Name: 表征草食动物的耐药机制:Spittlebugs臂形 SPP。为例 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 了解臂形草属植物抗沫蝉机制的无选择测试方法，通过评估抗生性和耐害性来支持育种计划。该方法为农业害虫管理提供了可靠的抗性鉴定方案。

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本作品及文中所展示的实验工作得益于雷纳尔多·帕雷哈（Reynaldo Pareja）的倾力协助与热忱支持，以及莉娜·阿吉雷（Lina Aguirre）、吉尔贝托·科尔多瓦（Gilberto Córdoba）、威廉·梅拉（William Mera）、吉梅娜·博尼利亚（Ximena Bonilla）和达里奥·维韦罗斯（Darío Viveros）的慷慨帮助。我们还感谢约翰·迈尔斯（John Miles）以及三位匿名评审人的宝贵意见，这些意见有助于我们改进视频和稿件。

1. 植物
<ol>
	<li>采用成熟植株的单茎插条作为实验单位。将插条修剪至 10 cm，以确保种植材料的一致性。</li>
	<li>为防止植物病原体污染，插条需在 3 % 次氯酸钠溶液中清洗 2 分钟，随后用自来水彻底冲洗。</li>
	<li>每根插条种植于约 36 g 的无菌土壤中，容器为圆柱形 PVC 管（外径 5.3 cm，高 6.5 cm），管底端用泡沫杯密封，顶端加盖 PVC 套管。插条由置于套管中央开口处的泡沫环固定。</li>
	<li>根据需要对植株进行施肥和浇水，以维持适宜的土壤湿度。</li>
	<li>植株在接种昆虫前生长一个月，以促进表层根系发育，这些根系可作为根部木质部取食型沫蝉若虫的取食位点。</li>
	<li>在接虫前，将带有生根插条的 PVC 管倒置 8 天，以进一步促进表层根系生长，部分补偿根系结构的固有差异。该步骤需提供人工光源，我们采用 24 小时连续光照。为避免将植株逃避取食与抗虫性混淆，对倒置处理后表层根极少或无表层根的个体重复植株，从实验中予以剔除。此类剔除应属罕见情况，且绝不导致其所代表的基因型整体被排除。</li>
</ol>
2. 昆虫
<ol>
	<li>从田间采集成年沫蝉，鉴定到种，并将其引入产卵笼中，提供易感的臂形草属牧草叶片供其取食。雌虫将卵产在置于笼底可拆卸浅盘中的土壤内。</li>
	<li>数天后，将土壤悬浮于水中，并通过一系列筛网（42、60 和 150 目）过滤以收集卵。将筛分后的材料悬浮于 30% 的盐水中，可使成熟卵浮起，而未成熟卵及残留有机物则沉降。</li>
	<li>为防止昆虫病原体污染，卵需在 0.5% 次氯酸钠溶液中消毒 5 分钟，随后用蒸馏水冲洗。</li>
	<li>每株试验植物（实验单元）在土壤表面接种六粒成熟卵。仅选用接近孵化的成熟卵进行接种，可通过其前端出现的两个红色斑点（对应昆虫的复眼）、后端的粉红色标记（对应昆虫的腹部）以及完全展开的卵盖来识别。</li>
	<li>接种 4 天后确认孵化是否成功，若卵未孵化，则用本实验室种群中的初孵若虫替换。</li>
	<li>试验植物采用随机完全区组设计，每基因型设六个重复。</li>
</ol>
3. 评估
<ol>
	<li>在接种后约 30 天进行实验评估（具体时间因所研究的昆虫种类而异）。</li>
	<li>采用 1 至 5 的视觉评分标准对损伤程度进行评分，其中 1 表示无可见损伤，5 表示植株死亡（图 1）。对植株损伤的评分可提供耐受性的估计值。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3047/3047fig1.jpg" alt="植物生长实验，五个阶段，编号植物，生物学研究，生长比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 用于评估 Brachiaria spp. 对沫蝉取食耐受性的损伤等级。1 = 无可见损伤；2 = 0–25% 叶片坏死；3 = 25–50% 叶片坏死；4 = 50–75% 叶片坏死；5 = 75–100% 叶片坏死。
<ol start="3">
	<li>通过统计达到末龄幼虫或成虫阶段的昆虫数量来评估昆虫存活率（图2）。昆虫存活率的评分可提供对抗生作用的估计。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3047/3047fig2.jpg" alt="昆虫生命周期阶段示意图，显示发育过程中的体型变化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 吹沫蝉从一龄若虫（左）到成虫（右）的发育过程。在评估当日，仅将至少发育至末龄若虫阶段（箭头所示）的昆虫计入“存活者”。

