Name: 重组腺相关病毒载体的生产和滴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学习重组腺相关病毒载体的生产与滴定方法，通过HEK 293细胞转染和肝素柱层析纯化技术，实现高效、无毒的病毒制备流程。该方法可获得高纯度rAAV，适用于体内外基因递送研究。

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有关下述实验方案的图示说明，请参见图1。
安全提示：所有接触过组装病毒颗粒的材料均需使用Virkon溶液或其他合适的消毒剂进行消毒。
1. 质粒DNA储备液的制备（约2天）
<ol>
	<li>需要以下质粒1：
	<ul>
		<li>pRV1——包含AAV2的Rep和Cap序列</li>
		<li>pH21——包含AAV1的Rep和Cap序列</li>
		<li>pFdelta6——腺病毒辅助质粒</li>
		<li>包含由AAV2包装信号（反向末端重复序列，ITRs）两侧包围的重组表达盒的AAV质粒</li>
	</ul>
	</li>
	<li>pFdelta6应在Stbl2感受态细胞中培养以防止部分缺失，而pRV1和pH21可在DH5alpha感受态细胞中培养。如果在DH5alpha细胞中出现部分缺失，AAV质粒可在Stbl2细胞中培养。</li>
	<li>质粒DNA应具有高质量且无RNA污染。可使用以下酶切反应对质粒完整性进行检测：
	<ul>
		<li>pRV1——用XbaI酶切，产生7.5 kb和3.8 kb的条带</li>
		<li>pH21——用EcoRI酶切，产生4.5 kb、2.8 kb和0.2 kb的条带</li>
		<li>pFdelta6——用HindIII酶切，产生5.5 kb、3 kb、3 kb、2.3 kb和1.5 kb的条带</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
2. 转染用人胚胎肾293（Hek293）细胞的制备（2 - 3天）
<ol>
	<li>将两瓶80%融合度的Hek293细胞（来自150 cm2培养瓶）接种至五个直径15 cm的Nunc组织培养皿中。转染前细胞应达到70–80%融合度（接种后约48小时）。在含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素/100 μg/ml链霉素的低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中常规培养细胞。</li>
	<li>转染前3小时，吸除DMEM，更换为含5%胎牛血清的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）。</li>
</ol>
3. 病毒质粒的转染（转染约需1小时，孵育3天）
<ol>
	<li>为单批病毒制备以下试剂（5个15 cm组织培养皿）：
	<ul>
		<li>62.5 μg AAV质粒</li>
		<li>125 μg pFdelta6</li>
		<li>31.25 μg pRV1</li>
		<li>31.25 μg pH21</li>
		<li>1650 μl 2.5 M CaCl2</li>
		<li>12 ml dH2O</li>
	</ul>
	</li>
	<li>在II级生物安全柜中，将转染混合物经无菌滤器过滤至50 ml离心管中。</li>
	<li>在涡旋混合溶液的同时，迅速加入13 ml 2× HEPES缓冲盐溶液（pH 7.05）。盖上50 ml离心管盖子，继续涡旋15秒。静置1分45秒，应形成细小的白色沉淀。</li>
	<li>将5 ml转染液轻柔地加入每个15 cm组织培养皿中。轻轻摇晃培养皿以混匀，然后放回培养箱。</li>
	<li>转染后16小时，吸除IMDM培养基，并更换为DMEM培养基。</li>
</ol>
4. 细胞裂解及重组腺相关病毒（rAAV）的收集（2 小时）
<ol>
	<li>转染后 72 小时，从细胞培养板中移除培养基并丢弃。所有废弃物均应使用 Virkon 溶液或其他合适的消毒剂处理。</li>
	<li>用预热的 1×磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）轻柔洗涤细胞。</li>
	<li>每块培养板中加入 25 ml 预热的 PBS，用细胞刮轻轻刮下细胞，并将悬液收集至 50 ml 离心管中。</li>
	<li>在 800 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用每块组织培养板 10 ml 的 150 mM NaCl、20 mM Tris（pH 8.0）重悬。分装至两个 50 ml 离心管中。</li>
	<li>在 dH2O 中新鲜配制 10% 脱氧胆酸钠溶液。每管加入 1.25 ml，使终浓度为 0.5%。加入苯并核酸酶（benzonase nuclease），使其终浓度为每毫升 50 单位。充分混匀各管。</li>
	<li>在 37°C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>在 3000 × g 条件下离心 15 分钟，去除细胞碎片。将上清液转移至新的 50 ml 离心管中，确保完全去除所有细胞碎片，以防止肝素柱堵塞（参见步骤 5）。此时，样品可在继续实验前于 -20°C 保存。我们已将样品在 -20°C 保存数周，未观察到感染性下降。</li>
</ol>
5. rAAV 的肝素柱纯化（2 - 3 小时）
<ol>
