Name: 大型単層小胞へのペプチドの転座の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学ぶ ペプチドの膜透過性定量化法。トリプシン封入大型単層小胞とFRETを用いて、ペプチドの脂質二重層横断速度を測定し、膜透過能を持つペプチドを同定する手法です。

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著者らは、有用な議論をエレノアフレミングとジェシカ陳に感謝します。資金は、国立アレルギー感染病研究所（NIH - NIAID）賞R15AI079685とリサーチ株式会社コットレル大学科学賞によって提供されていました。追加の学生支援は、ハワードヒューズ医学研究所とStaley氏の資金によって提供されていました。

1。ラージユニラメラ脂質小胞の調製（LUVs） <ol><li>アッセイ19細胞膜を模倣として機能するLUVsを準備します。 </li><li>ミックスホスファチジルコリン（POPC、760.10グラム/モル）、ホスファチジルグリセロール（POPG. 770.99グラム/モル）、5 - ジメチルアミノナフタレン-1 - スルホニル50でクロロホルムに溶解したホスファチジルエタノールアミン（DNS - POPE、994.350グラム/モル）（アヴァンティ極性脂質） ：45:5の比率。すべてのアッセイは、実験群とコントロールの両方LUVsの別々の準備を必要とするとして、2つの脂質ケーキのバイアルを準備する必要があります。総脂質の0.376ミリグラム（0.188 mgをPOPC、0.169 mgのPOPG、および0.019 mgのDNS - POPE）は通常、単一の転座試験のために十分な小胞を作るのに十分です。 </li><li> N 2ガ ​​ス流を用いてクロロホルム蒸発。 </li><li>真空デシケーター内の脂質のケーキ9月14日時間を乾かします。 </li><li>株式の10 mM HEPES緩衝液（10mMのHEPES、238.3グラム/モル、45 mMのNaCl、58.44グラム/モル、1mMのEDTA、372.24グラム/モルpH7.4）を準備します。 HEPESバッファーはSTです。4℃で論理和</li><li>上記で調製した10 mMのHEPES緩衝液に0.4mMのブタトリプシン（23.3キロ/モル）のストック溶液を調製。トリプシンは、-20℃で保存されており、私たちの実践で、通常使用の前に2つ以上の凍結融解サイクルを受けることはありません。 </li><li> -20℃で、10mMのHEPES緩衝液、店舗には4.0 mMのボーマン - バークトリプシンインヒビター（8キロ/モル）のストック溶液を調製私たちの使用では、この株式は毎月補充されると、それが再び行われる前に通常3つ以上の凍結/融解サイクルを受けることはありません。 </li><li> 0.4mMのトリプシンの株式や乾燥脂質のケーキ〜10 mMのHEPES緩衝液の等量を追加することにより、0.2mMのトリプシン溶液で再構成実験的な多重膜小胞（MLVは）。 0.376 mg総脂質の一つのサンプルの場合は、トリプシン溶液とHEPES緩衝液150μL150μLの混合物で十分です。 </li><li> 0の等量を追加することによって、0.2mMのトリプシンと2.0 mMのボーマン - バークトリプシンインヒビターとソリューションで再構成制御MLVは。4mMのトリプシンの株式や乾燥脂質ケーキ〜4.0 mMのトリプシンインヒビター。 0.376 mg総脂質の一つのサンプルの場合は、トリプシン溶液とトリプシンインヒビターの150μLの150μLの混合物で十分です。 </li><li>ガラスバイアルから1.7 mlのマイクロ遠心チューブに転送MLVソリューション。 </li><li>液体窒素で5凍結/解凍サイクルに従うMLVソリューション。 </li><li>各テフロン押出片にHEPES緩衝液で湿らせた二つのフィルターをサポートして配置することにより、脂質の押出機（アヴァンティ極性脂質）を準備します。 twoテフロン押出片の間に0.1μmの孔（ワットマン、イギリス）とnucleporeトラックエッチング膜を置き、金属の押出機のキャニスター内の押出機のピースを置きます。押出機のキャニスターの金属の上部を締めてホルダーにそれを置く前に、2つの押出機の片上のドーナツのスペーサを置きます。 </li><li>小胞のサンプルの損失を防ぐために、250μLのガラスシリンジを用いて、500μLの10mM HEPES緩衝液で押出機内空隙容積を埋める。&lt;/ LI&gt; <li>押出機にそれぞれのMLVのサンプルをロードし、膜を介して均一な単層ベシクルのサイズを確保するために少なくとも21回のサンプルを押してください。 LUVsは、MLVのソリューションは、次の押し出しから取得されます。 </li><li> 4℃店舗LUVs℃、48時間以内に使用する。 </li></ol> 2。定量化は、濃度をLUVは<ol><li>マブラヴ濃度は、試料20の全リンの含有量を測定することによって定量した。 </li><li>室温でnanopure水に濡らしたりの8.9 NH 2 SO 4を準備します。 </li><li> nanopure水では2.5％w / vのアンモニウムモリブデン酸VI（588.04グラム/モル）溶液を調製します。 10パーセントw / vのアスコルビン酸（176.1グラム/モル）nanopure水の溶液を調製します。ホイルで管を覆うことにより、露光からアスコルビン酸溶液を保護する。最大2ヶ月間4℃で両方のソリューションを保管してください。 </li><li> 0.65 mMリン酸緩衝液（一塩基性無水リン酸ナトリウム、120 g /モル）を準備します。 </li><li> 6つの標準TUを準備BES。規格は0.0μL、50μL（0.0325μモル）、100μL（0.065μモル）、175μL（0.114μモル）、250μL（0.163μモル）、またはリン溶液350μL（0.228μモル）を含める必要があります。 </li><li>三連でサンプルチューブをLuvの準備。各サンプルチューブはLUVsの約0.1μモルが含まれている必要があります。