4. 代表性结果
代表性检测筛选结果 Brachiaria 图3展示了对沫蝉Aeneolamia reducta具有抗性的杂交种。 
<img src="/files/ftp_upload/3047/3047fig3.jpg" alt="散点图；植物损伤与昆虫存活率；生态学研究；数据模式分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 对Brachiaria杂交种抗叶蝉Aeneolamia reducta的筛选结果。若植物对食草动物的响应位于该图下半部分，则视为具有抗性。抗生作用从右向左增强，耐受性从上到下增强。箭头所指为我们设置的抗性对照。

<ol><li>Painter, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPainter%2C+R+%22Insect+resistance+in+crop+plants%22">Insect resistance in crop plants</a>. , Mcmillan. (1951).</li>
<li>Kogan, M., Ortman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antixenosis-a+new+term+proposed+to+define+Painter%27s+%27Nonpreference%27+modality+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Antixenosis-a new term proposed to define Painter's 'Nonpreference' modality of resistance.</a> Bull. Entomol. Soc. Am. 24, 175-176 (1978).</li>
<li>Kennedy, G., Gould, F., Deponti, O., Stinner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological%2C+agricultural%2C+genetic%2C+and+commercial+considerations+in+the+deployment+of+insect-resistant+germplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Ecological, agricultural, genetic, and commercial considerations in the deployment of insect-resistant germplasm.</a> Environ. Entomol. 16, 327-338 (1987).</li>
<li>Holmann, F., Peck, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economic+damage+of+grassland+spittlebugs+%28Homoptera+Cercopidae%29+in+Colombia%3A+a+first+approximation+of+impact+on+animal+production+in+Brachiaria+decumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Neotrop.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Economic damage of grassland spittlebugs (Homoptera Cercopidae) in Colombia: a first approximation of impact on animal production in Brachiaria decumbens.</a> Neotrop. Entomol. 31, 275-284 (2002).</li>
<li>Miles, J. W., Cardona, C., Sotelo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+selection+in+a+synthetic+brachiariagrass+population+improves+resistance+to+three+spittlebug+species%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Recurrent selection in a synthetic brachiariagrass population improves resistance to three spittlebug species.</a> Crop Sci. 46, 1088-1093 (2006).</li>
<li>Ferrufino, A., Lapointe, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plant+resistance+in+Brachiaria+grasses+to+the+spittlebug+Zulia+colombiana%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol.+Exp.+Appl%22%5BJournal%5D)">Host plant resistance in Brachiaria grasses to the spittlebug Zulia colombiana.</a> Entomol. Exp. Appl. 51, 155-162 (1989).</li>
<li>Lapointe, S. L., Serrano, M. S., Arango, G. L., Sotelo, G., Cordoba, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiosis+to+spittlebugs+%28Homoptera%3A+Cercopidae%29+in+accessions+of+Brachiaria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Antibiosis to spittlebugs (Homoptera: Cercopidae) in accessions of Brachiaria spp.</a> J. Econ. Entomol. 82, 1764-1766 (1992).</li>
<li>Cardona, C., Miles, J. W., Sotelo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+methodology+for+massive+screening+of+Brachiaria+spp.+genotypes+for+resistance+to+Aeneolamia+varia+%28Homoptera%3A+Cercopidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">An improved methodology for massive screening of Brachiaria spp. genotypes for resistance to Aeneolamia varia (Homoptera: Cercopidae).</a> J. Econ. Entomol. 92, 490-496 (1999).</li>
<li>Cardona, C., Fory, P., Sotelo, G., Pabon, A., Diaz, G., Miles, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiosis+and+tolerance+to+five+species+of+spittlebug+%28Homoptera%3A+Cercopidae%29+in+Brachiaria+spp.%3A+implications+for+breeding+for+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Antibiosis and tolerance to five species of spittlebug (Homoptera: Cercopidae) in Brachiaria spp.: implications for breeding for resistance.</a> J. Econ. Entomol. 97, 635-645 (2004).</li>
<li>Smith, C., Khan, Z., Pathak, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+C+%22Techniques+for+evaluating+insect+resistance+in+crop+plants%22">Techniques for evaluating insect resistance in crop plants</a>. , CRC Press. (1994).</li>
<li>Lapointe, S., Sotelo, G., Arango, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+for+rearing+spittlebugs+%28Homoptera%3A+Cercopidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Improved technique for rearing spittlebugs (Homoptera: Cercopidae).</a> J. Econ. Entomol. 82, 1764-1766 (1989).</li>
<li>Lopez, F., Cardona, C., Miles, J. W., Sotelo, G., Montoya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+resistance+to+adult+spittlebugs+%28Hemiptera%3A+Cercopidae%29+in+Brachiaria+spp.%3A+methods+and+categories+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Screening for resistance to adult spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae) in Brachiaria spp.: methods and categories of resistance.</a> J. Econ. Entomol. 102, 1309-1316 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

