel zijn de werknemers van Merck &amp; Co, Inc, die deze methode gebruiken voor grootschalige productie van therapeutische eiwitten van zoogdieren cellijnen.

Wij presenteerden een geautomatiseerde productie cellijn ontwikkelplatform dat isolatie van zeer productieve klonen mogelijk maakt, en in de tussentijd, terwijl zorgt klonaliteit en kloon stabiliteit. De betrokkenheid van de oppervlakte antilichaam kleuring gevolgd door FACSAria ™ celsortering is de sleutel tot het verkrijgen van enkele klonen met een hoge antilichaam productiviteit. Onze resultaten en andere rapporten 2-4 suggereren dat het antilichaam niveau tijdelijk wordt weergegeven op het celoppervlak goed gecorreleerd met de productiviteit van de cel. Zo kan een fluoresceïne-geconjugeerd antilichaam gebruikt worden om het membraan bijbehorende product te herkennen en de isolatie van hoge producenten hulp. Als alternatief zijn co-expressie van reportergenen en gel MicroDrop technologie is gebruikt om de selectie van hoog-producerende klonen te vergemakkelijken door FACS 6-8. Naast het isoleren van hoge productie van klonen via FACS, hebben andere technologieën ontwikkeld om hetzelfde doel te bereiken. Deze omvatten Trellis bio-CellSpot technologie die microspere antilichaam detectie systemen en laser screening technologie gebruikt om zeer productieve klonen te identificeren en ongewenste cellen, Genetix ClonePix FL en StemCell Technologies ClonaCell EasyPick platform dat high throughput screening van de productie-cellijnen met behulp van een fluorescerende antistof detectie systeem uit te voeren te elimineren . We hebben ervoor gekozen om de FACS klonen methode gebaseerd op oppervlakte geassocieerd antilichaam niveau uit te voeren want het combineert het gemak van de werking, selectiviteit op productiviteit en klonaliteit. De inzet van Tecan Freedom EVO ® liquid handling systeem aanzienlijk toegenomen screening doorvoersnelheid, die de mogelijkheid om te selecteren op high yield klonen van een veel grotere cel zwembad bieden. Andere instrumentatie voor test zoals HTRF, Bioforte Octet, HPLC, etc, worden alle mogelijke middelen te selecteren hoge producenten en uitselecteren van een lage producenten. Door het bijhouden kloon formatie met CloneSelect Imager ™ genereerden wij nodige documentatie om klonaliteit met gedigitaliseerde cellijn de geschiedenis te bewijzen. Klonaliteit wordt verder bevestigd door genetisch enkele transgene integratie plaats karakteriseren op het chromosoom. Een subkloning stap, die meestal wordt genomen om de klonaliteit te waarborgen, kunnen dus worden geëlimineerd. Dit bespaart 4-8 weken de tijd voor cellijn ontwikkeling. Kortom, de kwaliteit van cellijnen gegenereerd door de high-throughput geautomatiseerd platform toonde een hoge productiviteit, de productie stabiliteit en gedocumenteerd cellijn de geschiedenis dat de vraag naar grootschalige productie en de huidige wettelijke eisen moeten voldoen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ Cell Sorter </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> Tecan Freedom EVO ® liquid handling systeem </td><td> Tecan Group </td></tr></tbody></table>

een high-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van manufacturing cell protein therapeutics lines voor

