Name: Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch In-situ Leberperfusion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Lernen Sie die Isolierung primärer Portal-Fibroblasten aus Rattenleber durch In-situ-Perfusion mit Kollagenase. Diese Methode liefert reine Zellpopulationen ohne Kultivierung für Leberforschung.

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Diese Arbeit wurde vom NIH R01 DK05823 (bis RGW), F32 DK083213 (bis JWW), F30 DK081265 (zu ALO), und durch einen Zuschuss aus dem Fred und Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (bis RGW) gefördert.

Das gesamte Verfahren wird bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. 1. Herstellung von Enzymlösungen <ol><li> Bereiten Enzymlösungen nach Tabelle 1 und Sterilfilter mit einer 0,22 um-Filter. Halten Lösung 1 und Lösung 2 bei Raumtemperatur und 3-Lösung bei 4 ° C bis zum Gebrauch. Alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit isolierten Zellen müssen steril sein. </li></ol> 2. Herstellung von Perfusionsausrüstung <ol><li> Prime die Perfusion System mit HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 +, hat die auf 37 ° C erwärmt Anmerkung: Um sicherzustellen, dass das Perfusat 37 ° C ist, wenn es in der Leber gelangt, HBSS in einem Wasserbad gesetzt wurden, auf 37 ° C erwärmt Nach dem Durchlaufen der Perfusionspumpe geht, geht es durch einen Glasgefäß Kondensator, der auf einen Wassergehalt Zirkulator ist auf 40 ° C (1) verbunden ist. </li><li> Sterilisieren zu chirurgischenole in einem Becherglas mit 70% Ethanol. </li></ol> 3. Perfusion der Leber <ol><li> Anesthetize einen erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten durch eine intraperitoneale Injektion von Nembutal (50-100 mg / kg Körpergewicht wie nötig, um eine adäquate Anästhesie zu erhalten). </li><li> Platzieren Sie das Tier in Rückenlage auf einer Plastikschale und fixieren Sie die Gliedmaßen, um das Tablett mit Klebeband. </li><li> Reinigen Sie den Bauch mit 70% EtOH. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut am Bauch in der Mittellinie. Präparieren der Haut weg von der Fascia, indem eine große U-förmigen Ausschnitt auf dem Bauch. Schneiden Sie die Bauchmuskeln mit einer Schere im Anschluss die gleiche Form, um die Bauchhöhle aussetzen. </li><li> Setzen Sie die Pfortader durch Verwendung von 2 Wattestäbchen vorsichtig bewegen Sie die Bauchorgane an der rechten Seite. </li><li> Führen Sie zwei sterile 2,0 Seidennähte unterhalb der Pfortader und locker binden. </li><li> Kanülieren die Pfortader mit einer 16-18 Gauge IV-Katheter und sichern Sie den Katheter an Ort und durch Anziehen der lose tied Nähte aus dem vorherigen Schritt (2). </li><li> Inject verdünnten Heparin durch die IV-Katheter (1 ml Heparin 5000 USP Einheiten / ml mit 4 ml HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 + verdünnt). Die Leber sollte blanchieren. </li><li> Verbinden Sie den IV-Katheter an die Perfusion System. Perfundieren mit HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 + mit einer Geschwindigkeit von 20 ml / min für 10 Minuten. Durchschneiden die IVC inferior in die Leber um den Abfluss von Blut und Perfusat ermöglichen. Saugen Sie gepoolten Blut aus der Bauchhöhle. </li><li> Ändern der Perfusionsflüssigkeit mit einer 0,3% Kollagenase-Lösung (150 mg Collagenase Typ 2 in 500 ml HBSS und Ca 2 + / Mg 2 +) und perfuse für 25 Minuten. Halten Sie das feuchte Leber, indem es mit dem vorher seziert Bauchlappen. Legen Sie eine Petrischale Abdeckung über dem Bauch-Klappe und die Position einer Wärmelampe über den Bereich um den intraabdominellen Temperatur bei etwa 37 ° C zu halten </li></ol> 4. Vorbereitung von the Gallenwege <ol><li> Entfernen Sie die Leber, indem Sie sie aus der Bauchhöhle mit einer Pinzette und legen Sie sie in einem sterilen Gewebekulturschale mit kaltem Leibovitz L-15-Medien gefüllt. </li><li> Arbeiten in der Gewebekultur Kapuze, ziehen Sie die Leberkapsel und sie vorsichtig auseinander Leberparenchym mit einer Pinzette. Bewegen Sie die Leber durch verschiedene Gerichte mit Liebovitz die L-15-Medien gefüllt, während weiter entfernt das Parenchym zu necken, bis schließlich mit dem isolierten Gallenwege überlassen. Das Leberparenchym ist tan gefärbt, während die restlichen Gallenwege ist weiß. </li><li> Setzen Sie den isolierten Gallenwege in ein 50 ml Falcon-Röhrchen mit 10 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IU / ml Penicillin und 10.000 ug / ml Streptomycin) gefüllt; verlassen auf Eis für 15 Minuten. </li></ol> 5. Die Isolierung der Fibroblasten-Portal Fraction <ol><li> Legen Sie die Gallenwege in ein