Name: Medición de la citosólica de Ca 2 + En aislados linfáticos contráctil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a medir la concentración de calcio citosólico en vasos linfáticos aislados de rata mediante imagen ratiométrica con Fura-2 AM. Este método permite estudiar la relación entre el calcio intracelular y la contractilidad linfática bajo presión luminal controlada.

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<p class="jove_content"&gt; Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención P20RR018766 y una subvención de la ABMRF / Fundación para la Investigación del Alcohol.</p

<ol><li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+system%3A+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, Suppl 1. 94-94 (2010).</li>
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<li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat.+Res.+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li>
<li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li>
<li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaking+through+Ca2%2B+stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li>
<li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2%2B+concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li>
<li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Una nueva combinación de métodos se emplean para el estudio intrínseco de bombeo de los vasos linfáticos. La capacidad de medir simultáneamente los cambios en la [Ca 2 +] i y el diámetro de los vasos linfáticos de bombeo permitirá que para el estudio de las contribuciones relativas de Ca 2 +-dependiente y Ca 2 +-sensibilizar a las vías de señalización en el mecanismo general que rigen el ciclo de contracción linfático. El ciclo de contracción linfá...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Ringer 5x de archivo </td></tr><tr><td Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfato de magnesio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td> Filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. MOPS buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td> Filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Solución de albúmina salina fisiológica (APSS) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Timbre de valores (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Trapeadores Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> El piruvato de sodio </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA de sodio salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albúmina, bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td> Ajustar el pH de 7,4 a 37 ° C, luego de filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos utilizados. Almacene todos a 4 ° C.

medición de la citosólica de ca 2 + en aislados linfáticos contráctil

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Los vasos linfáticos forman un sistema de transporte multifuncional que mantiene la homeostasis de fluidos, proporciona los lípidos de la circulación central, y actúa como un sistema de vigilancia para los antígenos potencialmente peligrosos, la optimización de inmunidad de la mucosa y la respuesta inmune adaptativa 1. Linfático está formado por el líquido intersticial que entra ciegos composición linfáticos iniciales, y luego se transporta en contra de un gradiente de presión en los vasos linfáticos más grandes de recolección. Cada linfático recolección se compone de una serie de segmentos llamados linfangiones, separados por válvulas bicúspides que evitar el reflujo. Cada lymphangion posee un ciclo de contracción que impulsa la linfa en contra de un gradiente de presión hacia la circulación central 2. Este patrón de contracción fásica es análoga a la del ciclo cardíaco, con fases sistólica y diastólica, y con una contracción del 4 de baja frecuencia. Además, el músculo liso linfático genera tono y muestra la constricción y la dilatación miogénica in respuesta a los aumentos y disminuciones en la presión luminal, respectivamente 5. Un híbrido de los mecanismos moleculares que apoyan tanto la contractilidad fásica y tónica de los linfáticos Así, se proponen. Contracción del músculo liso está regulada por la citosólica de Ca 2 + de concentración ([Ca 2 +] i), además de la sensibilidad a Ca 2 +, de los elementos contráctiles en respuesta a cambios en el entorno que rodea la célula 6. [Ca 2 +] i se determina por la combinación del movimiento de la Ca 2 + a través de la membrana plasmática del ligando o voltaje de Ca2 + y los canales de la liberación y absorción de Ca 2 + en las tiendas internas. Citosólica de Ca 2 + se une a la calmodulina y activa las enzimas tales como la cadena ligera de la miosina (MLC) quinasa (MLCK), que a su vez fosforila MLC que conduce a la actina-miosina mediada por la contracción 8. Sin embargo, la sensibilidad de esta vía a Ca <sup&gt; 2 + puede ser regulada por la fosfatasa MLC (PCML) 9. PCML actividad está regulada por la Rho quinasa (ROCK) y la fosfatasa miosina inhibidor de la proteína CPI-17. A continuación, presentamos un método para evaluar los cambios en la [Ca 2 +] i en el tiempo en los vasos linfáticos aislados, perfundidos con el fin de estudiar Ca 2 +-dependiente y Ca 2 +-sensibilizar a los mecanismos de contracción del músculo liso linfático. El uso aislado linfáticos mesentéricos de ratas se estudió la recogida estirar los cambios inducidos en el [Ca 2 +] i y la actividad contráctil. El modelo linfático aislado ofrece la ventaja de que la presión, el flujo y la composición química de la solución del baño puede ser muy controlado. [Ca 2 +] i fue determinada por la carga de vasos linfáticos con el radiométrica, Ca 2 +-unión del colorante Fura-2. Estos estudios proporcionan un nuevo enfoque al problema más amplio de estudio de los diferentes mecanismos moleculares que regulan fásicacontracciones tónico contra la constricción del músculo liso linfático.