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

De snel groeiende biofarmaceutische industrie vraagt ​​om een ​​snelle ontwikkeling van zeer efficiënte en betrouwbare productie-systemen om te voldoen aan de toenemende behoefte aan drugs benodigdheden. De generatie van de productie-cellijnen is van oudsher betrokken handmatige handelingen die zijn arbeidsintensief, laag-doorvoer en kwetsbaar voor menselijke fouten. Wij rapporteren hier een geïntegreerde high-throughput en geautomatiseerde platform voor de ontwikkeling van de productie cellijnen voor de productie van therapeutische eiwitten. De combinatie van de BD FACS Aria ™ Cell Sorter, CloneSelect ™ Imager en Tecan Freedom EVO ® liquid handling-systeem heeft het mogelijk gemaakt een high-throughput en efficiënter cellijn ontwikkelingsproces. In deze operatie worden de productie gastheer cellen eerst getransfecteerd met een expressievector die het gen van belang een, gevolgd door de behandeling met een selectie agent. De stabiel-getransfecteerde cellen worden vervolgens gekleurd met fluorescentie-gelabeld anti-humaan IgG-antilichaam, en worden vervolgens onderworpen aan flowcytometrie-analyse 2-4. Zeer productief cellen worden geselecteerd op basis van fluorescentie-intensiteit en worden geïsoleerd door single-cell sorteren op een BD FACSAria ™. Kolonie de vorming van een-cellig stadium werd microscopisch gedetecteerd en een reeks van tijd-ronden digitale beelden worden genomen door CloneSelect ™ Imager voor de documentatie van de cellijn geschiedenis. Na een enkele klonen hebben gevormd, werden deze klonen gescreend op de productiviteit door ELISA uitgevoerd op een Tecan Freedom EVO ® liquid handling systeem. Ongeveer 2.000 - 10.000 klonen kunnen worden gescreend per bedrijf cyclus met het huidige systeem setup. Deze geïntegreerde aanpak is gebruikt om een ​​hoge productie van Chinese hamster ovarium (CHO) cel-lijnen voor de productie van therapeutische monoklonale antilichaam (mAb) evenals hun fusie-eiwitten te genereren. Met behulp van verschillende soorten opsporen van sondes, kan de methode worden gebruikt voor het ontwikkelen van andere therapeutische eiwitten of worden toegepast op andere productie-host-systemen. In vergelijking met de traditionele handmatige procedure, deze geautomatiseerde platform aangetoond voordelen van een aanzienlijk verhoogde capaciteit, verzekerd klonaliteit, traceerbaarheid in cellijn geschiedenis met elektronische documentatie en veel lagere kans in een bedieningsfout.

Een high-throughput, geautomatiseerd platform van de productie cellijn ontwikkeling voor de productie van therapeutische eiwitten is beschreven. Uitvoering van de BD FACS Aria Cell Sorter, heeft CloneSelect Imager en Tecan Freedom EVO liquid handling systeem gedemonstreerd aanzienlijk toegenomen verwerkingscapaciteit in cellijn ontwikkeling met verbeterde cellijn kwaliteit en een hoge reproduceerbaarheid.

Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

De snelgroeiende biofarmaceutische industrie vereist een spoedige ontwikkeling van zeer efficiënte en betrouwbare productiesystemen om te voldoen aan de toenemende ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van productiecellijnen voor biologische geneesmiddelen met clonaliteit en een hoge productiviteit. Dit wordt bereikt door eerst de gastheercel te transfecteren met DNA dat het gen van belang codeert. De volgende stap van de procedure is het isoleren van hoogproducerende klonen via FACS, gevolgd door documentatie van de kolonievorming met behulp van de CloneSelect Imager.De laatste stap is het screenen en selecteren van zeer productieve klonen. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die antilichaamproductie in continue en fed-batchculturen aantonen via reverse phase HPLC. De demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor sortering en pcan 80 dgl moeilijk aan te leren zijn vanwege de complexe opstelling die bij deze procedures komt kijken. De volgende wetenschappers uit een laboratorium zullen deze procedures demonstreren voor transfectie van de gastheercel-effect, Jason Sanders voor de sortering en documentatie van kolonievorming en Russell Kan voor Tecan-bemonstering.Om deze procedure te starten, zaai één dag voor de transfectie de gastcellen uit in een kweekfles met 15 milliliters groeimedium. Incubeer de cellen in een incubator op 37 degree Celsius en 7,5% carbon dioxide. Bereid de volgende dag de transfectiecomplexen voor: verdun eerst acht micrograms DNA in 800 microliters serumvrij groeimedium in een steriele microcentrifugebuis en meng dit voorzichtig. Verdun vervolgens 40 microliters lip in 800 microliters serumvrij groeimedium in een polystyreenbuis.Voeg het verdunde DNA toe aan de verdunde Lipofectamine. Meng voorzichtig en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om de gastheercellen voor te bereiden op transfectie. Verwijder het groeimedium van de cellen en vervang dit door 6,4 milliliters groeimedium zonder serum.Voeg 1,6 milliliters van de transfectiecomplexen toe aan de kolf. Meng voorzichtig door de kolf te schudden. Incubeer de cellen gedurende zes uur bij 37 °C in een CO2-incubator.Voeg na zes uur acht milliliter groeimedium toe aan de kolf en incubeer dit de volgende dag gedurende de nacht bij 37 °C in een CO₂-incubator. Verwijder het medium door aspiratie en voeg vers groeimedium toe aan de kolf. Incubeer de cellen na deze nachtelijke incubatie opnieuw een nacht.Vervang het groeimedium door selectiemedium. Incubeer de cellen gedurende twee tot drie weken bij 37 °C in een CO₂-incubator. Twee tot drie weken na transfectie zijn de cellen klaar voor klonering via flowcytometrie-geactiveerde celstorting (FACS). Los de cellen uit de kolf en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 800 RPM bij 4 °C.Resuspendeer de cellen in selectiemedium, aangevuld met 2% bovine serumalbumine. Voeg vervolgens fluorescentie-gelabelde anti-humane IgG-antilichamen toe. Voeg een verdunning van 1:20 toe, incubeer op ijs gedurende 15 tot 30 minuten en was daarna tweemaal met koud PBS; resuspendeer de cellen in 1 XPBS in een polypropyleenbuis.Een voorbeeld van gekleurde cellen wordt in deze afbeelding getoond voor aseptische sortering op een BD FACS Aria. Bereid een 96-wellscellkweekplaat voor die 200 µL selectiemedium per well bevat. Laad de buis met cellen aseptisch en analyseer deze op de BD FACS Aria; leg de resultaten voor respectievelijk gekleurde en ongekleurde cellen vast.Stel de gates en instellingen in om enkelvoudige cellen met het gewenste fluorescentiekleuringsprofiel in de 96-wells plaat te sorteren; incubeer de plaat gedurende twee weken in een incubator bij 37 °C. Documenteer op dag nul, dag drie, dag zeven en dag 13 na het sorteren de colony-vorming in de 96-wells plaat met een clone select imager om te garanderen dat de geselecteerde klonen afkomstig zijn van een enkele cel, om zo zeer productieve klonen te screenen en te selecteren. Documenteer eerst de monsterpositie in de ontvangende 96-wells assayplaat. Gebruik vervolgens een robotisch vloeistofbehandelingssysteem om aliquoten van 20 µL supernatant over elke well van de 96-wells assayplaat te overbrengen; de antilichaamproductie in de monsters wordt geanalyseerd via een sandwich-ELISA.Menselijk IgG detecterende ELI SA op het vloeistofbehandelingssysteem op de volgende wijze. Eerst worden de monsters en een standaard geladen op voorgecodeerde bio coat anti-menselijk IgG assayplaten. De platen worden twee uur geïncubeerd bij kamertemperatuur, gevolgd door drie PBS-wasbeurten.Vervolgens wordt immuno pure geit anti-menselijk IgG-HRP aan de plaatjes toegevoegd in een verdunning van 1:2000 en worden de plaatjes gedurende één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na één uur worden de plaatjes drie keer gewassen met PBS, waarna het ABTS-substraat wordt toegevoegd.Ten slotte worden de platen uitgelezen in een platenlezer met behulp van absorbentie bij 405 nanometer voor detectie. Met dit geautomatiseerde platform werd vastgesteld dat het oppervlakte-antilichaamniveau, weerspiegeld door kleuring met fluorescentie-gelabelde anti-menselijke IgG, correleert met de antilichaamproductiviteit van de cel. Zoals hier getoond voor de twee beste klonen gegenereerd uit de celpopulatie met een hoge oppervlakte-antilichaamexpressie, varieerde de specifieke productiviteit van 50 tot 70 picograms per cel per dag.In contrast, was de antilichaamproductiviteit ongeveer 20 picogram per cel per dag voor de twee beste klonen die waren gegenereerd uit de celpopulatie met een lage oppervlakte-antilichaamexpressie. Bovendien zijn cellijnen die via FACS-sortering zijn ontwikkeld stabieler wat betreft de antilichaamproductie dan cellijnen die via handmatige limiterende verdunning zijn gekloond. De specifieke productiviteit van de beste kloon (kloon één), gegenereerd door handmatige limiterende verdunning, daalde van ongeveer 30 PCD naar ongeveer 10 PCD na kweek gedurende 80 celverdubbelingen.Aan de andere kant was de beste subkloon, gegenereerd door FACS-sortering van kloon twee, in staat om de specifieke productiviteit rond de 20 PCD te handhaven gedurende ten minste 100 celdelingen. Identificatie van de integratieplaats van het transgen in het celchromosoom via fluorescentie in situ hybridisatie toonde aan dat kloon één een gemengde populatie is van fenotype A en fenotype B. In tegenstelling hiermee leek de via FACS gesorteerde kloon een homogenere populatie te zijn, waarbij 99,5% van de cellen fenotype A vertoonde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe productiecellijnen worden ontwikkeld voor de productie van therapeutische eiwitten.

