Name: 粘附频率含量为原位跨交界的分子相互作用，在细胞与细胞界面的动力学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 学习使用粘附频率实验测定细胞表面受体-配体相互作用的动力学参数。该方法利用功能化红细胞作为粘附传感器，通过微吸管技术记录粘附事件并拟合曲线，从而估算二维有效结合亲和力和解离速率。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343 和 R01GM096187。

1. 从全血中分离红细胞
<ol>
 <li>配制 EAS-45 溶液。称取 表 I 中列出的所有成分，溶于 100–200 ml 去离子水中。加水定容至 1000 ml，并调节 pH 至 8.0。过滤后分装为每份 50 ml，于 -20°C 冷冻保存。</li>
</ol>
注意：步骤 1.2 应由经过培训的医疗专业人员（如护士）按照经机构审查委员会批准的方案进行。
<ol start="2">
 <li>从肘正中静脉抽取3-5ml血液至含有EDTA的10ml试管中，并立即轻柔充分混匀，使血液与EDTA充分混合，以防凝血。</li>
 <li>尽快处理血样。除离心步骤外，以下所有操作均应在生物安全柜内进行，以保持无菌状态。将血液转移至50ml离心管中，加入10ml冷且无菌的Histopaque 1077，于4°C、1000rpm离心5分钟。重复此步骤两次。</li>
 <li>加入10ml冷且无菌的PBS，于4°C、1000rpm离心5分钟，弃去上清液。重复该洗涤步骤4次（共5次）。</li>
 <li>用无菌EAS-45洗涤两次（每次5分钟，4°C，1000rpm）。最后一次洗涤时，将红细胞转移至新的无菌15ml离心管中。</li>
 <li>将红细胞重悬于10ml EAS-45中。</li>
</ol>
2. 红细胞生物素标记
<ol>
 <li>取步骤1中装有红细胞（RBCs）的离心管，在4°C条件下以1000 rpm离心5分钟，弃去全部上清液。将10 μl红细胞沉淀分装至若干小管中，并向每管加入相应体积的PBS（参见表II，以制备六种不同生物素标记浓度的红细胞为例）。</li>
 <li>根据表II所示方法，新鲜配制Biotin-X-NHS/DMF的1:10和1:100稀释液。</li>
 <li>向每管中加入10 μl 0.1 M硼酸盐缓冲液。</li>
 <li>向每管中加入计算好体积的生物素溶液（参见表II示例），并立即涡旋混匀。</li>
 <li>将每管红细胞样品置于50 ml锥形离心管中，在室温下置于旋转仪上孵育30分钟。</li>
 <li>用800 μl EAS-45洗涤每管样品3次，每次2分钟，2000 rpm离心。</li>
 <li>向每管中加入100 μl EAS-45，4°C保存。最终溶液中每1 μl应含有约1×10⁶个红细胞。</li>
</ol>
3. 在红细胞上功能化生物素连接的配体*
<ol>
 <li>根据制造商说明书配制 2mg/ml 的链霉亲和素溶液。分装后的溶液可在 -20°C 保存。</li>
 <li>取步骤 2.7 中的红细胞（10μl）与链霉亲和素溶液等量混合，立即涡旋振荡，并在 4°C 条件下于旋转仪上孵育 30 分钟。</li>
 <li>用 500μl EAS-45 洗涤 3 次，每次 2 分钟，2000rpm。加入 15μl EAS-45/1% BSA 用于保存。</li>
 <li>取步骤 3.3 中的红细胞（10μl）与 20μg/ml 配体溶液等量混合，立即涡旋振荡，并在室温下于旋转仪上孵育 30 分钟。</li>
 <li>用 500μl EAS-45/1% BSA 洗涤 2 次，每次 2 分钟，2000rpm。加入 15μl EAS-45/1% BSA 用于保存。</li>
</ol>
*如果您的蛋白质没有生物素连接，可以使用市售的蛋白质生物素化试剂盒（例如，Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit），或如视频所示，使用生物素化捕获抗体作为中间步骤。
4. 受体与配体密度的定量分析
<ol>
 <li>将第3步中配体包被的红细胞与另一管中表达受体的细胞分别与各自饱和浓度的单克隆抗体在室温下孵育30分钟。对照组则分别在不同的小管中用无关的同型匹配抗体孵育细胞。如果一抗未标记荧光，根据制造商说明书，再与荧光标记的二抗孵育。</li>
 <li>采用相应的荧光校准微球，通过流式细胞术分析第4.1步制备的样品。按图1所示计算密度。</li>
</ol>
5. 玻璃微电极和细胞记录室的准备
<ol>
 <li>使用 PN-30 Narishige 磁性玻璃微电极水平拉制仪或 Sutter Instruments 微移液管拉制仪，从毛细管中拉制微移液管。</li>
 <li>使用带显微操作器的微电极加工仪调节拉制后的微移液管尖端至所需尺寸（通常所需直径范围为 1–5 μm，具体取决于实验中所用细胞的大小）。</li>
 <li>通过将显微镜盖玻片切割至所需尺寸来制备细胞腔室。从两侧用石蜡油密封腔室，以防止培养基蒸发导致实验过程中渗透压改变。</li>
 <li>将携带受体和配体的细胞加入腔室中。</li>
</ol>
6. 微管黏附频率测定
<ol>
 <li>使用相应的移液器吸取相互作用的细胞，并利用计算机编程的压电驱动器控制红细胞与另一细胞接触和分离的过程，调节接触面积和接触时间。通过观察细胞分离时红细胞的拉伸现象来检测黏附事件。</li>
 <li>对给定的接触时间重复接触-回缩循环50-100次。在Excel电子表格的一列中记录观察到的黏附事件：发生黏附记为“1”，无黏附记为“0”。可使用记录设备（如数字媒体或录像带）保存显微图像。</li>
 <li>针对每个接触时间，使用至少三对不同的细胞记录黏附频率随接触时间变化的曲线，以获得均值和标准误（SEM）。</li>
 <li>通过使用包被无关配体（如BSA）的红细胞和/或使用特异性功能阻断型单克隆抗体封闭配体或受体，记录对照组的非特异性结合曲线。每个接触时间点的特异性黏附频率可通过从总黏附频率中减去非特异性黏附频率得到1。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
 <li>拟合特异性黏附频率 Pa 与接触时间 t 通过一个概率模型（公式1）描述单一种类受体与单一种类配体之间的二级正向和一级逆向单步相互作用的数据1: 
 <img alt="动态系统中概率的方程；公式：P_a = 1-exp{-m_mg_AK_a[1-exp(-k_oft)]}" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
 其中 Ka 是二维有效结合亲和力， k关闭 是解离速率， mr 和 ml 分别为步骤4中测得的受体和配体密度，以及 Ac 是接触面积。曲线拟合有两个参数， AcKa 和 k关闭，作为 Ac 和 Ka 被归为一类，统称为有效二维亲和力。其与解离速率的乘积即为有效二维结合速率： Ack在 = AcKa x k关闭. 
 特异性黏附频率 Pa 通过减去非特异性黏附组分（P非特异性) 从总测量黏附力中（P测量)1,21: 
 <img alt="Pa 计算公式的方程，用于说明生化研究中数据分析方法的特异性。" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"></li>
</ol>
8. 代表性结果：
<img alt="流式细胞术分析、直方图和散点图；荧光强度 vs. PE-A，数据比较。" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1 中性粒细胞上整合素 αLβ2 位点密度的测定。中性粒细胞首先在 1 μg/mL 的 E-选择素-Ig 中孵育 10 分钟，以匹配图 3 和图 4 所用的实验条件，或不加 E-选择素-Ig 作为对照，随后在饱和浓度（10 μg/mL）下与 PE 标记的抗人 CD11a 单克隆抗体（克隆号 HI111，参见试剂与设备表）或无关小鼠 IgG1（对照）孵育，洗涤后立即进行分析。样品使用 BD LSR 流式细胞仪检测，并采用标准 QuantiBRITE PE 校准微球进行校准。图 A 显示了校准微球（粉红色）以及经 E-选择素-Ig 处理（蓝色）或未处理细胞（绿色）的荧光直方图。特异性 CD11a 单抗染色以实线表示，同型匹配的无关对照抗体染色以虚线表示。在整个洗涤步骤及 FACS 缓冲液中均含有 E-选择素-Ig 的细胞处理，未影响 CD11a 密度，这一点通过与未处理细胞的比较可见。图 B 显示了密度定量的过程。根据图 A 中四个校准微球直方图的每个峰的平均荧光强度（FI）（粉红色圆圈）及其对应的每颗微球所含 PE 分子数（由生产商提供），计算其 Log10 值。以每颗微球的 Log10 PE 分子数为纵坐标，Log10 荧光强度为横坐标，绘制线性回归曲线。对于经 E-选择素处理的细胞，特异性单抗和对照抗体的 Log10 FI（y）值分别为 3.99（蓝色实心圆）和 2.23（蓝色空心圆）。通过该线性方程求解 x 值（结果以绿色和蓝色圆圈标注于图 B）。其中 x = Log10 PE/细胞，由于 PE 与单抗的比例为 1:1，因此中性粒细胞表面 αLβ2 的总数计算为 9587。利用中性粒细胞直径为 8.4 μm 的假设22，计算得表面密度为 43 个分子/μm2。ICAM-1 的密度同样通过流式细胞术测定，使用 PE 标记的抗人 CD54 单克隆抗体，结果为 65 分子/μm2。