Se introduce un enfoque para evaluar la citosólica de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Concentración en los vasos linfáticos aislados para estudiar Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dependiente y Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibilizante mecanismos de contracción del músculo liso linfático.

Medición de la citosólica de Ca 2 + En aislados linfáticos contráctil

Los vasos linfáticos comprenden un sistema de transporte multifuncional que mantiene la homeostasis de los fluidos, transporta lípidos a la circulación central y actúa como un ...

Este sistema experimental determina si los cambios en el calcio intracelular están relacionados con cambios en el patrón contráctil linfático provocados por una presión luminal elevada. Primero, extirpe un vaso linfático contráctil del mesenterio de rata y cánulelo en ambos extremos para controlar rigurosamente la presión luminal. A continuación, cargue el vaso con el colorante sensor de calcio de relación métrica fura 2:00 AM, que permite la medición de cambios en el calcio citosólico mediante microscopía de fluorescencia con excitación alternante de tres longitudes de onda de 40 y tres de 80 nanómetros.Registre los cambios en el diámetro del vaso linfático y en los niveles de calcio citosólico mientras el vaso se somete a presión luminal. El protocolo también determina el diámetro linfático a partir de las imágenes de lapso de tiempo obtenidas. Los resultados indican una relación temporal entre los aumentos transitorios de calcio citosólico y las contracciones fásicas de los vasos linfáticos, así como una correlación entre los niveles de calcio y la constricción miógena.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía intravital es que todas la

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Músculo papilar ventricular izquierdo murino se puede utilizar para investigar la contractilidad cardíaca in vitro. En este artículo se describe en detalle el aislamiento y los protocolos experimentales para estudiar las características contráctiles cardiacas.

Contractilidad Mediciones en músculos papilares aislados para la Investigación de Cardíaca inotropía en ratones

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Este artículo describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad del miofilamento Ca2+ durante la contracción en miocitos cardíacos aislados del corazón de rata. Junto con la electrofisiología cardíaca, los niveles de Ca2+ del citosol sistólico/diastólico y la contracción/relajación, esta medición es imprescindible para respaldar los mecanismos que median el acoplamiento de excitación-contracción cardíaca en corazones sanos y enfermos.

Evaluación de los miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca2 + reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.

Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.

Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

El presente protocolo describe la preparación y utilización de cortes pulmonares cortados con precisión en ratones para evaluar la contractilidad del músculo liso arterial intrapulmonar y de las vías respiratorias en un entorno casi in vivo .

Utilizando la rebanada pulmonar cortada con precisión para estudiar la regulación contráctil de las vías respiratorias y el músculo liso arterial intrapulmonar

Aquí, se describe un método establecido para realizar mediciones de contractilidad y calcio en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas utilizando una plataforma basada en óptica. Esta plataforma permite a los investigadores estudiar el efecto de las mutaciones y la respuesta a diversos estímulos de forma rápida y reproducible.

Mediciones en tiempo real de parámetros de calcio y contractilidad en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Este protocolo describe un método para medir simultáneamente el diámetro citosólico, el calcio libre [Ca2+]i y los vasos en vasos linfáticos en contracción y luego calcular las concentraciones absolutas de Ca2+ , así como los parámetros de contractilidad/ritmicidad. Este protocolo se puede utilizar para estudiar el Ca2+ y la dinámica contráctil en una variedad de condiciones experimentales.

Evaluación en tiempo real de la contractilidad absoluta, citosólica, libre de Ca2+ y correspondiente en vasos linfáticos aislados y presurizados

Aprende a medir la concentración de calcio citosólico en vasos linfáticos aislados de rata mediante imagen ratiométrica con Fura-2 AM. Este método permite estudiar la relación entre el calcio intracelular y la contractilidad linfática bajo presión luminal controlada.

Medición de la citosólica de Ca^{2 +} En aislados linfáticos contráctil

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