実験群とコントロールは、濃度を個別に測定する必要がありますLUVは。 </li><li>ボーマン - バークインヒビターの粉の任意の乾燥リン酸塩を補正するためには、コントロールは空白が準備されている必要がありますLUVは。サンプルチューブをLuvのコントロールに配置されたとしてブランク、0.2 mMのtrypsin/2.0 mMのボーマン - バーク阻害剤溶液の同量が含まれている必要があります。 </li><li>標準試料、およびブランクチューブのそれぞれに8.9 NH 2 SO 4の代わりに450μL。 </li><li>熱のサンプル、標準、および175から210で25分間の空白°オーブンでC。 </li><li>全てのチューブを取り外し、それらを冷却することができます。 TUのそれぞれに30％H 2 O 2の150μLを追加BES。 </li><li>熱のサンプル、標準、および175から210で30分間の空白℃、 </li><li>サンプル、基準、および熱からブランクを取り外します。ソリューションのいずれかがまだ無色ではない場合、175から210でさらに15分間、すべてのチューブと熱℃に50μLH 2 O 2を追加</li><li> 3.9 mLのnanopure H 2 O、0.5 mLのモリブデン酸アンモニウム溶液と各チューブに0.5 mLのアスコルビン酸溶液を加える。 </li><li>沸騰水浴中で5〜7分間、すべてのチューブを加熱する。 </li><li> Agilentの8453紫外可視分光光度計を用いて820 nmで、それぞれ標準とサンプルの吸光度を測定します。 0.0ミリモルのリンを含むチューブは、すべての規格の空白として使用され、実験的にサンプルをLUVはされるべきである。 0.2mMのtrypsin/2.0 mMのボーマン - バーク阻害剤溶液を含むチューブはサンプルをマブラヴ制御するための空白として使用する必要があります。 </li><li>リニア吸光度対リンコンテンツの標準曲線を作製し、合計phosphを計算するために使用することができます。orusのコンテンツとサンプルの濃度をLUVは。 </li></ol> 3。ペプチド溶液の準備<ol><li> nanopure H 2 Oにペプチドを溶かす説明に従って、このアッセイで使用されているペプチド一トリプトファン残基が含まれている必要があります。 </li><li>三連の282 nmでのペプチド溶液の吸光度を測定します。 5700 M -1 cm -1のトリプトファンのモル吸光係数を用いてペプチドの濃度を計算する。 </li><li> 30μMの最終濃度までnanopure水のペプチドを希釈する。 -20℃で保存</li></ol> 4。転座定量<ol><li>を1.7 mLのマイクロ遠心チューブ中で実験群とコントロールサンプルを準備します。 250μMの最終濃度は、各ソリューションに十分なLUVsを追加。その阻害剤は、トリプシンの濃度より10倍も大きいの最終濃度になるように十分なボーマン - バークインヒビター溶液を加える。 450μLに最終的なソリューションのボリュームをもたらすのに十分な、10mMのHEPES緩衝液を追加します。 </li> &lt;Starnaマイクロ石英の蛍光光度計のセルへのLi&gt;場所50μLのペプチド溶液。 LUVsとペプチドとの間の比はほぼすべての無傷のペプチドはいずれも小胞に転いない場合でも、FRETシグナルを与えるためにダンシル基の十分近くに近接していることを保証するために十分に高いです。これは、何と小胞内に移行していないペプチドの制御条件において観察されたFRETが似と一致しています。 </li><li>キュベット内のペプチド溶液に、実験またはコントロールサンプルを追加。これは、3μMの最終ペプチド濃度を持参してください。 </li><li>少なくとも1秒間に1回ずつ蛍光読書をしながら、ソリューションをマブラヴの実験またはコントロールを添加するとすぐに 25分の蛍光反応速度の実験を始める。 25に280nmの励起波長は525 nmでの発光波長、および温度を℃に設定キャリーのEclipse蛍光分光光度計を使用して、我々は高いのPMT感度を設定します。 </li></ol><html> 5。定量的転率を生成<ol><li>データ収集の15秒後の蛍光読書として、初期の蛍光（F O）を定義する。当社の機器のセットアップでは、我々は収集した蛍光データの最初の15秒サンプルを添加するとシステムにサンプルチャンバーを閉じ、そして他の摂動、原因混合に信頼性であることを見出した。各時点での相対的な蛍光（F / F 0）を取得するためにF oで後続の各測定値を割ります。 </li><li>平均的な実験の最後の分からすべての相対的な蛍光の測定値が最終的な平均的な相対的な蛍光を得るために<img alt="[F / FO] AVG" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> 。 </li><li>分割<img alt="[F / FO] AVG" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" />による制御のサンプル用<img alt="[F / FO] AVG" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" />実験試料の補正を最終蛍光値を取得する。 </li></ol>ル&quot;&gt; 6。代表的な結果図2は、堅牢な転座を示した代表的なペプチドのためのこのアッセイの結果を示しています。この実験における信号（黒のトレースは）時間をかけてFRETシグナルの著しい低下を示しています。しかし、それは不完全なトリプシンの阻害または転座の能力とは無関係な他の要因によるFRETシグナルの潜在的な損失を制御することが重要である。この目的のために、我々は常にもペプチドとトリプシンとボーマン - バークトリプシンインヒビター（グレーのトレース、図2）の両方を含むLUVs間でFRETシグナル測定する。私たちの手で、それは実験が実行されるたびにすべてのペプチドは、このコントロールを実行するために重要であった。