<img alt="用于成像子系统的带有显微操作针和光源的细胞显微操作示意图。" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2 显微操作针系统示意图。我们的显微操作针系统为自行组装，包含三个子系统：成像子系统，用于观察、记录和分析被显微操作针吸住的细胞的运动；显微操作子系统，用于从细胞室中选择细胞；以及压力子系统，用于将细胞吸入显微操作针中。成像子系统的核心是一台倒置显微镜（Olympus IMT-2 IMT2），配备100倍油镜物镜（数值孔径1.25 N.A.）。图像通过电荷耦合器件（CCD）相机传输至录像机。系统连接了视频计时器以记录时间。每个显微操作针可通过安装在显微镜上的机械驱动装置进行操控，并借助三轴液压显微操纵器进行精细定位。也可使用Newport公司的机械操纵器。其中一个显微操作针支架安装在压电平移器上，其驱动器由计算机LabView程序（可应要求提供）控制，信号经由数据采集板（DAQ）和电压放大器（自制）传递至压电执行器。这使得在黏附力测试循环中能够精确且可重复地移动移液针。压力调节子系统用于在实验过程中控制负压。液压管路将显微操作针支架连接至液体储液器，通过精密机械定位器可精确调节储液器的高度。
使用KIMAX熔点测定用硼硅酸盐玻璃毛细管（外径为1.0±0.07 mm，内径为0.7±0.07 mm）制备微量移液器。首先，利用Narishige PN-30型磁性玻璃微电极水平拉制仪（Sutter Instruments微量移液器拉制仪为另一种可选设备）将毛细管拉制成微量移液器。其次，使用自制显微操作仪将微量移液器切割至所需口径大小。此外，也可使用 commercially available 的显微操作仪设备。
为避免实验过程中微量移液器产生振动，将显微镜连同显微操作器一同置于气浮台上。
<img alt="运行频率 \(F_i\) 与测试循环次数 \(i\) 的关系图；实验结果的数据分析。" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3 红细胞分别包被ICAM-1（A）或hIgG（B）后，与表达整合素αLβ2的人中性粒细胞在1秒（红色）和10秒（蓝色）接触时间下，经过多次黏附测试循环测得的特异性（A）和非特异性（B）黏附的运行频率 Fi。Fi = (X1 + X2 +…+ Xi)/i （1 ≤i ≤ n），其中 i 为测试循环序号，Xi 取值为“1”（发生黏附）或“0”（无黏附）。以 Fn（n=50）作为黏附概率的最佳估计值。
<img alt="黏附概率与接触时间关系图；ICAM-1，人IgG对照；数据拟合，科研分析" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4 ICAM-1 与中性粒细胞整合素 α 结合动力学Lβ2 (<img alt="色谱系统示意图，显示带有颜色条带和溶剂流动的蛋白质纯化过程。" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方形">). 如图3所示，针对每种接触时间的三组细胞对测量得到的黏附概率取平均值，并绘制为接触时间的函数。腔室中的培养基为含1 mM Ca的HBSS2+ 和 Mg2+ 加 1μg/ml 二聚体E-选择素-Ig上调αLβ2 结合。为了在红细胞（RBCs）上捕获ICAM-1-Ig，增加了一个中间步骤，即将RBCs与 10μg/ml 捕获抗体（生物素化山羊抗人Fc抗体，eBioscience）在链霉亲和素孵育步骤之后使用。为控制非特异性结合，设置了两种不同条件：1）红细胞包被抗人Fc捕获抗体后，与人IgG孵育而非ICAM-1-Ig（O）；2）中性粒细胞与未包被捕获抗体的红细胞结合（Δ）。 10μg/ml 向培养基中加入人IgG，以最大限度减少溶液中E-选择素-Ig与红细胞表面捕获抗体的非特异性结合。以人IgG作为对照曲线记录的非特异性结合用于获得特异性黏附概率曲线。<img alt="从薄荷绿渐变为青绿色的渐变背景。" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方形">) 使用公式 2 计算。使用公式 1（实线）拟合特异性黏附概率曲线，得到有效结合亲和力 AcKa = 1.4•10-4 μm4 和 k关闭 = 0.3 s-1.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>
 试剂</th>
 <th>
 分子量 (g/mol)</th>
 <th>
 浓度 (mM)</th>
 <th>
 用量 (g)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adenine</td>
 <td>135.13</td>
 <td>2</td>
 <td>0.27</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-glucose (dextrose)</td>
 <td>180.16</td>
 <td>110</td>
 <td>19.82</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Mannitol</td>
 <td>182.17</td>
 <td>55</td>
 <td>10.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
 <td>58.44</td>
 <td>50</td>
 <td>2.92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Phosphate, Dibasic (Na HPO )</td>
 <td>141.95</td>
 <td>20</td>
 <td>2.84</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine</td>
 <td>146.15</td>
 <td>10</td>
 <td>1.46</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. EAS-45缓冲液配制（1L）。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>550 μl DMF 中的 25 mg 生物素-XHS</td>
 <td>0.1M 生物素溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>用 DMF 将 0.1M 生物素溶液稀释 10 倍</td>
 <td>0.01M 生物素溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>用 DMF 将 0.1M 生物素溶液稀释 100 倍</td>
 <td>0.001M 生物素溶液</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 生物素溶液的配制。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>
 生物素终浓度 (μM)</th>
 <th>
 4</th>
 <th>
 10</th>
 <th>
 20</th>
 <th>
 50</th>
 <th>
 100</th>
 <th>
 160</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>红细胞沉淀储备液 (μl)</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1x PBS (μl)</td>
 <td>179.2</td>
 <td>178</td>
 <td>176</td>
 <td>179</td>
 <td>178</td>
 <td>176.8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.1M 硼酸盐缓冲液 (μl)</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.01M 生物素溶液 (μl)</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>1</td>
 <td>2</td>
 <td>3.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.001M 生物素溶液 (μl)</td>
 <td>0.8</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表3. 红细胞的生物素标记。