	<li>使用蠕动泵安装HiTrap肝素柱，以便在步骤5.2至5.4中溶液以每分钟1 ml的流速通过柱子。必须确保无气泡进入肝素柱中。</li>
	<li>用10 ml 150 mM NaCl、20 mM Tris、pH 8.0缓冲液平衡柱子。</li>
	<li>将50 ml病毒溶液上样至柱子，并使其流过。</li>
	<li>用20 ml 100 mM NaCl、20 mM Tris、pH 8.0缓冲液洗涤柱子。</li>
	<li>使用5 ml注射器，继续用1 ml 200 mM NaCl、20 mM Tris、pH 8.0缓冲液洗涤柱子，随后用1 ml 300 mM NaCl、20 mM Tris、pH 8.0缓冲液洗涤。弃去流出液。</li>
	<li>使用5 ml注射器并施加轻柔压力，通过以下步骤将病毒从柱子中洗脱：
	<ul>
		<li>1.5 ml 400 mM NaCl、20 mM Tris、pH 8.0</li>
		<li>3.0 ml 450 mM NaCl、20 mM Tris、pH 8.0</li>
		<li>1.5 ml 500 mM NaCl、20 mM Tris、pH 8.0</li>
		<li>将上述洗脱液收集至一个15 ml离心管中。</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
6. 重组腺相关病毒的浓缩与无菌过滤（1 小时）
<ol>
	<li>使用截留分子量为100,000的Amicon ultra-4离心过滤装置浓缩病毒载体。将4 ml柱洗脱液加入浓缩器中，在室温下以2000 × g离心2分钟。弃去滤过液，将剩余病毒溶液重新加载至浓缩器中并重复离心。浓缩后的体积应约为250 μl。若浓缩体积明显超过此值，弃去滤过液后继续以1分钟为间隔进行离心，直至浓缩体积约为250 μl。</li>
	<li>向病毒液中加入250 μl PBS，使最终体积为500 μl，并从浓缩器中取出。</li>
	<li>通过直径13 mm、孔径0.2 μm的注射器滤器过滤病毒载体。病毒载体应分装后于-80°C保存，直至使用。</li>
</ol>
7. 病毒毒价测定（3 天）
这需要一个在HEK293细胞中具有活性的启动子来驱动报告基因或可免疫细胞化学检测的基因产物。当构建的载体不适用于HEK293细胞时，可使用其他细胞系或原代细胞培养。
<ol>
	<li>通过接种HEK293细胞，准备18个经多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片或18孔Nunc培养板，使细胞融合度达到40–50%。若需滴定Cre依赖性rAAV，则使用稳定表达Cre重组酶的HEK293细胞2。</li>
	<li>用AAV载体的系列稀释液感染每个孔（图2A）。每个稀释度使用3个孔。我们通常直接将病毒加入各孔中。</li>
	<li>感染72小时后，在培养基中加入等体积的4%多聚甲醛（PFA），使终浓度为2% PFA，室温固定10分钟，以固定HEK293细胞。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞3次，再用dH2O漂洗，然后取出盖玻片。</li>
	<li>计数稀释倍数最高但仍含有感染细胞的三个孔中被转导的细胞数量，计算其平均值，并乘以稀释倍数，得到每微升中的感染单位数（图2B）。</li>
</ol>
8. 预期结果
图2B展示了转导了编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP）病毒的HEK293细胞。我们通常可获得约6 × 106 个感染性颗粒/微升的稳定滴度。我们常规将这些载体用于成年啮齿类动物脑部的立体定位注射，该技术可实现特定脑区的基因表达2。为了将这种区域特异性与细胞类型选择性基因表达相结合，我们将Cre重组酶依赖型rAAV注射到Cre转基因小鼠的靶脑区2。图2C–E展示了将编码eGFP的Cre依赖型rAAV立体定位注射至成年小清蛋白-Cre转基因小鼠不同脑区的示例3。
<img alt="HEK-293细胞转染示意图，AAV载体生产过程的各个步骤，包括纯化。" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 重组AAV（rAAV）生产的流程示意图。1.) 将HEK-293细胞接种并培养至70–80%汇合度。2.) 准备AAV载体质粒和辅助质粒，并将其转染至HEK-293细胞中。3.) 转染后16小时更换为DMEM培养基，继续培养HEK-293细胞56小时。4.) 收集HEK-293细胞并进行裂解，通过离心将重组AAV载体与细胞碎片分离。5.) 病毒颗粒经肝素柱纯化后进行浓缩和除菌。6.) 将HEK-293细胞接种于24孔板，用系列稀释的AAV载体感染细胞，以测定感染性病毒单位数量。
<img alt="显示大鼠脑切片、细胞培养和实验设置稀释图表的荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. rAAV1/2 的滴定与体内应用。（A）用于测定病毒滴度的 Hek293 细胞实验设置。Hek293 细胞用 rAAV 的系列稀释液转导。C，未感染的对照组；N，1 μl 未稀释的病毒原液。（B）感染表达 eGFP 的 rAAV 的 Hek293 细胞。（C-E）在立体定位注射 Cre 激活型 rAAV 后，病毒 eGFP 的表达仅局限于表达 Cre 的神经元，位于不同脑区的钙结合蛋白-Cre 转基因小鼠中。示例图像显示了（C）丘脑网状核和苍白球、（D）齿状回以及（E）海马 CA1 区的 GFP 免疫反应性。DG，齿状回；RT，丘脑网状核；GP，苍白球。比例尺：B，500 μm；C，100 μm；D，100 μm；E，500 μm。