これは、私たちは明らかに一般的にこれらの濃度で観察された比較的弱い蛍光シグナルに大きな影響を与えることができる脂質の小胞の調製品や楽器の音、間の相違に起因する信号の変化を補正することができます。 コントロールEXPEの重要性トリプシンインヒビターを含むLUVsを使用してrimentは、図3に示すようにデータによって強調表示されます。このケースでは、ペプチドシグナルは、実験サンプル（黒のトレース）の図2のような量を減少させた。しかし、対照サンプルは、このペプチドのためのより急速な減少を示していますので、その正味の転座が低くなります。 我々のプロトコルのセクション5では、この実験から、転座を定量化する簡単な方法を説明します。高い転座の比率は、効率的に転位するペプチドを示すものであり、図2に示すように細胞透過性ペプチドのための転座の比は1.16であり、弱く転位ペプチドが1に近いほど、転座の比率を持っている。我々の経験では、別の小胞の準備を行う3つの独立した実験のための標準誤差は0.01〜0.06の範囲内です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> 図1。 translocatの回路図イオンアッセイ実験は試料を（）蛍光ダンシルPOPE（黒棒）でドープされ、トリプシン（はさみ）をカプセル化含むLUVは。トリプシンインヒビター（赤い円）がLUVs外にトリプシンを阻害するために使用されます。 LUVsは、ペプチド（紫）にさらされている。とペプチド会合はtransloctingペプチドが遠慮のない内部トリプシンが発生したとして減少する信号（緑）をFRETが膜の歩留まりをLUVは。トリプシンとトリプシンインヒビターの両方をコントロールにカプセル化されている（B）転座に関係のないFRETシグナルの減少を測定するためにサンプルをLUVは。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> 図2。細胞透過性ペプチドのための代表的なデータが。抗菌pepideを転位担当者は、その制御に比べてFRETシグナルが大幅に低下を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> 図3。コントロールの重要性を強調する代表的なデータは非転位ペプチドのトリプシン消化の不完全な抑制は、実験群とコントロールの両方で時間をかけてFRETシグナルの低下につながるソリューションをLUVは。コントロールと実験的なトレースの差が比較的小さいため、この変異体は弱く転位ペプチドとして特徴付けられる。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するプロトコルは、内部および脂質小胞の外側のペプチドの濃度の相対的な変化を評価するために使用することができます。これらの変更は、転座の能力に関連しています。このプロトコルは、薬物送達ベクターとしての可能性と細胞透過性ペプチドを同定するために使用することができます。細胞透過性ペプチドへの関心が拡大するにつれ、それは直接転座のイベントを測定する方法は定量的な方法で開発され、使用されているかどうか興味がもたれるでしょう。 私たちの研究室では、我々は、アッセイの整合性を慎重に実験のいくつかの特定の側面を監視することにより改善できることを見出した。最初に、実験群とコントロールの両方小胞の定量化は、このプロトコルを使用して得られた結果の一貫性を向上させます。このアッセイはまた、タンパク質の移行と消化の先頭へ前の正確な初期の蛍光を検出する能力に依存します。したがって、それはfluoreために不可欠であるとすぐにタンパク質やペプチドなどを開始するscence信号コレクションはLuvのソリューションに公開されます。このアッセイはまた、使用される特定のトリプシン阻害剤に敏感であり、現在までに...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 16:0-18:1 PG </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 1時18ダンシルPE </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:0-18:1 PC </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 850457C </td></tr><tr><td>ブタトリプシン</td><td>シグマ</td><td> T - 0303 </td></tr><tr><td>ボーマン - バークトリプシン/キモトリプシン阻害剤</td><td>シグマ</td><td> T - 9777 </td></tr><tr><td>ミニ押出機</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 61万</td></tr><tr><td>モリブデン酸アンモニウム（パラ） </td><td>アルファAesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L -アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A1417 </td></tr><tr><td>過酸化水素、30％溶液</td><td> Mallinckrodt化学物質</td><td> 5240〜05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H - 3375 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>シグマ</td><td> S - 9625 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> E5134 </td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4 </td><td>シグマ</td><td> S - 0751 </td></tr></tbody></table>