区分不同类型的抗虫机制有助于指导作物育种工作3。基于强烈抗生作用的抗性在某些情况下可能产生选择压力，促使害虫进化出更具侵略性的生物型。另一方面，基于耐受性的抗性可能允许害虫种群数量增长，直至最终超过植物的耐受限度。因此，培育持久抗性品种需要审慎考虑何种抗性机制能为特定的作物-害虫系统带来最大程度的稳定性[有关该主题的全面讨论，参见 Kennedy 等人（1987）的研究]3。
本视频演示基于先前多项研究，旨在评估抗菌作用和耐受性对臂形草属牧草抗沫蝉能力的相对贡献6-9。与选择性试验或田间试验相比，非选择性试验可确保所有植株承受相同的植食性昆虫压力，从而控制因植食性昆虫行为（如寄主偏好、聚集行为）所导致的差异。然而正因如此，非选择性试验不适用于评估抗栖性（antixenosis）介导的抗性。
人工饲养昆虫种群是获得抗性筛选试验用昆虫的首选方法10。种群可全年提供来源可靠、龄期一致且已知的沫蝉，便于开展实验11。然而，可能需要定期将野外个体引入种群，以确保种群在遗传上不偏离相关的田间种群10。为了评估这些人工饲养植食性昆虫的适合度，并监测其攻击性随时间可能发生的变化，所有筛选试验均应包含具有已知抗性水平的适当对照。
设计一个合适的抗性筛选实验需要仔细确定多个参数。我们在设计实验时考虑了一些关键参数，包括寄主植物的生长时期、沫蝉的种类及其发育阶段、接种虫量以及植物与昆虫的接触时间8,9,12。可能需要经过多轮实验和方案优化，才能建立一种快速、经济、可靠且能有效预测田间植食性抗性的检测方法。

表征食草动物抗性机制：沫蝉在 brachiaria 以 spp. 为例

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

植物可通过三种广泛机制抵抗食草动物的损害：抗生性、不选择性和耐受性1。不选择性是指当食草动物能够选择其他植物时，对该植物的回避程度2。抗生性是指植物对取食其组织的食草动物适合度的影响程度1。耐受性是指植物在不损害食草动物生长和繁殖的前提下，承受或修复食草动物造成损伤的能力1。在农业环境中，植物对食草动物抗性的持久性在很大程度上取决于作物育种过程中所采用的抗性机制3。
我们展示了一项非选择性实验，旨在估算抗生物质作用和耐受性对沫蝉抗性相对贡献的大小 Brachiaria spp. 几种黍属的非洲草类 Brachiaria 在新热带地区，它们是重要的牧草植物，但常受到多种本地沫蝉（半翅目：沫蝉科）的严重危害4为了评估植物对沫蝉的抗性，通过茎段扦插进行营养繁殖，待植株生长约一个月，使其长出可供沫蝉取食的浅层根系。随后，对每株测试植株单独接种六粒即将孵化的沫蝉卵。接虫后任其发育一个月，再评估植株受害程度及昆虫存活情况。植株受害程度评分用于估算耐害性，昆虫存活率评分用于估算抗生性。该实验方案有助于实现我们通过育种手段提高商用臂形草属牧草沫蝉抗性的目标5.