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</ol>

无利益冲突声明。

重组腺相关病毒（rAAV）载体在动物体内研究中正变得越来越重要。本文介绍了一种简单且低成本的rAAV生产方案，通过避免将病毒生产外包给公司所带来的高昂费用，有助于推动这一有用载体的广泛应用。该方案（基于参考文献1）描述了制备嵌合型rAAV1/2载体的方法，其中包含来自两种亲本血清型的衣壳蛋白，且比例相等4。通过肝素柱结合纯化rAAV载体依赖于AAV2衣壳蛋白的表达，但该方法也可与其他非AAV1血清型联合使用。此外，已有报道表明AAV6也可结合肝素，尽管亲和力较低，因此有可能利用本方案中的肝素柱进行纯化5,6。但需要注意的是，其他血清型在肝素柱洗脱时需要不同的NaCl浓度5,7。
rAAV基因组的包装在4.1至4.9 kb之间效率最佳，当基因组长度达到5.2 kb时，包装效率显著下降8。这一包装容量限制可被视为rAAV系统最主要的缺点，因为外源基因表达的细胞类型特异性调控通常依赖较大的顺式作用元件，而这些元件无法被容纳于体积较小的AAV颗粒中。为了克服因接近AAV包装极限而导致的低滴度批次问题，我们采用将两个分别浓缩至250 μl的病毒批次合并为一个500 μl的批次，而不是按照步骤6.3所述加入PBS。通过结合Cre驱动小鼠与条件性rAAV表达盒（见下文），可实现可靠的细胞类型特异性转导，从而避免逼近包装容量的限制。
值得注意的是，尽管本方案力求提供易于遵循的高滴度重组腺相关病毒（rAAV）制备说明，但其依赖AAV2衣壳蛋白组分以实现肝素亲和层析纯化。非AAV2血清型必须采用其他纯化方法9。肝素柱纯化的一个优势在于，据信其所得AAV载体的感染效率高于氯化铯梯度离心法所获得的载体10。然而，该方法也存在一些缺点。例如，其他可结合肝素的蛋白质也可能存在于纯化的病毒制剂中。尽管肝素纯化载体的嗜性可能受载体滴度影响10，但我们采用Cre依赖性激活AAV介导的外源基因表达策略，可特异性靶向兴奋性20或抑制性神经元（图2），且该方法不受滴度影响。肝素柱纯化的另一种替代方案是使用碘克沙醇密度梯度离心法，该方法相比氯化铯梯度可获得更高的病毒滴度和更纯净的制备物10。此方法还可与肝素柱纯化联合使用，以获得纯度超过99%的载体11。因此，各研究团队需根据其特定的下游应用，慎重选择最适宜的病毒纯化方法。
该方案最常见的问题是病毒滴度偏低。根据我们的经验，这通常可归因于转染效率低或病毒从肝素柱上洗脱不完全。所有转染试剂在转染前应恢复至室温，并应在每个实验室中通过预实验确定最佳转染条件。其他转染方法（如脂质体转染试剂）虽然效率很高，但成本可能过高。此外，肝素柱洗脱液的浓度和pH值对于在不损伤病毒颗粒的前提下实现病毒的完全洗脱至关重要。另一个重要注意事项是，包装细胞必须能够良好地贴附于细胞培养皿表面。如果在操作过程中细胞发生脱落，建议终止实验并重新复苏一管新的细胞。
通过精确定位解剖部位以及选择动物的发育阶段，可轻松实现啮齿类动物中外源基因表达的时空控制。已有研究表明，腺相关病毒（AAV）介导的高效基因转导可在子宫内完成12,13。在成年动物大脑中，通过立体定位注射重组腺相关病毒（rAAV）颗粒后，感染区域的范围不仅可通过调整病毒滴度，还可通过改变注射参数，从非常小的靶向区域调节至更大范围。这些参数包括注射体积、注射速度，以及在病毒悬液中添加多元醇甘露醇14。此外，甘露醇也可用于在系统性注射rAAV后增强多种组织的感染效率15。
rAAV 的包装容量（约 4.7 kb）可能是限制这些病毒载体表达基因的最主要因素。然而，最近的研究表明，通过将较大的基因或表达盒拆分到不同的 rAAV 载体中，并引入一段桥接序列，可在病毒颗粒共同感染同一细胞时启动基因表达，从而部分克服这一限制。 16使用自互补rAAV载体也可显著提高rAAV载体所携带基因的表达水平 17立体定位注射rAAV载体是一种快速、经济且高效的方法，可实现特定脑区的基因表达。结合2nd 生成RNA干扰策略 18 rAAV 还可用于特定脑区的基因敲低。通过将 rAAV 与 Cre 转基因小鼠或细胞类型特异性启动子结合，可实现神经环路和细胞类型特异性的基因表达，从而以高空间分辨率进行遗传操作 2,19-21，而为rAAV配备四环素系统（tet系统）等装置可实现对病毒介导的基因表达的时间调控 22,23这些实例展示了这些载体巨大的组合潜力，并预示着未来几年基于rAAV的研究将迅速增加。