大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

容易に細胞膜の受容体1の支援なしに細胞膜を通過ペプチドに積極的に関心があります。これらの多くは、頻繁に1から3の薬物送達ベクターとしての可能性で注目されて細胞透過性ペプチド、と呼ばれています。また、特に4,5以外の膜溶解メカニズム、細胞溶解を引き起こすことなく、細菌の膜を通過し、細胞内プロセス6,7に干渉することによって細胞を殺すものを介して動作抗菌ペプチドの関心が高まっている。実際に、著者らはますます細胞透過性と抗菌ペプチド1,8の間の関係を指摘している。膜の転座とペプチドの構造と転位する能力との関係のプロセスのしっかりとした理解は、転座のための効果的な、再現性のアッセイを必要とします。いくつかのグループは、大きなunilamelに転座を測定する手法を提案したLAR脂質小胞（LUVs）9-13 LUVsは、細菌と真核生物の細胞膜の有用なモデルとなると頻繁に14,15ペプチド蛍光の研究に使用されています。ここで、我々はまずそのようなマガイニンとbuforin II 16,17のような抗菌性ペプチドを、考慮する松崎と共同研究者によって開発された方法の我々のアプリケーションについて説明します。この方法のために我々のプロトコルを提供することに加えて、我々はまた、このアッセイを用いて転座の能力を定量データ分析への直接的なアプローチを提示する。他人と比較してこの転座アッセイの利点は、それが膜の転座の割合に関する情報を提供する可能性を秘めているとトリプトファン含有ペプチドにペプチドの特性18を 、変えることができる蛍光標識、の加算を必要としないことです。簡潔に、脂質小胞へのトランスロケーション機能は、ネイティブのトリプトファン残基とdの間にフォスターの共鳴エネルギー移動（FRET）の関数として測定されますタンパク質が外部に関連付けられているansylホスファチジルエタノールアミンは、膜（図1）LUVは。彼らはLUVsでカプセル化された制約のないトリプシンが発生したとして、細胞透過性ペプチドは、マブラヴ膜とFRETシグナルの減少から解離につながる、切断されています。 LUVsがトリプシンおよびトリプシンインヒビター、またはときに自発的に脂質膜を通過していないペプチドをトリプシン含有LUVsにさらされている両方が含まれているときに転位ペプチドで観察されたFRETシグナルの低下は、同一のペプチドで観察されたものよりかなり大きいです。蛍光の変化は、時間の経過ペプチド転座の直接定量を提供します。

