Name: 계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: 배우세요 기판 스트레인 및 마이크로니들 조작을 활용한 계면 세포 핵의 기계적 성질 측정 방법을 통해 세포 핵 경도와 세포골격 간 힘 전달 메커니즘을 분석하는 생물물리학 기법을 익히세요.

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이 작품은 건강 (R01 HL082792 및 R01 NS059348) 및 Brigham 및 여자의 병원 순환기 리더십 그룹 수상의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
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<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
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<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li>
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<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
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<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

기판의 변형 분석 스트레인 응용 프로그램이 성공적으로 기계적 스트레스를 받게 세포에서 유도된 핵 deformations을 공부하고 핵 강성 특정 핵 봉투 단백질의 기여를 조사하기 위해 우리와 다른 그룹에 의해 사용되고 있습니다. 4-8이 기법의 장점은 뭔가가 프로브 기계적 특성을 자신의 정상 세포와 cytoskeletal 환경에서 그 핵 생활 기판 변형 응용 프로그램과 같은 계약 근육이나 혈관 벽 많은 조직에서 발견 생리로드 응용 프로그램과 유사합니다. 9 또한, 그것은 숫자를 증가, 병렬로 많은 세포 변형 응용 프로그램을 수 한 실험에 분석할 수있는 세포. 기판 변형 분석 중 하나는 한계는 핵 강성의 직접 측정을 허용하지 않는다는 것입니다. 대신,이 방법은 주변 cytoskeleton에 비해 핵의 상대 강성을 결정합니다. 야생 형 세포에서 cytoskeletal 변형율이 적용 기판 변형에 비해입니다 uniaxial 기판 변형 표시 대상이 세...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker 레드 FM 그린 FM </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 및 M - 7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> 행크의 버퍼 소금 염분 </td><td> Invitrogen </td><td> 14,185 </td></tr><tr><td> 페놀 무료, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21,063 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Aleken 체액 </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 시그마 </td><td> P0781 - 100ML </td></tr><tr><td> 필라멘트와 Borosilicate 유리 </td><td> 셔터 악기 </td><td> BF100 - 78-10 </td></tr><tr><td> &quot;/ 광택 이외의 철근 실리콘 판금, 0.005를 광택 </td><td> 전문 제조 주식 회사 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산은 염분 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 14,200 </td></tr><tr><td> 35mm 유리 바닥 문화 요리 (FluoroDish) </td><td> 세계 정밀 계측기, INC </td><td> FD35 - 100 </td></tr><tr><td> Braycote 804 진공 그리스 </td><td> SPI 공급 </td><td> 05133A - AB </td></tr></tbody></table>

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 biophysical assays : 기판 스트레인 신청 및 microneedle 조작