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 离心滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>苯并酶核酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td>10567014</td><td>添加 10% 胎牛血清和 10 单位/毫升青霉素/100 &amp;#x03BC;g/mL 链霉素</td></tr><tr><td>Hek293 细胞</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>CRL-1573</td><td>使用代次小于 30 的细胞</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲盐水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap 肝素柱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s 改良 Dulbecco&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>12440-053</td><td>添加 5% 胎牛血清</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>每次制备时需新鲜配制</td></tr><tr><td>15 cm 细胞培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>Stbl2 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>10268-019</td><td></td></tr><tr><td>卫可溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9821357</td><td>丢弃至下水道前需过夜浸泡以完成消毒</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1.&lt;/strong&gt; 本实验方案所需特定试剂</td></tr></tbody></table>

重组腺相关病毒载体的制备与滴定

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

近年来，重组腺相关病毒载体（AAV）在 体内 在动物中进行的研究，目前也正在人类临床试验中进行测试。野生型AAV是细小病毒科（parvoviridae）中一种非致病性病毒，天然不具备复制能力。这类载体具有广泛的转导谱、较低的免疫反应，以及能够实现强大且持久的外源基因表达，因此已成为一种广受欢迎且用途广泛的工具，用于 体外 和 体内 基因递送。rAAVs 可在实验室中简便且低成本地制备，并因其良好的安全性特征，通常被归为较低安全等级。本文描述了一种制备和滴定嵌合型 rAAVs 的方法，该病毒载体包含 AAV1 和 AAV2 的衣壳蛋白。使用此类嵌合型载体可结合两种亲本血清型的优点，例如高滴度病毒储备（AAV1）以及通过亲和层析进行纯化（AAV2）。AAV1 和 AAV2 是所有 AAV 血清型中研究最为深入的两种，各自均具有广泛的感染谱。本文所述的嵌合型载体应兼具 AAV1 与 AAV2 的感染特性，因而预期可感染多种组织，包括神经元、骨骼肌、胰腺、肾脏等。本文所采用的方法利用肝素柱纯化，该方法被认为相较于其他纯化方法（如氯化铯梯度离心）可获得更高的病毒滴度和更纯净的病毒制备物。此外，我们还描述了如何对这些载体进行快速简便的滴定，以准确测定所产生感染性病毒颗粒的数量。

