Name: Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per lanalisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Scopri l'auto-assemblaggio cellulare per creare anelli tessutali 3D da cellule muscolari lisce. Questo metodo consente test meccanici rapidi e analisi del contributo della matrice extracellulare.

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Gli autori ringraziano Neil Whitehouse (WPI, Machine Shop Higgins) per la sua assistenza con lavorazione CNC. Inoltre, vorremmo ringraziare Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) per il suo aiuto con MATLAB di programmazione, così come Kate bevande e Giuseppe Cotnoir (WPI Academic Technology Center) per l&#39;assistenza con Camtasia. Sophie Burke e Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center), a condizione supplementare filmati video. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (R15 HL097332), il Massachusetts Medical School-WPI Research Initiative pilota, l&#39;American Heart Association (borsa di studio di laurea a JZH), e Worcester Polytechnic Institute (Undergraduate Research Fellowship Estate a JZH e istituzionali start-up fondi per MWR).

1. Cellula semina fabbricazione dello stampo Iniziare mediante fresatura da un 1 / 2 "pezzo spesso di policarbonato per creare 15, a fondo tondo, pozzi anulare con diametro del perno di centraggio di 2 mm. I canali fresato sono 6 mm di profondità e 3,75 millimetri di larghezza. Pulire e asciugare lo stampo in policarbonato per rimuovere eventuali residui di plastica dal processo di fresatura. Mix polidimetilsilossano (PDMS) con un rapporto 10:1 (w / w) di base a catalizzatore, Degas per rimuovere tutte le bolle d'aria, e versare sopra lo stampo in policarbonato. Degas di nuovo per rimuovere eventuali bolle rimanenti, e la cura in forno a 60 ° C per 4 ore. Una volta indurito, rimuovere con attenzione il modello da PDMS lentamente peeling dal policarbonato, lavare con acqua e sapone, e autoclave. Anche autoclave una soluzione di agarosio per cento due (w / v) disciolto in Dulbecco modificato (DMEM). Posizionare il modello PDMS su una superficie piana e riempire con fuso aga è aumentato del primo pipettaggio agarosio in ciascuno dei stampi posta al centro, e poi pipettaggio nello spazio intorno ad esso. Lasciare solidificare l'agarosio (circa 15 minuti), poi capovolgere lo stampo per liberare l'agarosio dal PDMS. Tagliare l'eccesso di agarosio di tutto ognuno dei pozzi, i pozzi e il luogo di agarosio in 12-pozzetti. 2. Coltura cellulare e semina anello Aggiungi coltura cellulare media (DMEM con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina) intorno alla parte esterna dello stampo agarosio, senza coprire la parte superiore degli stampi. Posizionare le piastre nell'incubatore e permettere loro di equilibrare per circa 15 minuti mentre preparate le cellule. Al 90% confluenza, trypsinize topo cellule muscolari lisce aortiche (rSMCs) e risospendere ad una concentrazione di 5x10 6 cellule / ml. Pipettare 100 l di sospensione cellulare in ciascuno dei anulare agarosio pozzi, con un movimento circolare per applicare le cellule in ogni pozzetto. contenuto "&gt; Assicurarsi che gli scaffali sono incubatore livello, quindi posizionare le piastre nell'incubatrice e permettere loro di riposare per 24 ore. medium Cambio ogni due giorni successivi aspirando i media di tutto il bene, e ri-riempire ogni bene fino alla agarosio bene è completamente sommerso. 3. Tessuto raccolta anello e misure di spessore A conclusione della cultura, rimuovere l'anello dallo stampo agarosio facendolo scorrere sopra la parte superiore del montante centrale. Posizionare l'anello in una piccola scatola di Petri con tampone fosfato (PBS), centro del campione, e acquisire un'immagine utilizzando un sistema di imaging digitale. Utilizzare un programma di analisi delle immagini per il rilevamento dei bordi e misurare lo spessore dell'anello in 4 posizioni (alto, basso, sinistra e destra) lungo la sua circonferenza. Calcolare il valore medio spessore (t) per ogni singolo anello, e usare questo valore per calcolare la sezione trasversale(2π (t / 2) 2). 4. Prove meccaniche di anelli Impostare la macchina di prova a trazione (Instron EPS 1000) in posizione orizzontale. Collegare un 1N ± 1mn cella di carico e personalizzati impugnature filo sottile (creato da piegare filo di acciaio inossidabile). Montare l'anello di campione sulle due impugnature filo sottile. Estendere le prese fino a 5 mN carico tara è applicata al campione. Inserire la sezione trasversale (in base a misurazioni di spessore) e registrare il tratto utile. Pre-ciclo gli anelli 8 volte tra il carico di stress tara e 50 kPa ad una velocità di 10 mm / min. Dopo l'ottavo pre-ciclo, tirare al fallimento a 10 mm / min. Il fallimento è notato come una diminuzione della forza del 40% da una misura all'altra. Per ogni campione anello, misurare lo sforzo finale trazione (UTS) e tensioni fallimento e calcolare il massimo tangente modulo (MTM) a partire dai dati acquisiti. 