<ol><li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+anchor+influences+ligand+binding+two-dimensional+kinetic+rates+and+three-dimensional+affinity+of+FcgammaRIII+%28CD16%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16).</a> J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+and+independent+binding+of+Fcgamma+receptors+IIa+and+IIIb+to+surface-bound+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG.</a> Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+binding+to+multiple+ligands%3A+kinetic+rates+of+CD16b+for+membrane-bound+IgG1+and+IgG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2.</a> Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+effects+of+molecular+orientation+and+length+on+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics.</a> J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).</li>
<li>Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurements+of+cell+surface+E-selectin%2Fcarbohydrate+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions.</a> Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophys. J. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+carrier+stiffness+and+microtopology+on+two-dimensional+kinetics+of+P-selectin+and+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+%28PSGL-1%29+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions.</a> J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).</li>
<li>Waugh, R. E., Lomakina, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+formation%2C+not+bond+kinetics%2C+limits+adhesion+rate+between+human+neutrophils+and+immobilized+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1.</a> Biophys. J. 96, 268-275 (2009).</li>
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<li>Lomakina, E. B., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+between+human+neutrophils+and+immobilized+endothelial+ligand+vascular+cell+adhesion+molecule+1%3A+divalent+ion+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects.</a> Biophys. J. 96, 276-284 (2009).</li>
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<li>Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+MHC-CD8+interaction+at+the+T+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane.</a> J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