本视频讲解了寄主植物对草食性害虫的抗性机制，并演示了一种非选择性试验，用于评估抗生作用和耐受性在Brachiaria spp. 对沫蝉抗性中的相对贡献。

表征食草动物抗性机制：沫蝉在 Brachiaria 以 spp. 为例

植物可通过三种广泛机制抵抗食草动物的损害：抗生性、抗虫性及耐受性1。抗生性是指植物在多大程度上……

大家好，我叫Ush Bara，是国际热带农业中心的一名昆虫学家。本视频的总体目标是演示一种用于鉴定寄主植物对刺吸式害虫抗性机制的方法，以支持合作育种计划，提高对飞虱类害虫的抗性。本片将以草地早熟禾作为示例进行说明。沫蝉是多种重要经济作物草类植物的主要害虫，包括热带牧草、甘蔗和玉米。在美洲热带地区，属于禾本科的牧草是沫蝉最重要的寄主。植物可通过三种广泛的作用机制来抵御植食性害虫的损害。抗生性、抗生素、耐受性、抗性，有时被称为非偏好性，是指当植食性生物能够选择植物时，植物被避开的程度。抗生性通常在选择试验中检测，即让植食性生物接触多种基因型的植物。抗生素是指植物对其取食者适合度影响的程度。最后，耐受性是指植物在不抑制有害生物生长和繁殖的前提下，能够承受或修复由有害生物（HBO）造成损害的程度。抗生素作用和耐受性均最适合在无选择试验中进行检测，因为在无选择试验中，有害生物被限制活动，只能取食单一植物。本视频将演示一种用于评估植物抗生性不耐受性的无选择试验，以沫蝉（spit bug）和黑麦草（IV. in aria grasses）为研究对象。在黑麦草中，寄主植物抗性是控制沫蝉的关键管理策略。然而，基于强效抗生素的抗性可能会产生选择压力，从而促使害虫生物型向更强的毒力发展。另一方面，基于耐受性的抗性将允许蚜虫种群持续增长，直至其数量达到压倒植物的程度。因此，持久抗性可能需要抗生素作用和耐受性在一定程度上同时存在。本实验方案将演示如何评估各因素对沫蝉抗性的相对贡献。Aria Aria 基因型来源于国际热带农业中心种质库的植株。实验所用植株通过成熟植株的单茎扦插进行无性繁殖，并以之作为实验单位。将插条修剪至10厘米，以确保种植材料的一致性，并防止植物病原体污染。插条用3%次氯酸钠溶液清洗两分钟，然后用自来水彻底冲洗。每根插条种植于约36克无菌土壤中，土壤置于聚氯乙烯（PVC）管内，管底用泡沫塑料杯的下部密封，并用PVC接头帽封口。插条由置于衬套中心开口内的泡沫环固定。需要施肥并浇水以保持土壤有足够的湿度。植物生长一个月后，再使其接触昆虫，以使其发育出浅层根系，这些根系可作为根部取食昆虫的取食位点。在侵染前将植物倒置于泥炭藓培养基中八天，可进一步促进表层根系的生长，部分弥补根系结构的固有差异。该步骤需要人工光源，我们提供每天24小时的光照。对于表层根系较少或没有表层根系的植株。经过此倒置处理后，将这些植株从实验中剔除。种植后30天，在每株植物的土壤表面接种6粒来自沫蝉种群的成熟卵。为建立这些种群，需从田间采集成虫沫蝉，鉴定至物种，并将其引入饲养笼中，提供感病性禾草叶片供其取食。雌虫将卵产于笼底浅层移除沟内所含的土壤中。数天后，将土壤悬浮于水中，并通过一系列筛子以收集虫卵。将含有虫卵的材料悬浮于30%的盐溶液中，可使成熟虫卵上浮，而未成熟虫卵则随残留的有机物沉降。为防止昆虫病原体污染，虫卵需在0.5%次氯酸钠溶液中消毒五分钟，然后用蒸馏水冲洗，仅选择即将孵化的成熟虫卵用于感染实验。可通过其前部对应昆虫眼睛位置的两个红点进行识别，后部对应昆虫腹部的粉红色标记，以及完全展开的精子。孵化成功在四天后确认，此时任何未孵化的卵都将被新生的唾液块替代。根据我们的群体试验，植株采用随机完全区组设计，共六个重复。接种后约30天进行试验评估。植物损伤评分可用来评估其耐受性，而昆虫存活率的评分则可用来评估抗生素效应。损伤程度采用1至5级的目测评分标准：1分表示无可见损伤，5分表示植株死亡。随后，通过统计达到末龄幼虫阶段或成虫阶段的昆虫数量来评估其存活率。为了对抗性机制进行分类，可使用散点图对结果进行可视化展示，其中昆虫存活率位于横轴，植物受害程度位于纵轴。从右向左移动时，抗性水平逐渐增加。另一方面，随着从上到下移动，耐受性逐渐增强。若植物对食草动物的响应位于该图下半部分，则认为其具有抗性。若该响应位于左侧象限，则其主要的抗性机制为抗生素作用。如果响应落在右象限，则主导的耐药机制为耐受性。以下是我们筛选数据的一个代表性样本。上方的点代表敏感植株。左下象限中的点代表由抗生素引起的抗性植株。右下象限中的点代表由耐受性引起的抗性植株。我们刚刚观看了一项无选择实验的演示，用于评估抗生素和耐受性对植株抗性相对贡献的程度，无论其作用机制如何。我们以山楂属植物对沫蝉的抗性为例，但所介绍的原理应适用于其他系统。希望我们的视频对您自己的研究工作有所帮助。祝您好运。

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诱导第三阶段扩散性幼虫的进入 松材线虫 通过渗透调节进入隐生状态

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