5. Tessuto anellotaggio per fabbricare tubi di tessuto Portaprovette personalizzati sono lavorati da rotondo 5 centimetri dischi di policarbonato con ritagli rettangolari (2 cm x 3 cm). Praticare i fori filettati con questi dischi per consentire a due titolari di essere avvitati insieme. Autoclave i titolari tubo personalizzato e quindi il trasferimento al mobile biosicurezza e metterlo in un piatto vuoto Petri. Usare le forbici chirurgiche per tagliare le estremità dei tubi di 1,9 mm di diametro in silicone con un angolo per creare bordi smussati, e poi in autoclave i tubi in silicone. Mentre i tubi sono stati sterilizzati in autoclave, riempire una piastra di Petri con i media. Rimuovere gli anelli dai pozzi agarosio e metterli nella scatola di Petri con i media. Luogo in autoclave i tubi di silicone nello stesso piatto di Petri per bagnare prima dell'uso. Utilizzare pinze per mettere un fine smussata di un tubo di silicone al centro di un anello e far scorrere l'anello sul tubo in silicone. Ripetere con il numero desiderato di riNGS. Far scorrere gli anelli in contatto uno con l'altro da delicatamente spingendo successivamente in entrambe le direzioni lungo il tubo. Questo metodo può essere utilizzato per gli anelli raccolti dopo un solo giorno in coltura. Una volta che gli anelli sono montati, allineare i tubi di silicone all'interno della titolari policarbonato e avvitare le due parti del titolare insieme. Posizionare il supporto in un piatto di 100 mm di Petri e aggiungere 55 ml multimediali. Scambio dei media ogni 3 giorni per la durata della cultura. Per rimuovere i tubi di tessuto, rilasciare i tubi in silicone dal supporto in policarbonato e utilizzare pinze per far scorrere i tubi di tessuto dal tubo in silicone e in una piastra di Petri riempite con PBS. 6. Rappresentante dei risultati: Quando il protocollo è eseguita correttamente, le cellule si aggregano formando anelli di tessuto con un diametro interno uguale al diametro del perno stampo corrispondente entro 24 ore. I bordi lisci ad anello sono di solito in apparenza e (se cultured su una superficie piana), sono di spessore uniforme lungo l'intero perimetro. Gli anelli di tessuto sono facili da gestire e possono essere rimossi dai loro pozzi per le successive analisi meccaniche e istologiche (v., in Gwyther et al. 2011, 8). Anello morfologia del tessuto, la composizione della matrice, e le proprietà meccaniche variano a seconda del numero e del tipo di cellule inseminate. Risultati rappresentativi da anelli di tessuto a base di diversi tipi di cellule, semina le condizioni, e la lunghezza della cultura sono riportati nella tabella 1. Due anelli mm ID creato da 5x10 5 rSMCs esibito un carico di rottura superiore a quello anelli creati dalla nostra precedentemente pubblicato con 2 anelli mm (fatto da 6.6x10 5 rSMCs). Simili alle cellule di ratto, cellule muscolari lisce (HSMC) 8 facilmente aggregate per formare il tessuto Anelli, che conteneva una grande quantità di collagene dopo soli 14 giorni in coltura (dati non riportati). Cellule staminali mesenchimali (hMSC) anche aggregati e formano anelli coesa, ma lacked resistenza meccanica e si è rotto durante le fasi iniziali di precycling prove di trazione uniassiale. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Numero di cellule </td><td> Spessore (mm) </td><td> Lunghezza della cultura (giorni) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Il mancato ceppo (mm / mm) </td></tr><tr><td> rSMC anelli </td><td> 6 </td><td> 660.000 </td><td> 0,94 ± 0,12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0,50 ± 0,08 </td></tr><tr><td> rSMC anelli </td><td> 4 </td><td> 500.000 </td><td> 0,53 ± 0,02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0,88 ± 0,05 </td></tr><tr><td> HSMC anelli </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,51 ± 0,05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0,92 ± 0,08 </td></tr><tr><td> hMSC anelli </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,40 ± 0,07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tabella che mostra i parametri della cultura e delle proprietà meccaniche dei 2 anelli millimetri generate da diversi tipi di cellule, le concentrazioni di semina, e durate la cultura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) Schema del processo di generazione dei tessuti anello. (B) Personalizzato stampo in policarbonato con fresata pozzi anulare. Diametri postale centrale sono 2 mm. (C) PDMS modello dopo che è stato staccato dallo stampo in policarbonato. (D) anello di tessuto aggregati in coltura in uno stampo agarosio con un post 2 mm. (E) Due millimetri di diametro anello di tessuto in PBS. Barre di scala = 6 mm (B, C) e 2 mm (D, E). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Trama rappresentante della curva produttori sforzo-deformazioneced da prove di trazione uniassiale.