为了成功使用微管黏附频率测定法，应考虑几个关键步骤。首先，务必记录所关注的受体-配体系统之间的特异性相互作用。非特异性对照测量（参见图3、图4）可确保特异性。理想情况下，所有接触时间下的非特异性黏附概率应低于0.05，并且在每个时间点上，特异性与非特异性黏附概率之间应存在显著差异。可采用不同的方法将配体偶联到红细胞表面。已有研究表明，与生物素-链霉亲和素偶联法相比，氯化铬偶联法17会导致更高的非特异性结合水平。
其次，特异性相互作用的黏附概率应处于中等范围。这一要求可通过调整受体和配体的密度来满足（如果细胞上的受体为组成型表达且其密度难以改变，则可仅调整红细胞上的配体密度）。为此，在测试受体-配体结合亲和力未知的新系统时，应制备一系列不同生物素化程度的红细胞（参见表III作为示例），以测试多种配体密度。稳态下的平均黏附概率不应超过0.8，因为细胞间受体密度的差异通常会导致部分细胞的黏附水平达到1，尤其是在平均配体密度过高的情况下。在初步特异性测试过程中，若发现部分细胞的黏附水平为0或1，则需调整配体密度。非特异性对照实验通常在特异性实验之后进行，此时希望黏附概...