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

대부분의 진핵 세포에서 핵이 가장 큰 organelle이며, 일반적으로 주변 cytoskeleton보다 2-10 배 stiffer이며 따라서 핵의 물리적 특성은 생리와 병리 학적 조건에서 세포의 전반적인 biomechanical 행동에 크게 기여하고 있습니다. 예를 들어, neutrophils를 마이 그 레이션 및 암 세포를 침해에 핵 강성이 조직 내의 좁은 공간을 통해 넘쳐 흐름 또는 통과하는 동안 중요한 장애물을 일으킬 수 있습니다. 1 한편, 같은 근육과 같은 기계적으로 적극적인 조직에있는 세포의 핵은 충분한 구조적 지원을 필요로 반복적인 기계적 스트레스를 견딜 수. 중요한 것은, 핵은 단단히 휴대폰 아키텍처에 통합되어, 그것은 육체적으로 양극 세포, 신경근육학 분기점에서 시냅스 핵의 예를 들어 세포 운동과 핵의 위치를​​위한 중요한 요구 사항,있는 주변 cytoskeleton에 연결하거나, 마이 그 레이션 세포 2. 아니 놀랍게도, 그러한 핵 강성 및 nucleo - cytoskeletal 커플링을 결정하는 중요한 역할을 lamins 및 nesprins 같은 핵 봉투 단백질에 돌연변이가,를 포함하여 인간의 질병의 여러 결과에 최근 게재되었습니다 에머리 - Dreifuss 근육 영양 장애, 사지 - 거들 근육 영양 장애, 그리고 확장성 심근증 3. 다양한 핵 봉투 단백질과 특정 돌연변이의 효과의 biophysical 기능을 조사하기 위해, 우리는 하나의 살아있는 세포에있는 핵의 물리적 특성을 연구하는 실험 방법을 개발 글로벌 또는 지역화된 기계 섭동를 받게. 정확하게 적용 기판 변형 응용 프로그램에 대한 응답으로 유도 핵 deformations를 측정하면 핵의 deformability에 대한 중요한 정보를 산출하고 다른 돌연변이 또는 특정 핵 봉투 단백질에 대한 결함 세포 라인 사이의 양적 비교를하실 수 있습니다. microneedle로 현지화된 cytoskeletal 변형 응용 프로그램이 분석을 보완하는 데 사용되고 핵과 cytoskeleton 세포 사이의 강제 전송에 대한 추가 정보를 얻을 수 있습니다. 그대로 살아있는 세포의 핵 역학을 공부하는 것은 정상적인 세포 구조를 유지하고 고립 핵 작업시 발생할 수있는 잠재적인 유물을 방지합니다. 또한, 기판의 변형 응용 프로그램은 근육이나 다른 조직의 세포 (예를 들어, 혈관 평활근 세포는 혈관 변형에 노출)에 의해 경험 생리적 스트레스에 대한 좋은 모델을 제공합니다. 이러한 도구는 핵 역학 연구를 주로 개발되었습니다 동안 마지막으로, 그들은 또한 cytoskeletal 단백질과 mechanotransduction 신호의 기능을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.

우리는 글로벌 또는 지역화된 스트레인 응용 프로그램에 대한 응답으로 하나의 살아있는 자기편 세포에서 유도된 핵 및 cytoskeletal deformations을 측정하기 위해 두 개의 독립적인, 현미경 기반의 도구를 제시한다. 이러한 기술은 핵 강성 (즉, deformability)을 확인하고 핵과 cytoskeleton 세포 사이에 강제로 전송을 탐사하는 데 사용됩니다.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

대부분의 진핵세포에서 핵은 가장 큰 세포소기관이며, 일반적으로 주변 세포골격보다 2배에서 10배 더 뻣뻣합니다. 결과적으로...