重组腺相关病毒（rAAVs）载体在动物体内研究中正变得越来越重要。in vivo 实验中，我们描述了如何在实验室中生产rAAVs，以及如何对这些载体进行滴定，以准确测定所产生的感染性病毒颗粒数量。

近年来，重组腺相关病毒载体（AAV）在动物体内研究中日益重要，目前也正被用于……

本实验的目的是制备重组腺相关病毒（rAAV），以实现高效的体外或体内转基因递送。首先将编码转基因和病毒基因的DNA质粒转染至HEK293细胞中，随后刮取转染后的细胞并进行裂解，以收获组装好的rAAV病毒颗粒。接下来，通过肝素柱纯化从细胞裂解液中纯化重组腺相关病毒（R AAVs）。最后一步是浓缩病毒原液。最终结果表明，通过免疫荧光显微镜检测，病毒介导的外源基因表达具有强效且持久的效果。此时，重组腺相关病毒（RA AAVs）已可用于体外或体内实验。与氯化铯梯度纯化等其他纯化方法相比，本技术的主要优势在于无需使用超速离心机或有毒物质，同时可获得更高产量和更纯的病毒载体。在开始本方案之前，按照书面方案中所述的方法制备高质量的质粒、DNA 储液并检测其完整性。开始时，将两个 80% 汇合度的 150 平方厘米 HEC 293 细胞培养瓶中的细胞接种至五个 15 厘米直径的组织培养皿中进行培养。使用含 10% 胎牛血清的低糖标准 DMEM 培养基，在接种后约 48 小时（即转染当天），转染前 3 小时细胞应达到 70% 至 80% 的汇合度。移除 DMEM，并替换为含有 5% 胎牛血清的冰冻改良 Cove's Dobe CHO'S 培养基或 IMDM 培养基。按照书面实验方案制备单批病毒的转染混合物。在 II 级细胞培养生物安全柜中，将转染混合物经无菌滤器过滤至一个 50 毫升离心管中，同时快速涡旋振荡，立即加入 13 毫升的 2 倍 HEPES 缓冲盐水。盖上50毫升离心管的管盖，继续涡旋震荡15秒。静置1分45秒，应有白色沉淀形成。向每个15厘米组织培养皿中轻柔加入5毫升转染溶液。孵育16小时后轻轻晃动培养板以混匀。移除IMDM，替换为DMEM，继续孵育细胞。收集R AAVs。从细胞培养板中移除培养基。转染72小时后，废弃的培养基必须用Vercon溶液或其他合适的消毒剂处理。用预热的磷酸盐缓冲液轻轻洗涤细胞一次。向每个培养皿中加入 25 毫升预热的 PBS，用细胞刮轻轻刮下细胞。将细胞悬液收集至 50 毫升离心管中，在 800 × g 条件下离心 10 分钟以沉淀细胞。弃去上清液，重悬细胞沉淀。每份组织培养板中加入10毫升150毫摩尔氯化钠缓冲液，将悬液分装至两个50毫升离心管中。接着用新配制的10%脱氧胆酸钠溶液处理细胞。然后加入苯甲酸核酸酶以去除核酸。充分混匀各管后，在37摄氏度下孵育1小时。孵育结束后，以3000 × g离心15分钟，去除细胞碎片。将上清液转移至新的50毫升离心管中，确保完全去除所有细胞碎片，以防止肝素堵塞。用于纯化重组腺相关病毒（rAAVs）的层析柱。将10毫升氯化钠缓冲液加入注射器中，并使用蠕动泵安装高吸附力肝素层析柱，使溶液以每分钟1毫升的流速流经层析柱。必须确保没有气泡进入肝素层析柱。用10毫升150毫摩尔/升氯化钠缓冲液平衡层析柱。将50毫升病毒溶液上样至层析柱，并让溶液流过。随后用20毫升100毫摩尔/升氯化钠缓冲液洗涤层析柱。使用一个5 mL的注射器。继续用1 mL的20 mmol/L氯化钠缓冲液洗涤层析柱，随后用1 mL的300 mmol/L缓冲液洗涤。弃去流出液。使用5毫升注射器和轻柔压力，通过逐步增加高盐洗脱缓冲液将病毒从层析柱中洗脱下来。用15毫升离心管收集洗脱液。使用截留分子量为100,000的Amicon Ultra 4毫升超滤离心管浓缩载体。将四毫升柱洗脱液加入浓缩管中，在2000 × g 条件下离心两分钟。重复离心后，浓缩体积应约为250 µL。弃去滤过液，并将剩余的病毒溶液重新加载至浓缩管中。加入 250 微升 PBS 至病毒中，终体积为 500 微升，并从浓缩装置中取出。最后一步，将载体通过直径为 13 毫米、孔径为 0.2 微米的注射器滤器过滤，以获得更纯净的病毒原液。准备 18 个聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片，接种 HEC 293 细胞，使其融合度达到 40% 至 50%，用于滴定 Cre 依赖型 RAAV。使用稳定表达Cree重组酶的HEC 293细胞。按照书面实验方案所述，对每种稀释度的RAAV载体，分别感染三个孔。感染72小时后，向培养基中加入等体积的4%多聚甲醛，在室温下固定HEC 293细胞10分钟。随后用PBS洗涤细胞三次，再用蒸馏水洗涤一次。然后使用封片介质，将盖玻片置于载玻片上。细胞面朝下。从稀释倍数最高但仍含有感染细胞的三个孔中计数有凹槽的细胞数量。计算这些孔的平均值，并乘以稀释倍数，得到每微升中的感染单位数。图中显示的是转导了编码增强型绿色荧光蛋白病毒的HEK 293细胞。通常可获得约每微升6×10⁶个感染性颗粒的稳定滴度。图中展示的是将编码绿色荧光蛋白的Cree依赖型rAAV通过立体定位注射至成年副肌动蛋白Cree转基因小鼠不同脑区的示例。病毒介导的绿色荧光蛋白表达仅局限于各靶向区域中表达Cree的神经元。在此示例中，可见绿色荧光蛋白免疫反应性出现在丘脑网状核和苍白球、齿状回以及海马的CA1区。一旦掌握该技术，病毒生产可在七至八天内完成，若操作得当，滴定则需三天。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