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>BioWhittaker</td><td>&lt;p 对齐=&quot;中心&quot;&gt;17-517Q&lt;/p&gt;</td><td>使用前用去离子水稀释至1倍浓度</td></tr><tr><td>Vacutainer EDTA </td><td>BD 生物科学</td><td>366643</td><td>红细胞分离</td></tr><tr><td>10毫升 PK100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>红细胞分离</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786</td><td>EAS-45 制备</td></tr><tr><td>D-葡萄糖（右旋糖）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>EAS-45 制备</td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6360</td><td>EAS-45 制备</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>EAS-45 制备</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;&amp;#8322;&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;&amp;#8324;&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td>EAS-45 制备</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5763</td><td>EAS-45 制备</td></tr><tr><td>Biotin-X-NHS</td><td>Calbiochem</td><td>203188</td><td>红细胞生物素标记</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>20673</td><td>红细胞生物素标记</td></tr><tr><td>硼酸盐缓冲液（0.1 M）</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>11455-90</td><td>红细胞生物素标记</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>21125</td><td>配体功能化</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>配体功能化</td></tr><tr><td>Quantibrite PE 珠</td><td>BD 生物科学</td><td>340495</td><td>密度定量</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td>&lt;p 对齐=&quot;中心&quot;&gt;BD LSR II&lt;/p&gt;</td><td>密度定量</td></tr><tr><td>&lt;p 对齐=&quot;中心&quot;&gt;毛细管&lt;/p&gt;0.7-1.0 mm × 30&quot;</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>微移液管拉制</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>腔室组装</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>腔室组装</td></tr><tr><td>&lt;p 对齐=&quot;中心&quot;&gt;PE &amp;alpha;人 CD11a &lt;/p&gt;克隆 HI 111 </td><td>eBioscience</td><td>12-0119-71</td><td>图1所用试剂</td></tr><tr><td>PE 抗人 CD54 </td><td>eBioscience</td><td>12-0549</td><td>图1试剂</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 同型对照 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4714</td><td>图1所用试剂</td></tr><tr><td>液压显微操作器</td><td>Narishige International</td><td>MO-303</td><td>微量移液系统</td></tr><tr><td>机械操作臂</td><td>Newport Corp.</td><td>461-xyz-m, SM-13, DM-13</td><td>微量移液系统</td></tr><tr><td>压电&amp;#8211;电动翻译器</td><td>Physik Instruments</td><td>P-840</td><td>微量移液系统</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>国家仪器公司</td><td>版本 8.6</td><td>微量移液系统</td></tr><tr><td>数据采集板</td><td>国家仪器公司</td><td>USB-6008</td><td>微量移液系统</td></tr><tr><td>光学平台</td><td>动力学系统</td><td>5200 系列</td><td>微量移液系统</td></tr></tbody></table>

黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

微移液管黏附实验于1998年开发，用于测量二维（2D）受体-配体结合动力学1。该实验采用人红细胞（RBC）作为黏附传感器，并作为其中一种相互作用分子的呈递细胞。通过显微操作技术，将红细胞与表达另一种相互作用分子的细胞进行接触，精确控制接触面积和接触时间，以促进分子间结合的形成。当将两个细胞拉开时，红细胞的伸长现象即指示了黏附事件的发生。通过调控固定在红细胞表面配体的密度，使黏附概率保持在0到1之间的中等范围。对于给定的接触时间，通过重复多次细胞接触循环，根据黏附事件发生的频率来估算黏附概率。改变接触时间可获得一条结合曲线。将受体-配体反应动力学的概率模型1拟合至该结合曲线，即可获得二维亲和力和解离速率。
该检测方法已通过以下相互作用得到验证：Fcγ受体与IgG Fc1-6、选择素与糖缀合物配体6-9、整合素与配体10-13、同嗜性钙黏蛋白结合14，以及T细胞受体及其共受体与肽-主要组织相容性复合物15-19的相互作用。
该方法已被用于量化生物物理因素对二维动力学的调控作用，例如膜微拓扑结构5、膜锚定方式2、分子取向和长度6、载体刚度9、曲率20以及碰撞力20，以及生化因素，例如细胞骨架和相互作用分子所处的膜微环境的调节因子，以及这些分子的表面组织方式15,17,19。
该方法还被用于研究双受体-配体物种的同步结合3,4，以及利用改进模型研究三分子相互作用1921。
该方法的主要优势在于能够在其天然膜环境中研究受体，所得结果可能与使用纯化受体获得的结果大不相同17。此外，该方法还能够在亚秒级时间尺度上研究受体-配体相互作用，其时间分辨率远超典型的生化方法。
为了说明微管黏附频率法，我们展示了红细胞上功能化的细胞间黏附分子1（ICAM-1）与中性粒细胞上的整合素αLβ2结合的动力学测量结果，实验溶液中加入二聚体E-选择素以激活αLβ2。

本文描述了一种用于测量当受体和配体均锚定在相互作用细胞表面时其相互作用动力学的黏附频率检测方法。该基于力学的检测方法以微管加压的人红细胞作为黏附传感器，并以整合素αLβ2和细胞间黏附分子-1作为相互作用的受体与配体进行示例说明。

微量移液器黏附实验于1998年开发，用于测量二维（2D）受体-配体结合动力学1。该实验采用人红细胞...

以下实验的总体目标是测量当两种分子均锚定在相互作用细胞表面时，受体与配体相互作用的动力学。该目标首先通过功能化红细胞实现，这些红细胞作为黏附传感器，携带配体，并制备表达受体的细胞。第二步是组装微移液管腔室，并进行黏附测试以记录黏附事件。接下来，绘制细胞接触时间与黏附概率的关系曲线，并使用模型进行拟合。为了估算动力学参数，需从数据中获得二维有效结合亲和力和解离速率的估计值。那么，这种检测方法的思路源自何处？人们研究受体与配体的相互作用。大多数情况下测量的是断裂力，我们也在进行类似的研究，但有一天我们想到，是否可以直接测量二元结果——以零表示无黏附，以一表示有黏附，并通过这些零和一的测量结果推导出动力学参数，从而展示微管频率检测方法。我实验室的研究科学家Dr.Veronica Zana Zina将向您演示该实验。从全血中分离的红细胞用于生物素标记，以进行黏附频率检测。开始该操作时，离心含有分离红细胞的离心管，将10 µL红细胞沉淀分装至若干个样品瓶中，并向每个样品瓶中加入相应体积的PBS，以制备多种不同浓度的红细胞生物素标记溶液。接着，向每个样品瓶中加入10 µL 0.1 M硼酸盐缓冲液。然后向每支小瓶中加入计算好量的生物素溶液，并立即涡旋振荡。将每支红细胞小瓶放入50毫升锥形管中，室温下在旋转仪上孵育30分钟。30分钟后，向每支小瓶中加入EAS 45缓冲液，并在2000转/分钟下离心2分钟。用EAS 45缓冲液再重复洗涤两次，共洗涤三次。最后，向每个小瓶中加入 100 µL EAS 45 缓冲液，并在 4°C 下保存，以在上一步中使红细胞表面的配体功能化。在此步骤中，红细胞在 4°C 下与饱和浓度的链霉亲和素（strep TTR）孵育 30 分钟，随后用 EAS 45 缓冲液在 2000 rpm 转速下洗涤三次，每次 2 分钟。之后，可直接将红细胞与生物素标记的配体孵育，或先将红细胞与相应的生物素标记捕获抗体孵育，再与配体孵育。本视频所示方案采用的是生物素标记捕获抗体。微量移液器采用熔点较低的硼硅酸盐玻璃毛细管制成。首先使用微量移液器拉制仪将毛细管拉伸成形，然后使用配备微型熔炉的显微操作器将微量移液器尖端切割至所需大小的开口。所需直径通常根据研究中所用细胞的大小而定，范围为一到五微米。制备细胞腔室时，使用两片按所需尺寸切割的显微镜盖玻片，用气吹清除盖玻片上的灰尘，加入细胞腔室培养基，并从两侧用矿物油密封腔室，以防止培养基蒸发，否则会在实验过程中改变渗透压。本实验所用的微移液系统由三个子系统组成：用于观察、记录和分析微移液管吸取细胞运动的成像子系统，用于从细胞室中选择细胞的微操作子系统，以及用于将细胞吸入微移液管的压力子系统。成像子系统的中心部件是一台倒置显微镜，配备100倍油镜物镜。物镜图像由电荷耦合器件相机检测，并传送至录像机。将视频计时器连接到系统以记录时