このプロトコルの詳細、大きな一枚膜脂質小胞へのペプチド移行の定量的測定のための方法。また、このメソッドは、膜の転座の割合に関する情報を提供し、効率的かつ自発的に脂質二重層を横切るペプチドを同定するために使用することができます。

細胞膜受容体の助けを借りずに、容易に細胞膜を透過するペプチドへの関心が高まっています1。これらの多くは……

小胞膜を介したペプチドの転位を定量化する。トリプシンを封入した蛍光標識脂質小胞を作製する。外来性トリプシンの活性を阻害するためにトリプシンインヒビターを添加し、小胞腔内にのみ活性のあるトリプシンを保持させる。蛍光標識ペプチドを小胞に添加したときのみ、その蛍光タグがFRETドナーとして機能し、小胞上の蛍光分子を励起します。しかし、タンパク質が膜を通過すると、それらはトリプシンによって消化され、FRETシグナルが消失します。分光分析によりペプチド転位の程度が明らかになり、これは時間経過に伴う小胞とペプチド間のFRETの減少として観察されます。他の脂質小胞技術や細胞内へのペプチド流入を測定する方法を含む他の手法と比較して、本手法の主な利点は、膜への進入速度に関する情報が得られること、およびペプチドにトリプトファンが含まれている場合は蛍光ラベルを付加する必要がないことです。この方法は、効果的な膜透過にどのような特性が必要かなど、膜活性ペプチドの設計およびエンジニアリングにおける重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手順の最初のステップは、アッセイにおける細胞膜の模倣体として機能させるため、巨大単層脂質小胞（UUV）を調製することです。まず、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、および5-ジメチルアミノナフチル-1-スルホニルホスファチジルエタノールアミンを、クロロホルム中で50:45:5の比率で混合します。通常、1回の実験または対照試験に必要な量のベシクルを調製するには、総脂質量0.376 mgで十分です。1つのバイアルを実験サンプルとして、もう1つをコントロールとして用意し、窒素ガス流を用いてクロロホルムを蒸発させます。この工程後に残った乾燥脂質をリピッドケーキと呼びます。リピッドケーキを真空デシケーター内で9～14時間乾燥させます。次に、10 mMのHEIストック溶液、0.4 mMの豚トリプシンストック溶液、および4.0 mMのBowman Burkeトリプシンインヒビターストック溶液を調製します。調製方法の詳細については、付属文書をご参照ください。乾燥させた脂質ケーキに、0.4 mMのトリプシンストック溶液と10 mMのHEIバッファー溶液を等量ずつ加えます。その後、バイアルをボルテックスして、マルチラメラ小胞（MV）を再構成します。コントロール用MVを再構成するには、乾燥させた脂質ケーキに0.4 mMのトリプシンストック溶液と4.0 mMのトリプシンインヒビターを等量加え、前述と同様にボルテックスします。mvsの再構成が完了したら、MLV溶液をガラスバイアルから1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。次に、液体窒素と30 °Cの水槽を交互に用いて、MLV溶液を5回凍結融解させます。続いて、2つのフィルターサポートをHeiss Bufferで湿らせ、リピッドエクストルーダーを準備します。次に、それぞれを湿らせたテフロン製エクストルーダーピースの上に置き、2つのテフロン製エクストルーダーピースの間に孔径 0.1 micron のヌクレオポア・トラックエッチ膜を挟みます。続いて、エクストルーダーピースを金属製エクストルーダーキャニスターに入れ、2つのエクストルーダーピースの上にドーナツスペーサーを配置します。エクストルーダーキャニスターの金属製トップを締め、250 microliter ガラスシリンジを用いてホルダーに固定します。ベシクルサンプルの消失を防ぐため、エクストルーダーの空隙に10 millimolarの HEPES緩衝液を500 µL充填します。サンプルを10 milliliterビーカーに移します。次に、各MLVサンプルをエクストルーダーに充填し、メンブレンを通して少なくとも21回押し出します。エクストルージョン後にElla小胞のサイズを均一にするため、巨大ELLA脂質小胞またはL UUVsを1.7 mLのマイクロ遠心チューブに移します。UUVsは4 °Cで保存し、48時間以内に使用してください。LUV濃度を評価するために、サンプル中の全リン含有量を測定します。以下の試薬を、付属の書面プロトコルの仕様に従って調製してください。8.9 N H₂SO₄、2.5% (w/v) モリブデン酸アンモニウム、10% (w/v) アスコルビン酸、および 0.65 mM リン酸緩衝液です。ここに示す通り、6つのリン標準液を調製します。次に、コントロールに使用したものと同じ量の0.2 millimolar トリプシンおよび2.0 millimolar Bowman BIR阻害剤溶液を用いて、LUVブランクを調製します。これは、Bowman B阻害剤粉末に含まれる乾燥したリン塩の影響を補正するために行います。