<ol><li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li>
<li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li>
<li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li>
<li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods%2C+tori%2C+and+honeycombs%3A+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li>
<li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li>
<li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Tissues.+Organs%22%5BJournal%5D)">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li>
<li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li>
<li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li>
<li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li>
<li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li>
<li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Recentemente, c&#39;è stato un crescente interesse a base di cellule o &quot;patibolo-less&quot; metodi di ingegneria tissutale per affrontare alcuni dei limiti degli approcci tessuto ponteggio a base di ingegneria. Dato che derivati ​​dalle cellule dei tessuti vengono create dalle cellule e la matrice che producono, che contengono intrinsecamente molto più alta densità di cellulari, non contengono materiali esogeni, e può essere realizzato interamente in cellule umane e proteine. Innesti vascolari costituito da cellule umane possono raggiungere notevoli resistenze meccaniche in assenza di ponteggi esogeni (per esempio, pressioni di scoppio 3400 mmHg rispetto a 1600 mmHg per l&#39;uomo safene) 12. Anche se i tessuti vascolari a base di cellule mostrano densità cellulare migliorata e resistenza meccanica, metodi di fabbricazione più recente (come &quot;foglio-based engineering&quot; 3,4,12 o &quot;bioprinting&quot; 5,13) richiedono periodi di cultura estesa (&gt; 3 mesi) o attrezzature specializzate per la costruzione del tessuto 3D. I derivati ​​dalle cellule del tessuto anello method qui descritto consente una rapida cellulari auto-assemblaggio a formare solide costruzioni tessuto 3D in un breve periodo di tempo e senza l&#39;uso di attrezzature specializzate. Questo protocollo in dettaglio la procedura che abbiamo sviluppato per creare 2 millimetri di diametro interno ratto liscia derivati ​​dalle cellule del tessuto muscolare anelli. Nel presente esempio, anelli di tessuto sono stati coltivati ​​per 7 giorni (poi coltivate per altri 7 giorni per la fusione anello e la formazione del tubo). Tuttavia, 2 ratti mm (e umano) delle cellule muscolari lisce anelli possono essere rimosse dai pozzi e sono abbastanza coesa per la gestione (ad esempio, il trasferimento su tubi in silicone) già un giorno dopo la semina delle cellule. Inoltre, gli anelli di tessuto robusto con diversi diametri interni (2, 4 e 6 mm) possono essere creati con questo metodo semplicemente cambiando il diametro posto di stampo originale in policarbonato. 8 Abbiamo anche recentemente modificato la progettazione dello stampo in policarbonato per consentire cinque 2 millimetri pozzi semina per essere gettati in un unico multi-bene agarosio camera, cheutilizza meno PDMS e agarosio, e si inserisce in un pozzetto di un 6-pozzetti (dati non riportati). Le variazioni di diametro posta, la larghezza della semina bene, il raggio di curvatura del fondo arrotondato, il numero di pozzetti semina, o la profondità dei pozzi di semina possono essere modificati semplicemente cambiando le specifiche del file CAD per CNC lavorazione dello stampo in policarbonato. Infine, un unico stampo in policarbonato può essere usato per fabbricare un numero illimitato di modelli PDMS, PDMS e ogni template può essere pulito, autoclave e riutilizzati decine di volte. Oltre a modificare la dimensione degli anelli di tessuto, abbiamo fatto gli anelli da molti tipi di cellule diverse, tra cui: SMC primari di ratto (Applicazioni Cell, R354-05), primaria SMC umano coronarica (Lonza, CC-2583), umano primario fibroblasti dermici 11 (dono generoso del dottor George Pins, WPI Dipartimento di Ingegneria Biomedica), fibroblasti di polmone di ratto (RFL-6, ATCC CCL-192), e le cellule staminali mesenchimali (Lonza, PT-2501). Ognuno