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

粘附频率含量为原位跨交界的分子相互作用，在细胞与细胞界面的动力学分析

在本视频中，我们演示了通过HEK细胞聚集实验来检测突触细胞黏附分子之间跨细胞相互作用的技术。在该实验中，将表达目标突触前细胞黏附分子和一种荧光蛋白的HEK细胞，与表达突触后细胞黏附分子及另一种荧光蛋白的HEK细胞等量混合。细胞黏附分子之间的相互作用促使细胞发生聚集，可通过荧光显微镜进行观测和测量。...

检测细胞黏附分子间反式相互作用的细胞聚集实验

本方案综述了电细胞基底阻抗传感技术，该方法用于记录和分析贴壁细胞的阻抗谱，以定量检测细胞黏附、增殖、运动性以及细胞对药理和毒性刺激的反应。重点强调内皮细胞通透性的检测以及细胞间和细胞-基底相互作用的评估。...

用于定量分析内皮细胞增殖、屏障功能及迁移活性的细胞电阻传感技术

本演示介绍了一种利用电穿孔技术对贴壁培养细胞进行研究的方法，用于分析细胞间连接通讯，同时细胞生长在涂有导电透明氧化铟锡的载玻片上。...

一种用于间隙连接功能检测的实验方法；在氧化铟锡上对贴壁细胞进行电穿孔

本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。...

从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示

我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。...

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

该流动黏附实验为T细胞与上皮细胞相互作用提供了一个简单且高影响力的模型。通过注射泵产生剪切应力，并利用共聚焦显微镜采集图像以进行定量分析。这些研究的目标是在流动条件下有效量化T细胞的黏附情况。...

剪切应力下T淋巴细胞-黏附分子相互作用研究的黏附力检测方法

本研究展示了定量测量细胞膜延伸的实用性和简便性，及其与细胞黏附能力的相关性。作为代表性示例，我们在此表明，Dickkopf 相关蛋白 3（DKK3）可促进肾上腺皮质癌细胞中 Lobopodia 的形成增加以及细胞黏附性的增强 体外.

细胞膜突起的表征及其在癌细胞黏附动力学中作用的研究

免疫细胞与血管壁的动态黏附是其归巢至肠道的前提条件。本文介绍了一种用于功能性研究的实验方案 体外...

用于炎症性肠病抗黏附疗法功能分析的动态黏附测定

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

本文介绍了一种优化的实验方案，利用荧光显微镜在异源细胞系统中快速、半定量地检测反式配体-受体相互作用。...

通过异源细胞系统中蛋白质聚集测量跨细胞相互作用

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

学习使用粘附频率实验测定细胞表面受体-配体相互作用的动力学参数。该方法利用功能化红细胞作为粘附传感器，通过微吸管技术记录粘附事件并拟合曲线，从而估算二维有效结合亲和力和解离速率。

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