다음 실험들의 전반적인 목적은 인터페이스 세포핵의 기계적 특성과 주변 세포골격과의 물리적 연결성을 측정하는 것입니다. 이는 투명한 실리콘 막 위에 배양된 세포에 기계적 변형(strain)을 가하고, 이에 의해 유도된 핵의 변형을 이미징함으로써 수행됩니다. 핵의 변형이 증가할수록 핵의 강성(stiffness)은 감소하는 것에 해당하며, 핵과 세포골격 간 결합의 변화 또한 유도된 핵 변형에 영향을 미칠 수 있습니다.세포골격에 국소적인 변형을 가하여 세포골격과 핵 사이의 세포 내 힘 전달을 직접적으로 조사합니다. 이후 형광 표지된 NU 핵 및 세포골격 구조의 변위를 이미지화합니다. 이를 통해 주변 세포골격 대비 세포핵의 강성을 나타내는 결과를 얻습니다.기질 변형 실험을 바탕으로 한 마이크로니들 조작 분석 결과, 핵-세포골격 결합의 붕괴가 세포 내 힘 전달의 결함을 유발한다는 것이 밝혀졌습니다. 분리된 핵의 마이크로 피펫 흡입과 같은 기존 방법과 비교하여 이러한 기술의 주요 장점은, 정상적인 세포 구조를 방해하지 않고 온전한 살아있는 세포 내에서 핵 역학을 측정할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법들은 핵막 조성의 변화가 핵의 기계적 특성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이들은 또한 LA 신경병증이나 암과 같은 질환의 맥락에서 핵 역학의 역할을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 각 인장 디쉬는 직경 3인치의 맞춤 제작된 바닥 없는 플라스틱 디쉬와 세포 배양 기질 역할을 하는 실리콘 막을 고정하기 위한 플라스틱 O-링으로 구성됩니다. 인장 디쉬를 준비하려면 4인치 x 4인치 크기의 실리콘 막 조각을 O-링과 디쉬 사이에 고정하고, 초과하는 막 부분을 조심스럽게 잘라낸 뒤, 탈이온수로 인장 디쉬를 헹구고, 실리콘 막을 세포외 기질 분자로 코팅하기 전에 디쉬를 오토클레이브 처리하며, 막의 하단 중앙 외부 지점에 기준점을 표시합니다.이 랜드마크는 단축 변형 적용을 위한 변형 실험 중에 동일한 세포를 식별하는 데 도움이 됩니다. 기준점 주변에 스카치테이프를 두 줄의 평행한 띠 형태로 붙여 막 형성이 한 방향으로만 이루어지도록 제한합니다. 최적의 세포 부착을 위해 실리콘 막을 3 µg/mL의 fibronectin 또는 적절한 세포외 기질 단백질로 코팅하십시오.스트레인 디쉬를 뒤집은 10 centimeter 폴리스티렌 디쉬로 덮고, 다음 날까지 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 과잉 단백질을 제거하기 위해 멤브레인을 PBS로 한 번 헹굽니다. 디쉬에 10 milliliters의 성장 배지를 채우고 따로 둡니다.코팅된 실리콘 멤브레인 디쉬가 준비되면, 0.05% trypsin으로 세포를 처리하고 부착성 세포를 성장 배지가 담긴 디쉬에 파종합니다. 이 과정은 마우스 배아 세포를 사용하여 시연되었습니다.섬유아세포 또는 중배엽 세포를 일반 배양 조건에서 24~48시간 동안 배양합니다. 기질 변형 실험용으로 갖춰진 도립 현미경에는 현미경 스테이지에 장착되는 베이스 플레이트로 구성된 변형 장치가 포함되어 있습니다. 이 플레이트는 실리콘 막의 중앙 부분에 변형을 가하는 역할을 하는 중앙 원통형 플래틴을 고정합니다.이 장치에는 스트레인 디쉬(strain dish)를 고정하며 4개의 가이드 핀을 따라 위아래로 슬라이딩할 수 있는 가동 플레이트와, 하중을 가하기 위한 5파운드 무게추가 있습니다. 핵을 시각화하려면, 스트레인 디쉬 내의 세포를 1 µg/mL의 Hoechst 염색액과 함께 37 °C에서 15분 동안 배양하십시오. 배양 후, 배지를 흡입하여 제거하고 25 mM HEPES가 포함된 페놀 레드 프리(phenol red free) 성장 배지 15 mL로 교체하십시오.그런 다음 디쉬를 디쉬 홀더에 나사로 고정하고, 실리콘 막이 중앙 플라틴(Platin)을 따라 부드럽게 미끄러질 수 있도록 실리콘 막 바닥의 둘레에 그리스를 조심스럽게 바릅니다. 이때 막의 중앙 부분에는 그리스가 묻지 않도록 주의하십시오. 베이스 플레이트를 현미경 스테이지 플레이트 위에 놓은 후, 디쉬 홀더를 베이스 플레이트에 조심스럽게 장착합니다.초기 휴지 상태에서 스트레인 디시(strain dish)의 실리콘 막이 중앙 플래티넘(platin) 위에 가볍게 놓여 있는지 확인하십시오. 다음으로, 실리콘 막의 바닥면에 초점을 맞추어 중앙의 검은색 기준점을 찾으십시오. 이 점은 모든 이미지 획득의 시작점이 되며, 신장 중 및 신장 후 동일한 세포를 찾는 데 도움을 줍니다.이 이미지에서 중앙의 점이 시야 전체를 채우고 있습니다. 점의 경계부터 시작하여 초점을 조절해 세포와 실리콘 멤브레인의 상단을 시각화하십시오. 핵이 중앙에 위치하고 잘 퍼져 있는 세포를 찾으십시오.세포 윤곽과 실리콘 막에 초점을 맞춘 위상차 이미지를 획득합니다. 