di questi tipi di aggregati cellulari e contratti di tutto il centro messaggi per formare anelli di tessuto, anche se l&#39;organizzazione cellulare, composizione ECM, e le proprietà meccaniche dei costrutti variano per ogni tipo di cellula. I parametri di semina per ciascun tipo di cella deve essere empiricamente determinato sulla base della dimensione delle celle e la loro capacità di aggregare. Pertanto, mentre questo sistema di creazione di cellule derivate anelli tessuto è estremamente versatile, il protocollo può avere bisogno di piccoli aggiustamenti formazione di tessuto ottimale con diversi tipi di cellule. Anello geometria tessuto facilita il caricamento facile e valutazione delle proprietà dei materiali tessuti da prove di trazione uniassiale, come descritto. Ci sono anche precedenti sostanziale per l&#39;utilizzo di segmenti di anello di vasi sanguigni per misurare la contrazione vascolare e funzione fisiologica. Studi preliminari indicano che derivati ​​dalle cellule anelli di tessuto può essere montato su un dispositivo miografo fili per la misura di risposta farmacologica eforza contrattile generazione (dati non riportati). Complessivamente, la capacità di fabbricare rapidamente auto-assemblati anelli di cellule per l&#39;analisi istologica, meccanici, fisiologici, biochimici e suggerisce un nuovo e potente strumento che può essere utile per modellare la struttura del tessuto vascolare e la funzione nella salute e nella malattia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / apparecchiatura </th><th> Azienda </th><th> Catalogo </th></tr><tr><td> Polidimetilsilossano (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017-CV </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td></tr><tr><td> Sistema di imaging digitale </td><td> DVT Corporation </td><td> Modello 630 </td></tr><tr><td> Collaudo della macchina monoassiale </td><td> Instron </td><td> ElectroPuls E1000 </td></tr><tr><td> Rilevamento dei bordi Software </td><td> DVT Corporation </td><td> Framework 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

diretto cellular self-assembly di fabbricare cell-derived anelli tessuto per l&#39;analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Ogni anno, centinaia di migliaia di pazienti sottoposti ad intervento di bypass coronarico negli Stati Uniti 1. Circa un terzo di questi pazienti non hanno vasi adatti donatore autologo a causa della progressione della malattia o raccolto precedente. Lo scopo di ingegneria dei tessuti vascolari è quello di sviluppare una fonte alternativa adatta per questi innesti di bypass. Inoltre, il tessuto vascolare progettato può risultare prezioso come modelli viventi vascolare per lo studio delle malattie cardiovascolari. Diversi approcci promettenti ai vasi sanguigni di ingegneria sono state esplorate, con molti studi recenti incentrati sullo sviluppo e l&#39;analisi di metodi basati su celle. 2-5 Qui, presentiamo un metodo rapido per auto-assemblano in anelli cellule del tessuto 3D che possono essere utilizzati in vitro per modellare i tessuti vascolari. Per fare questo, sospensioni di cellule muscolari lisce sono seminate in fondo rotondo anulare agarosio pozzi. La non-adesivo proprietà del agarosio permettono °cellule e per risolvere, aggregare e contratto intorno ad un perno posto al centro del pozzo per formare un anello coeso tessuto. 6,7 Questi anelli possono essere coltivate per diversi giorni prima della raccolta per i meccanici, fisiologica, l&#39;analisi biochimica, o istologici. Abbiamo dimostrato che questi derivati ​​dalle cellule del tessuto anelli rendimento a 100-500 la resistenza alla trazione kPa ultimo 8, che supera il valore riportato per altri costrutti vascolari di ingegneria tessutale in coltura per eguali periodi (&lt;30 kPa). 9,10 I nostri risultati dimostrano che la cellula robusta di derivazione vascolare generazione anello di tessuto può essere raggiunto entro un breve periodo di tempo, e offre l&#39;opportunità di valutazione diretta e quantitativa dei contributi di cellule e derivati ​​dalle cellule della matrice (CDM) di struttura del tessuto vascolare e funzione.