次に、通常は約25 µLに相当する約0.1 µmolのUUVsを、使い捨てガラス培養チューブに3連（triplicate）で分注します。次に、各サンプル、標準物質、およびブランクチューブに8.9 NのH₂SO₄を450 µL加えます。その後、サンプル、標準物質、およびブランクを175～210 °Cのオーブンに入れ、25分間加熱します。25分が経過した後、すべてのチューブをオーブンから取り出し、冷却させます。各チューブに30% H₂Oを150 µL加えます。その後、サンプル、標準試料、およびブランクを175〜210 °Cでさらに30分間加熱します。30分後、試料標準液とブランクを加熱装置から取り出します。溶液に色が残っている場合は、すべてのチューブに50 µLのH2Oを加え、175～210 °Cでさらに15分間加熱してください。溶液が無色になったら、各チューブに3.9 mLのnano pure H2O、0.5 mLのモリブデン酸アンモニウム溶液、および0.5 mLのアスコルビン酸溶液を加えます。その後、すべてのチューブを5〜7分間加熱します。沸騰水浴中で、Agilent 8 4 5 3 UV可視分光光度計を用い、各標準試料およびサンプルの吸光度を820 nanometersで測定します。実験群と対照群のLUV濃度は、個別に測定する必要があります。0.0 millimolesのリンを含むチューブを、すべての標準試料および実験用LUV試料のブランクとして使用します。0.2 millimolarのトリプシンと2.0 millimolarのbone and bir阻害剤溶液を含むチューブを、コントロールLUV試料のブランクとして使用します。作成された吸光度対リン含有量の線形標準曲線を用いて、試料の総リン含有量およびLUV濃度を算出します。ペプチド溶液を調製するために、ペプチドをOppu H2Oに溶解させます。このアッセイで使用するペプチドには、1つのトリプトファン残基が含まれている必要があります。282 nmにおけるペプチド溶液の吸光度を3回繰り返し測定してください。トリプトファンのモル吸光係数 5,700 を用いて、ペプチド濃度を算出します。1 M⁻¹ cm⁻¹のペプチドをNano Pure Waterで希釈し、最終濃度を30 µMにして-20 °Cで保存します。転移量を定量するため、1.7 mLマイクロ遠心チューブに実験サンプルとコントロールサンプルを調製します。各溶液に、最終濃度が250 µMになる十分な量のUUVsを添加します。Bowman BIR阻害剤溶液を、最終濃度がtryin濃度の10倍になるまで加えます。10 mMのHEPESバッファーを加え、最終溶液量を450 µLにします。50 µLのペプチド溶液をStarna micro chordsフルオリメーターセルに入れ、分光光度計のプログラムにセットします。280 nmの励起波長および525 nmの蛍光波長を用い、25 °Cにて、少なくとも1秒に1回の蛍光読み取りを行う25分間の蛍光キネティクス実験に使用する蛍光分光光度計。PMT感度を「high」に設定し、実験サンプルまたはコントロールサンプルをqve内のペプチド溶液に加える。これにより、最終的なペプチド濃度を3 µMにし、直ちに蛍光キネティクス実験を開始する。実験サンプルとコントロールサンプルの両方のランが完了したら、付属文書に従って転位比を算出します。sとペプチドの比率は、たとえ転位して小胞内に入ったペプチドが一つもなかったとしても、ほぼすべての無傷のペプチドがdansel基に十分に近い距離にあり、fret信号を発するのに十分な高さに設定されています。これは、小胞に転位するペプチドと転位しないペプチドの両方について、コントロール条件下で同様のfretが観察されることと一致しています。転位アッセイはこのビデオに記載された方法で実施しました。この図は、顕著な転位を示した代表的なペプチドの結果を示しています。黒いラインで表されるこの実験のシグナルは、FRETシグナルの著しい低下を示しています。時間の経過とともに、転位率が高くなることは、ペプチドが効率的に転位していることを示しています。ここに示した細胞透過性ペプチドの転位率は1.19です。不完全なトリプシン消化や抑制剤、あるいは転位能とは無関係なその他の要因によるFRET信号の損失の可能性を制御するため、弱く転位するペプチドの転位率は1に近い値となります。トリプシンとBowman BRKトリプシン抑制剤の両方を含むUUVとペプチドの間のFRET信号を測定します。これはグレーのトレースで示されています。トリプシンインヒビターを含むUUVを用いたコントロール実験の重要性が、ここに示されたデータによって強調されています。この場合、ペプチド信号は、黒色のトレースで示された実験サンプルにおける前図と同程度の減少を示しました。しかし、コントロールサンプルではこのペプチドの減少がより急速に起こるため、正味の転移量は低くなります。このビデオを視聴することで、リピッドベシクルの作製方法と、トリプトファン含有ペプチドの転移を測定する方法について十分に理解できたはずです。この手順を試みる際は、ペプチドとベシクルを混合した直後にデータ収集を開始することが重要である点に注意してください。