그다음 핵의 중앙 평면에 초점을 맞추어 핵 훅(nuclear hook) 염색의 형광 이미지를 획득합니다. 5개에서 15개의 세포 이미지를 획득한 후, 다시 중앙 점으로 이동합니다.균일한 변형률이 적용되도록 스트레인 디시에 하중을 천천히 가합니다. 디시의 중앙 부분에 적용하십시오. 최대 기질 변형률은 수직 정렬 핀에 배치된 나일론 스페이서에 의해 제한됩니다. 변형률 적용 후, 실리콘 막의 바닥면에 초점을 맞추고 기준점을 다시 찾은 뒤, 해당 점에서부터 시작하십시오.동일한 세포로 이동하여 다시 한번, 전체 변형 상태의 핵 내 각 세포에 대해 위상차 및 형광 이미지를 획득하되, 초기 이미지의 초점 평면과 최대한 일치하도록 합니다. 세포가 낯선 기질에 대해 능동적으로 리모델링 및 적응하는 것을 방지하기 위해 이 과정은 10분 이내에 완료되어야 합니다. 모든 해당 이미지를 획득한 후, 현미경 스테이지를 시작점으로 되돌립니다.디시 홀더 플레이트에서 추를 조심스럽게 제거하고, 필요한 경우 실리콘 막이 이완되도록 합니다. 스트레인 디시를 초기 위치에 올 때까지 부드럽게 밀어 올립니다. 그런 다음 위상차 및 형광 이미지를 획득합니다.스트레인 인가 후 세포의 이미지는 스트레인 이미지에 대해 설명한 것과 동일한 방식으로 획득하며, 스트레인 인가 전, 중, 후의 세포 및 형광 표지된 핵의 이미지를 분석하여 정규화된 핵 스트레인을 계산합니다. 본 시연에서는 분석을 위해 직접 작성한 MATLAB 스크립트를 사용하지만, 수동으로 기질 스트레인을 계산하기 위한 여러 대안적 옵션도 가능합니다. 대응하는 스트레인 인가 전 이미지와 인가 후 이미지 사이의 세포막 상에 위치한 3~6개의 대조점 위치를 매칭합니다. 그 후 MATLAB 프로그램은 스트레인 인가 전 이미지와 풀 스트레인 이미지 간의 매칭된 대조점 위치를 비교하여 인가된 막 스트레인을 계산합니다.또한 사전 변형 이미지와 사후 변형 이미지 사이의 잔류 변형률(residual strain)에 대해 위치를 비교합니다. 제어점(control points)은 이미지 쌍을 정합하는 데 동시에 사용되며, 이는 손상되거나 탈락하는 세포를 감지하는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 개별 핵마다 핵 변형률을 계산하는 별도의 MATLAB 프로그램을 사용하여 핵을 수동으로 선택합니다.이는 전-변형(pre strain) 및 후-변형(post strain) 형광 이미지 간의 핵 크기를 맞추거나, 서로 다른 실험 간에 적용된 막 변형의 미세한 차이를 보정하기 위해 핵 내 마커를 맞춤으로써 달성됩니다. 결과는 정규화된 핵 변형으로 표시됩니다. 이는 각 핵에 대해 계산된 유도된 핵 변형과 적용된 막 변형의 비율로 정의됩니다.MATLAB 스크립트는 요청 시 람빙(lambing) 연구실에서 제공받을 수 있습니다. 마지막 단계로, 각 핵을 검증하며 변형 적용 중 분리되거나 손상된 세포의 측정값은 제외합니다. 실리콘 막의 두 가지 서로 다른 영역에 퍼진 MEF를 여기에서 보여주는 20%UNI 축 방향 변형 적용 전, 중, 후에 위상차 및 형광 현미경으로 촬영하였으며, 이는 손상이나 분리 없이 변형 적용에서 살아남은 세포의 유효한 핵이 포함된 성공적인 실험 사례입니다.이와 대조적으로, 여기에 표시된 세포들은 변형 적용 중에 수축하거나 부분적으로 탈착되었으며 분석에서 제외되었습니다. 왼쪽의 세포는 세포골격 손상과 핵 붕괴 징후를 보이며, 오른쪽의 세포는 변형 적용 중에 부분적으로 탈착되고 수축합니다. 이는 과도한 변형의 지표가 될 수 있습니다.여기 Lamin A/C 결핍 마우스의 다양한 meth 세포주 패널에서 정규화된 핵 변형(normalized nuclear strain)을 분석한 결과가 제시되어 있으며, 이 세포들은 공벡터(empty vector) 또는 야생형 lamin A를 이소성으로 발현하며, 이를 야생형 리터메이트의 meth와 비교하였습니다. 핵막 단백질인 Lamin A/C의 발현 소실은 정규화된 핵 변형의 증가를 초래합니다. 이는 핵 강성(nuclear stiffness)의 감소를 나타내며, 야생형 Lamin A를 재도입함으로써 부분적으로 또는 완전히 회복될 수 있습니다. 마이크로니들 조작 실험을 준비하려면, 35mm 글라스 바텀 세포 배양 접시를 저농도의 fibronectin으로 37°C에서 2시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 접시를 HBSS로 두 번 세척하고 2mL의 성장 배지를 접시에 추가하십시오.그런 다음 마우스 배아 섬유아세포를 0.05% trypsin으로 처리하여 유리 바닥 디시에 fibronectin을 코팅한 후, 2 mL의 성장 배지와 함께 분주합니다. 단일 부착성 비합류 세포를 얻기 위해 세포를 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 세포 염색을 위해 성장 배지에 MitoTracker 미토콘드리아 염색약과 Hoechst 핵 염색약을 첨가합니다. 이 성장 배지를 세포에 추가하고 인큐베이션을 진행합니다.