Questo articolo descrive un metodo versatile per creare cellule derivate da anelli di tessuto cellulare self-assembly. Cellule muscolari lisce seminate in forma di anello aggregato agarosio pozzi e contratto a formare solide tridimensionali (3D) nei tessuti entro 7 giorni. Millimetrica scala anelli di tessuto sono favorevoli ai test meccanici e servono come mattoni per l&#39;assemblaggio dei tessuti.

Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l&#39;analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Ogni anno, centinaia di migliaia di pazienti vengono sottoposti a intervento di bypass aorto-coronarico negli Stati Uniti.1 Circa un terzo di questi pazienti...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare costrutti tridimensionali di tessuto a partire da cellule aggregate e matrice derivata dalle cellule, che possono essere utilizzati per analisi funzionali. Questo viene realizzato innanzitutto fresando uno stampo in policarbonato per creare pozzetti anulari con fondo rotondo. Successivamente, il poli dimetil silossano o PDMS viene colato sullo stampo in policarbonato per creare un modello.Quindi, il modello in PDMS viene utilizzato per formare pozzetti aros. L'ultimo passaggio consiste nell'inoculare le cellule nei pozzetti aros, consentendo loro di aggregarsi e formare anelli di tessuto coesivi. In definitiva, questo metodo può essere impiegato per ottenere l'autoassemblaggio cellulare e l'ingegneria tissutale utilizzando diversi tipi cellulari, e permette l'analisi del contributo delle cellule e della matrice extracellulare da esse derivata alla struttura e alla funzione del tessuto.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri approcci di ingegneria tissutale è che possiamo generare costrutti tissutali interamente da cellule e dalla matrice extracellulare che esse producono più rapidamente di quanto riportato in precedenza, e in un formato favorevole all'analisi meccanica. Iniziare fresando un pezzo di policarbonato spesso mezzo pollice per creare 15 pozzetti anulari con fondo arrotondato e un perno centrale di due millimetri di diametro. Pulire lo stampo di policarbonato per rimuovere eventuali residui di plastica generati durante la fresatura e lasciare asciugare lo stampo. Successivamente, mescolare il PDMS in un rapporto 10 a 1 di base e agente indurente. Degasare la soluzione per rimuovere tutte le bolle d'aria e quindi versarla nello stampo di policarbonato.Quindi disgasare nuovamente la miscela sullo stampo per rimuovere eventuali bolle d'aria residue e polimerizzare il PDMS in un forno a 60 gradi Celsius per quattro ore. Mentre il PDMS polimerizza, sciogliere il 2%AROS in DMEM. Una volta completata la polimerizzazione, rimuovere con attenzione lo stampo in PDMS staccandolo lentamente dal policarbonato, quindi lavare il PDMS con sapone e acqua e sterilizzarlo in autoclave insieme alla soluzione di DMEM con AROS. Posizionare ora lo stampo in PDMS sterilizzato in autoclave su una superficie piana e riempirlo con AROS fuso, pipettando prima l'AROS negli stampi dei perni centrali e successivamente pipettando l'AROS nello spazio circostante.Lasciare solidificare gli aros per circa 15 minuti. Quindi capovolgere lo stampo per rimuovere gli aros dal PDMS. Tagliare gli eccessi di aros attorno a ciascun pozzetto, quindi posizionare un pozzetto di aros in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Ora.Aggiungere il mezzo di coltura cellulare attorno all'esterno del pozzetto aros senza coprirne la parte superiore. Successivamente, posizionare le piastre nell'incubatore per consentire l'equilibrazione mentre vengono preparate le cellule. A confluenza del 90%, trattare con tripsina le cellule muscolari lisce aortiche di ratto e risospendere.Sospendere le cellule a una concentrazione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Quindi pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare risospesa in ciascun pozzetto dell'aro equilibrato. Utilizzare un movimento circolare per applicare le cellule in ciascun pozzetto.Posizionare le piastre nell'incubatrice e lasciarle indisturbate per 24 ore. Cambiare il mezzo ogni due giorni aspirando il liquido attorno al pozzetto e quindi ricaricando ogni pozzetto fino a quando lo stampo aros non è completamente sommerso. Al termine della coltura, riempire una piccola capsula di Petri con PBS.Rimuovere ogni anello dal suo stampo aros facendolo scivolare sopra la parte superiore del perno centrale. Posizionare gli anelli nelle piastre di Petri con PBS Center, un anello sotto il sistema di imaging digitale. Utilizzare