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JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、細胞膜模倣物(蛍光色素とクエンチャーでカプセル化された大きな単層小胞、またはLUV)を使用して、細胞透過性ペプチドと細胞膜との相互作用を研究する蛍光漏出アッセイについて説明します。...

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自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

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蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。...

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。...

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

このプロトコルは、iSCATベースの画像処理と単粒子追跡アプローチを記述し、脂質膜と相互作用する高分子の分子量と拡散挙動の同時調査を可能にします。サンプル調製、質量コントラスト変換、ムービー取得、および後処理に関するステップバイステップの手順が、潜在的な落とし穴を防ぐための指示とともに提供されます。...

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

この記事では、小胞内構造を持ち、内側、環状、および外側の領域で電気伝導性がカスタマイズされた化合物ジャイアントユニラメラベシクル(cGUV)を調製する方法を紹介します。電気形成は単純なGUVを合成し、浸透圧ショックによって気孔細胞やcGUVに変換されるため、有核細胞の生物物理学を研究するための貴重なモデルを提供します。...

化合物巨大ユニラメラ小胞の合成:核細胞の生体模倣モデル

本記事では、固体支持脂質二重層における単一タンパク質追跡用のサンプル作成方法を詳しく説明します。また、単一分子感度と高速フレームレートを持つシンプルな蛍光顕微鏡の説明もします。最後に、単一タンパク質の軌跡抽出手順を概説します。...

蛍光顕微鏡を用いた脂質二重層中の単一タンパク質の追跡

グラミキシジンAドープされた液滴界面二重層を組み立て、電気刺激し、解析する実験プロトコルを提示します。脂質-タンパク質の構造-機能関係は、膜面積、イオンフラックス、単一チャネル伝導の変化を測定し、これらの応答を電気シナプスに着想を得た膜モデルにおける可塑性様のイオン伝導変化と関連付けることで定量化されます。...

液滴界面二重層を用いた脂質-タンパク質膜構造-機能の特徴解析

学ぶ ペプチドの膜透過性定量化法。トリプシン封入大型単層小胞とFRETを用いて、ペプチドの脂質二重層横断速度を測定し、膜透過能を持つペプチドを同定する手法です。

大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

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