다음으로, 상온에서 5분 동안 hank's buffered salt saline로 세포를 배양하여 세척합니다. 그 후, 이미징을 위해 25 millimolar HEPES가 포함된 phenol red free 성장 배지를 세포에 첨가합니다.마이크로니들 실험을 위해, 이전에 제작된 마이크로니들을 디지털 전하결합소자(CCD) 카메라가 장착된 도립 현미경과 연결된 마이크로 매니퓰레이터에 삽입하십시오. 마이크로니들을 단일 세포 근처에서 카메라 및 초점을 맞춥니다. 마이크로니들을 세포골격에 삽입하기 전의 단일 세포 이미지를 한 장 획득하십시오.위상차 이미지, hooks 3 3, 3 4 2 염색의 형광 이미지 1장, 그리고 미토콘드리아 염색의 형광 이미지 1장을 도립 현미경의 60 x 대물렌즈와 마이크로 조작기를 사용하여 촬영합니다. 마이크로 조작기를 이용해 마이크로니들을 핵 주변부에서 일정 거리 떨어진 세포질 내로 조심스럽게 삽입한 후, 위상차 이미지 1장, hooks 3 3, 3 4, 2 염색의 형광 이미지 1장, 그리고 미토콘드리아 염색의 형광 이미지 1장을 촬영합니다. 컴퓨터 제어 마이크로 조작기를 사용하여 마이크로니들을 초당 1 µm의 속도로 세포 주변부를 향해 특정 거리만큼 이동시키면서, 10초마다 자동으로 이미지를 획득합니다.마이크로니들이 세포 주변부의 특정 거리까지 이동함에 따라, 일관된 마이크로 조작을 달성하기 위해 컴퓨터를 통해 마이크로 매니퓰레이터를 제어해야 합니다. 마이크로니들을 제거한 후 최종적으로 이미지를 획득하며, 마이크로니들 조작 전, 중, 후에 획득한 핵과 세포골격의 형광 표지 특징 이미지들을 분석하여 작은 세포 내 영역의 변위를 계산합니다. 본 시연에서는 분석을 위해 직접 작성한 MATLAB 스크립트를 사용하지만, 다른 여러 가지 옵션도 선택 가능합니다.마이크로니들에 의해 생성된 변위를 측정하기 위한 MATLAB 스크립트는 Lambing 연구실에 요청하여 제공받을 수 있습니다. 이 MATLAB 프로그램은 정규화된 상호 상관 알고리즘(normalized cross correlation algorithm)을 사용하여 형광 표지된 특징점의 원래 위치와 새로 식별된 위치 사이의 이동량을 계산합니다. 이후 변위는 벡터 맵으로 표시되고 수치 값으로 저장됩니다.다음 단계는 결과로 얻은 변위 벡터 맵을 사용하여 matlab으로 세포골격 또는 핵 내의 평균 변위를 결정하는 것입니다. 먼저, 변형 적용 부위의 세포골격 내에서 3개 이상의 지점을 선택합니다. 변위 벡터 맵에서 평균 수치를 산출하여 마이크로니들 적용 중에 발생한 적용 부위 주변의 세포골격 변형량을 결정합니다.다음으로, 변형 적용 지점 근처의 핵 내부에서 3개 이상의 지점을 선택하여 평균값을 구합니다. 이 값은 마이크로니들 적용 지점 근처의 핵 변형량을 나타냅니다. 동일한 방법으로, 각각의 해당 영역에서 선택한 지점들을 통해 변형 적용 지점에서 떨어진 핵 및 세포골격의 변형도를 측정합니다.세포 내 힘 전달을 측정하기 위해 마이크로니들 조작 분석을 수행했습니다. 여기에는 파란색 핵 염색약과 MIT tracker green 미토콘드리아 염색약으로 표지된 섬유아세포의 위상차 이미지와 형광 이미지가 나타나 있습니다. 마이크로니들을 핵으로부터 일정 거리 떨어진 세포골격에 삽입한 후, 세포 주변부 방향으로 이동시켰습니다.세포골격 변형 전, 도중 및 후에 미토콘드리아의 변위를 추적하고, 해당 변위를 벡터로 표시하였습니다. 각 벡터는 원래 위치와 새롭게 확인된 위치 사이의 이동 거리로 계산된 변위를 나타냅니다. 이미지 강도가 낮거나 텍스처가 불충분한 영역은 분석에서 제외되었습니다.그 후, 대조군 섬유아세포와 섬유아세포 모두에서 변형 적용 지점으로부터 거리가 멀어짐에 따라 선택된 영역에서의 세포골격 및 핵 변위를 정량화하였습니다. 핵-세포골격 결합이 유지된 세포에서는 결합력이 세포 전체로 전달되어, 변형 적용 지점에서 멀어질수록 서서히 소멸하는 핵 및 세포골격 변형이 유도됩니다. 이와 대조적으로, 핵-세포골격 결합이 파괴된 세포는 적용 지점 근처에서 국소적인 변위를 보이며, 그보다 먼 곳에서는 유도된 변형이 거의 나타나지 않습니다.대조군 섬유아세포와 핵-세포골격 결합이 파괴된 섬유아세포 모두에서 마이크로니들 삽입 부위의 유사한 세포골격 변형 적용이 관찰되었습니다. 하지만, 다른 영역에서 유도된 핵 및 세포골격 변위는 핵-세포골격 결합이 파괴된 섬유아세포에서 대조군 세포보다 유의미하게 더 작았습니다. 따라서 변형 적용 부위에서 떨어진 곳의 세포골격 및 핵 변위 감소는 세포골격과 핵 사이의 강제 전달이 방해받았음을 나타냅니다.이 영상을 시청한 후에는 핵의 역학 및 핵과 세포골격 사이의 세포 내 힘 전달을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 기술을 사용하여 핵막 단백질의 돌연변이 효과나 발달 과정 또는 암 발생 중에 나타나는 핵막 조성의 변화를 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