a-high-throughput-automated-platform-for-development-manufacturing

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

De beschreven protocollen stellen laboratoria in staat schaalbare, aderente stamcelcultuur uit te voeren met hoge doorvoer en minimale arbeid, ervaring en investeringskosten voor apparatuur met behulp van een programmeerbare robot voor vloeistofverwerking en 96-well platen.  iPSC's die meer dan 20 keer op dit systeem zijn gepasseerd, behielden pluripotentie, normale karyotypen en differentieerden in cardiomyocyten.

Schaalbare 96 putjes plaat Based iPSC Culture and Production Met een Robotic Liquid Handling System

Een gedetailleerd protocol voor de gelijktijdige werking van 48 parallelle celculturen onder uiteenlopende omstandigheden in een systeem van microbioreactor wordt gepresenteerd. Proces van de cultuur van de cel, oogst en latere antilichaam titer analyse worden beschreven.

Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Automatisering is de sleutel tot opschaling en kostenbeheer in celproductie. Dit manuscript beschrijft het gebruik van een tegenstroom centrifugale celverwerkings inrichting voor het automatiseren van de buffer uitwisseling en celconcentratie stappen voor kleinschalige bioprocessing.

Geautomatiseerd centrifugale systeem voor kleinschalige Celverwerking

We tonen de automatisering van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcelculturen (hiPSC) culturen en neuronale differentiaties die compatibel zijn met geautomatiseerde beeldvorming en analyse.

Geautomatiseerde productie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale en dopaminerge neuronen met geïntegreerde live-cel monitoring

Hier presenteren we een protocol om de grootschalige productie van aanhangende cellen te bereiken via een volledig gesloten systeem op basis van GMP-kwaliteit oplosbare microdragers. De kweek van menselijke mesenchymale stamcellen, HEK293T cellen en Vero-cellen werd gevalideerd en voldeed aan zowel de kwantiteitseisen als de kwaliteitscriteria voor de cel- en gentherapie-industrie.

Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers

Dit artikel beschrijft het productieproces voor chimere antigeenreceptor-T-cellen voor klinisch gebruik, met name met behulp van een geautomatiseerde celprocessor die virale transductie en kweek van T-cellen kan uitvoeren. We geven aanbevelingen en beschrijven valkuilen waarmee rekening moet worden gehouden tijdens de procesontwikkeling en implementatie van een klinische studie in een vroege fase.

Chimere antigeenreceptor T-celproductie op een geautomatiseerde celprocessor

Dit protocol documenteert de fabricage en assemblage van SPOT, een op steigers gebaseerd cultuurplatform met hoge doorvoer, in formaten met 96 en 384 putjes. Het beschrijft ook het zaaiproces voor SPOT, zowel handmatig als met behulp van een in de handel verkrijgbare vloeistofverwerker.

Reproduceerbare productie van SPOT als een op steigers gebaseerd cultuurplatform met hoge doorvoer

Dit protocol beschrijft een schaalbare methode voor de uitbreiding van Adoptive Cell Therapies (ACT)-producten, namelijk Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-cellen en Cytokine-Induced Killer (CIK)-cellen, met behulp van gaspermeable Rapid expansion (G-Rex) apparaten, waarmee efficiënte en robuuste groei wordt aangetoond in een klinisch relevante omgeving.

Efficiënte en snelle generatie van CAR-T en cytokine-geïnduceerde killercellen in GMP-schaalbare apparaten

Leer een geautomatiseerd high-throughput platform voor celijnontwikkeling om therapeutische eiwitten te produceren met hoge productiviteit en klonaliteit. Deze methode verbetert efficiëntie en reproduceerbaarheid.

Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

Meer video's verkennen