un software di rilevamento dei bordi per misurare lo spessore dell'anello in quattro posizioni: superiore, inferiore, sinistra e destra lungo la sua circonferenza.Per eseguire un test di trazione uniassiale, montare un campione ad anello su due morsetti costituiti da fili sottili. Estendere i morsetti fino a quando sul campione ad anello viene applicato un carico di strappo di cinque millinewton.Quindi inserire l'area della sezione trasversale calcolata a partire dalle misurazioni dello spessore e registrare la lunghezza di riferimento. Sottoporre l'anello a otto cicli preliminari tra il carico di strappo e 50 chilopascal. Applicare sollecitazione a una velocità di 10 millimetri al minuto dopo l'ottavo ciclo preliminare, fino a rottura a 10 millimetri al minuto.Per ogni anello, misurare lo sforzo di trazione ultimo e la deformazione di rottura e calcolare il modulo tangente massimo a partire dai dati acquisiti. Oltre agli studi funzionali in vitro, questi anelli cellulari viventi possono anche fondersi per formare tubi di tessuto. Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare le estremità dei tubi di silicone con un angolo, creando bordi smussati, quindi sterilizzare i tubi di silicone in autoclave mentre i tubi vengono sterilizzati in autoclave.Riempire una piastra di Petri con il mezzo di coltura, trasferire sterilizzati in biosicurezza dei supporti personalizzati in silicone per tubi in una cappa a sicurezza biologica e posizionarli in una piastra di Petri vuota. Successivamente, rimuovere gli anelli dalle camere aros e posizionarli nella piastra di Petri contenente il mezzo di coltura. Collocare i tubi in silicone nella stessa piastra di Petri per inumidirli prima dell'uso.Utilizzare una pinzetta per posizionare l'estremit&agrave; di un tubo di silicone al centro di un anello e far scorrere delicatamente l'anello lungo il tubo di silicone. Far scorrere gli anelli a contatto l'uno con l'altro spingendoli delicatamente in successione in entrambe le direzioni lungo il tubo. Una volta montati gli anelli, allineare i tubi di silicone all'interno dei supporti in policarbonato e avvitare insieme le due parti del supporto.Aggiungere 55 millilitri di mezzo alla piastra di Petri. Cambiare il mezzo ogni tre giorni per tutta la durata della coltura, al fine di rimuovere i tubuli tessutali. Inizialmente, riempire una piastra di Petri con PBS.Quindi rilasciare i tubi di silicone dal supporto in policarbonato e utilizzare la pinzetta per far scivolare i tubi di tessuto dal tubo di silicone e inserirli nella piastra. Se eseguita correttamente, la sedimentazione delle cellule avviene nei fondi delle pozzette di Aros e, entro 24 ore dal posizionamento, avviene una contrazione che genera un anello di tessuto attorno al perno centrale nella pozzetta di Agarro. Questo è un grafico rappresentativo di una curva sforzo-deformazione ottenuta da un test di trazione uniassiale su un anello di tessuto di due millimetri generato da cellule muscolari lisce di ratto. La resistenza a trazione massima, il modulo di trazione massimo e i valori di deformazione a rottura vengono quindi utilizzati per confrontare le proprietà meccaniche di campioni di anelli di tessuto coltivati in diverse condizioni di coltura.Le proprietà meccaniche degli anelli di tessuto possono essere controllate modificando i parametri di coltura, tra cui il numero di cellule seminate, la durata della coltura, il mezzo di coltura e il tipo di cellule utilizzato. Oltre alle cellule muscolari lisce di ratto, le cellule muscolari lisce primarie umane formano anelli di tessuto con una resistenza a trazione simile.Anche le cellule staminali mesenchimali umane si aggregano formando anelli, ma non erano abbastanza resistenti per i test meccanici. Il nostro sistema consente la fabbricazione di costrutti di tessuto ingegnerizzato interamente a partire da cellule, semplicemente seminando le cellule nei nostri pozzetti aros personalizzati. Una volta realizzato il modello iniziale in policarbonato, possiamo produrre un numero illimitato di stampi in PDMS che possono poi essere utilizzati per creare i modelli, senza richiedere ulteriore attrezzatura.Il sistema è versatile poiché abbiamo utilizzato diversi tipi cellulari all'interno del sistema per creare anelli di tessuto, e pertanto questo sistema potrebbe essere impiegato potenzialmente sia per applicazioni di ingegneria tissutale sia per studi in vitro dei contributi delle cellule e della matrice extracellulare alla struttura e alla funzione del tessuto.

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