우리는 세포 생존력, 증식 및 탄력성 측정 측면에서 배달 후 조사의 후유증과 결합 된 바늘이없는 워터젯 기술을 통한 세포 주입 방법을 제시합니다.

워터젯 기술을 통한 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포 주입

이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 세포핵에 기계적 힘을 직접 적용하고 동시 살아있는 세포 형광 이미징을 수행하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.

3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.

Mechano-Node-Pore 감지: 다중 파라미터 단일 셀 점탄성 측정을 위한 신속한 무표지 플랫폼

기계적 스트레스 하에서의 세포 거동에 대한 탐구는 세포 역학 및 기계생물학의 발전에 중추적인 역할을 합니다. 당사는 단일 세포에서 세포 내 신호의 포괄적인 분석과 제어된 기계적 자극을 결합하는 새로운 방법인 형광 마이크로피펫 흡인(fMPA) 기법을 소개합니다. 이 기술은 살아있는 세포 기계생물학에 대한 새로운 심층 연구를 조사합니다.

적혈구 메카노센싱을 조사하기 위한 형광 마이크로피펫 흡인 분석

배우세요 기판 스트레인 및 마이크로니들 조작을 활용한 계면 세포 핵의 기계적 성질 측정 방법을 통해 세포 핵 경도와 세포골격 간 힘 전달 메커니즘을 분석하는 생물물리학 기법을 익히세요.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

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