重组腺相关病毒载体的生产和滴定

介绍了一种生成高容量腺病毒载体的方案，该载体缺失所有病毒编码序列。载体基因组中转基因的克隆基于归巢核酸内切酶技术。病毒在贴壁生长或悬浮培养的生产细胞中的扩增依赖于提供病毒基因反式表达的辅助病毒。...

基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内...

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

本文提供了一种利用细胞工厂中培养的贴壁型HEK 293细胞及亲和层析纯化方法大规模制备研究级腺相关病毒（AAV）载体的详细操作流程。该方案可稳定获得 &gt;1 × 1013 拷贝/mL...

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统进行腺相关病毒（AAV）2载体的生产与纯化工艺开发

重组腺相关病毒（rAAV）被广泛用于临床和临床前基因递送。rAAV 一个尚未受到足够重视的用途是，无需纯化即可高效转导培养细胞。针对初次接触 rAAV...

使用未纯化重组腺相关病毒载体在培养细胞中进行转基因表达

腺相关病毒在悬浮细胞培养中生产，并通过两次碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本方法包含多个步骤，可提高病毒总产量，降低病毒沉淀风险，并进一步浓缩最终病毒产物。预期最终滴度可达 1012 病毒颗粒/mL，适用于临床前的 体内...

用于体内应用的腺相关病毒悬浮培养生产及碘克沙醇密度梯度离心纯化

本文介绍了一种基于悬浮培养HEK293细胞的腺相关病毒（AAV）生产方案，该方法利用商业供应商提供的可用于研究目的的组分，减少了病毒载体生产所需的时间和劳动投入。...

利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

腺相关病毒（AAV）载体基因组拷贝数的精确定量至关重要，但目前尚未建立标准化的实验方案。本方案描述了一种经过验证的方法，用于制备纯化的AAV样品，并通过数字滴定聚合酶链式反应（dd_PCR）可靠地定量病毒基因组滴度。...

通过数字滴定聚合酶链式反应定量纯化载体样品中的腺相关病毒基因组

学习重组腺相关病毒载体的生产与滴定方法，通过HEK 293细胞转染和肝素柱层析纯化技术，实现高效、无毒的病毒制备流程。该方法可获得高纯度rAAV，适用于体内外基因递送研究。

重组腺相关病毒载体的制备与滴定

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