steriles 50 ml Falcon-Röhrchen und Hackfleisch mit einer sterilen Schere. </li><li> Eine kleine Menge an Enzym Solution Nr. 1 in das Rohr (etwa 5 ml) und weiterhin die Gallenwege Blatt, bis sie die Konsistenz einer Aufschlämmung erreicht. </li><li> Gießen der Aufschlämmung in eine sterile Glasflaschen. Waschen Sie den Falcon-Röhrchen mit der verbleibenden Lösung Nr. 1, dann gießen Sie sie in der Glasflasche. Bei 37 ° C unter Schütteln bei 100 UpM für 30 Minuten. </li><li> Filtern der Aufschlämmung durch ein Becherglas mit einer einzelnen Schicht aus Nylon-Mesh (30 Mikron Porengröße) abgedeckt ist. </li><li> Übertragen jedes Gewebe verbleibenden auf dem Netz in einen sterilen Glasflasche durch Waschen der Eingriff mit Enzym-Lösung # 2. Starten durch Gießen Hälfte (25 ml) der Lösung in ein steriles 15 cm Petrischale. Vorsichtig das Gitter aus dem Becher durch die Ränder des Netzes ohne Kontamination der mittleren Bereich, dann invertierenden das Netz und Eintauchen in die Lösung in der Petrischale, um jegliches verbleibende Gewebe auf dem Netz zu entfernen. Entsorgen Sie die Maschen. Übertragen Sie die Lösung in der Petrischale in eine sterile Glasflasche. Spülen Sie die Petrischale mit der REMAining 25 ml Lösung Nr. 2 und überträgt es auf dem gleichen Glasflasche. Bei 37 ° C unter Schütteln bei 100 UpM für 30 Minuten. </li><li> In der Zwischenzeit nehmen Sie die Filtrat im Kolben abgemessen und in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifugieren bei 1600 min (460 x g) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie Medien und das Pellet in 25 ml Lösung # 3. </li><li> Nehmen Sie die Lösung aus Schritt 5.5 und filtern Sie sie in ein zweites steriles Becherglas mit 30-Mikron-Mesh abgedeckt. </li><li> Entsorgen Sie die Maschen. Zentrifuge das Filtrat bei 1600 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen und das Pellet mit 25 ml Lösung # 3, wie in Schritt 5,7 durchgeführt wurde. </li><li> Kombinieren Sie die zwei Fraktionen aus den Schritten 5.7 und 5.9 und zentrifugieren bei 1600 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie Medien und das Pellet in 10 ml-Portal Fibroblastenkultur Medien (DMEM/F12 mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin, 0,3% Gentamycin und 0,2% Fungizon ergänzt). </li><li> Zählen von Zellen für die Lebensfähigkeit und die Platte in Zellkulturschalen. Je nach der gewünschten Anwendung, sind 0,5 bis 5 x 10 6 Zellen pro 10-cm-Gewebekulturschalen Platte angebracht. Von einem erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten, wir in der Regel erhalten 2-10.000.000 lebensfähigen Zellen. </li><li> Ersetzen Sie die Kulturmedien am nächsten Tag an nicht-haftenden Schmutz zu entfernen. Danach ersetzen Kulturmedien alle 2 Tage. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Primäre Fibroblasten-Portal von erwachsenen Rattenleber isoliert werden nach 1, 3 und 7 Tage nach der Isolierung (3) gezeigt. Beachten Sie, dass die Zellen gestreckt sind, mit typischen Morphologie von Fibroblasten. Die Zellen können mit Anti-Elastin-Antikörper (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) gefärbt werden, um Reinheit zu bestätigen. Portal Fibroblasten unterziehen myofibroblastischer Differenzierung in der Kultur. Dies kann durch Immunfärbung für α-smooth muscle actin (; A2547, Sigma, St. Louis, MO α-SMA) nachgewiesen werden. <tableborder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> 0,3% Collagenase-Lösung </td><td> Typ-2-Kollagenase </td><td> 150 mg </td></tr><tr><td> HBSS mit Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td rowspan="7"> Lösung 1 (Pronase) </td><td> Rinderserumalbumin </td><td> 50 mg </td></tr><tr><td> Collagenase Typ 2 </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> 18 mg </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47,5 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> Lösung # 2 </td><td> Rinderserumalbumin </td><td> 50 mg </td></tr><tr><td rowspan="6"> (Hyaluronidase) </td><td> Collagenase Typ 2 </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 22 mg </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47,5 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> Lösung 3 </td><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> RPMI-Medium 1640 </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Enzym-Lösungen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig1.jpg" /> Abbildung 1. Perfusion einrichten. A. Wasser-Thermostat für Erwärmung Spalte. B. Spalte mit Perfusion Medien. C. Hahn Steuerung Pumpe Abfluss. D. Pumpenzufluss. E. Drehzahlveränderbare Schlauchpumpe. F. Isolierkanne mit Bio-Clean Reinigungsmittel. G. Wärmelampe. H. Wasserbad zum Erwärmen Perfusion Medien. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig2.jpg" /> FiguRe 2. In-situ-Perfusion. A. IV-Katheter in die Pfortader eingeführt, gesichert mit Naht und mit dem Infusionsschlauch über Hahn. B. Glas Pipette Thermosflasche und Wandabsaugung verbunden Perfusionsflüssigkeit Ablassen von durchtrennten IVC zu entfernen. I. Darm. L. Leber. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig3.jpg" /> Abbildung 3. Phasenkontrast und Immunfluoreszenz von Ratten-Portal Fibroblasten in Kultur zu färben. Portal Fibroblasten für 1, 3 und 7 Tage nach der Isolierung kultiviert wurden fixiert und für Elastin, α-SMA und DAPI gefärbt.

<ol><li>Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+-+like+cells+and+liver+fibrogenesis%3A+Emerging+concepts+in+a+rapidly+moving+scenario%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario.</a> Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).</li>
<li>Dranoff, J. A., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+fibroblasts%3A+Underappreciated+mediators+of+biliary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis.</a> Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).</li>
<li>Tuchweber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+phenotypic+modulation+of+portal+fibroblasts+in+the+early+stages+of+cholestatic+fibrosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat.</a> Lab Invest. 74, 265-278 (1996).</li>
<li>Beaussier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominent+contribution+of+portal+mesenchymal+cells+to+liver+fibrosis+in+ischemic+and+obstructive+cholestatic+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries.</a> Lab Invest. 87, 292-303 (2007).</li>
<li>Kinnman, N., Housset, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peribiliary+myofibroblasts+in+biliary+type+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis.</a> Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).</li>
<li>Kinnman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblastic+conversion+of+peribiliary+fibrogenic+cells+distinct+from+hepatic+stellate+cells+is+stimulated+by+platelet-derived+growth+factor+during+liver+fibrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis.</a> Lab Invest. 83, 163-173 (2003).</li>
<li>Uchio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+retinol-binding+protein-1+expression+and+modulation+during+in+vivo+and+in+vitro+myofibroblastic+differentiation+of+rat+hepatic+stellate+cells+and+portal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts.</a> Lab Invest. 82, 619-628 (2002).</li>
<li>Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+liver+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Investig.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat liver fibroblasts.</a> J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+and+substrate+stiffness+regulate+portal+fibroblast+activation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture.</a> Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).</li>
<li>Bosselut, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+proteomic+features+of+two+fibrogenic+liver+cell+populations%3A+hepatic+stellate+cells+and+portal+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts.</a> Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).</li>
<li>Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecto-nucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase+NTPDase2%2FCD39L1+is+expressed+in+a+novel+functional+compartment+within+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver.</a> Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Portal Fibroblasten spielen eine wichtige Rolle in biliären Fibrose. Hier beschreiben wir eine Modifikation des ursprünglichen Protokolls von Kruglov und Dranoff 8 zur Isolierung Portal Fibroblasten aus Rattenleber und bietet eine unkomplizierte Möglichkeit, diese Zellpopulation in vitro Studie veröffentlicht. Dieser Ansatz verwendet Proteaseverdau und Größe-basierte Filterung. Der primäre Vorteil des Verfahrens ist, dass eine relativ reine Population von Zellen ohne Passage in Kultur erhalten werden kann, so dass die Untersuchung der Genexpression oder funktionelle Verhalten der Zelle mehrere Tage nach der Isolierung. Diese Technik bietet auch das Potenzial zur Isolierung von Zellen aus sowohl gesunden und kranken Lebern. Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die enzymatische Verdauung des Leberparenchyms. Um eine erfolgreiche Verdauung zu gewährleisten, ist es wichtig, um zu bestätigen, dass das Blut vollständig aus der Leber abgeleitet während der anfänglichen PerfusionSion, indem sichergestellt wird, dass es sogar Blanchieren der Leber. Um dies zu erleichtern, ist es möglich, ein Wattestäbchen verwenden, um sanft massieren, während die Leber Perfusion. Mehr als-Verdau der Leberparenchym führt zu einer niedrigen Ausbeute von lebensfähigen Zellen, während sie unter-Verdau wird es schwierig, die Leberparenchym aus der Gallenwege zu trennen. Da Zubereitungen Pronase Variabilität in der enzymatischen Aktivität zwischen verschiedenen Chargen, Optimierung der Menge verwendet werden, haben kann notwendig, wenn es geringer Ausbeute von lebensfähigen Zellen werden. Dieses Protokoll kann zum Isolieren Portal Fibroblasten aus Mausleber oder junge Rattenleber mit einem geringeren Durchmesser IV-Katheter, die Pfortader Kanülierung, Verringern des Volumens der Perfusionslösungen im Verhältnis zu Tiergewicht, und Verringern der Leber Perfusionsrate bis etwa 10 modifiziert werden ml / min. Portal Fibroblasten in Kultur zu unterziehen myofibroblastischer Differenzierung in 10-14 Tagen, wie von α-SMA ex belegtpression 9. Verschiedene Marker wurden verwendet, um Portal-Fibroblasten von hepatischen Sternzellen, einschließlich Fibulin-2, IL-6, Elastin, unterscheiden Nukleosidtriphosphat Diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), Cofilin-1 und neuronale Proteine ​​wie Synaptophysin 2, 6, 10, 11 . Wir haben festgestellt, dass Elastin ein guter Marker für Fibroblasten-Portal ist, auch nach myofibroblastischer Differenzierung, während NTPDase2 geht verloren, nachdem Portal Fibroblasten Kultur nach einigen Tagen 9 unterzogen worden sind. Deshalb haben wir in der Regel bestätigen Isolierung von Portal-Fibroblasten durch Immunfluoreszenzfärbung für Elastin. Der Nachteil dieser Technik ist, dass unmittelbar nach Portal Fibroblasten isoliert, gibt es einen kleinen Bruchteil der kontaminierenden Zellen einschließlich Kupffer-Zellen und Gallen-Zellen. Portal Fibroblasten wird diese kontaminierenden Zellen in 2-3 Tagen zu klein wird, jedoch so dass ein relativ reine Population (&gt; 98%) 9. Since Portal Fibroblasten in Kultur myofibroblastischer Differenzierung durchlaufen auf Gewebekultur-Plastik, wir studieren diese Zellen normalerweise innerhalb von 7 Tagen der Isolation. Die Zellen werden in Portal Fibroblastenkultur Medium, das 10% fötales Rinderserum gehalten, wie in dem Verfahrensabschnitt beschrieben. Allerdings werden diese Zellen in Wachstumsmedium, enthaltend 2% fötales Rinderserum mehrere Tage überleben. Wir verwenden normalerweise keine niedrigen Serum-Medien bis spätestens 24 Stunden nach der Isolierung. Sobald Portal Fibroblasten myofibroblastischer Differenzierung durchlaufen, können sie mehrmals passagiert werden und gehalten als gefrorene Vorräte an Myofibroblasten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Collagenase Typ 2 </td><td> Worthington Biochemical (Lakewood, New Jersey) </td><td> LS004177 </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche (Indianapolis, IN) </td><td> 70290120 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma (St. Louis, MO) </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen (Carlsbad, CA) </td><td> 11320 </td></tr><tr><td> HBSS ohne Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> Mediatech (Manassas, VA) </td><td> 21-021-CM </td></tr><tr><td> HBSS mit Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> Mediatech </td><td> 21-020-CM </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td></tr><tr><td> RPMI-Medium 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Gemini-Bio (West Sacramento, CA) </td><td> 900-108 </td></tr><tr><td> Nitex Nylon-Mesh 30 pm </td><td> Genesee Scientific (San Diego, CA) </td><td> 57-105 </td></tr></tbody></table>

isolierung von ratten-portal fibroblasten durch<em&gt; in-situ</em&gt; leberperfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Leberfibrose ist durch die übermäßige Ablagerung von extrazellulärer Matrix durch aktivierte Myofibroblasten definiert. Es gibt mehrere Vorläufer der hepatischen Myofibroblasten, einschließlich hepatische Sternzellen-, Portal-Fibroblasten und Knochenmark stammenden Fibroblasten ein. Hepatischen Sternzellen waren die am besten untersuchte, sondern Portal Fibroblasten werden zunehmend als wichtige Faktoren für die Myofibroblasten Pool anerkannt, insbesondere in biliären Fibrose 2. Portal Fibroblasten unterziehen Proliferation als Reaktion auf biliären Epithelzellen Verletzungen, möglicherweise eine wichtige Rolle spielen in den frühen Stadien der Gallenwege Narben 3-5. Ein Verfahren zur Isolierung Portal Fibroblasten in vitro-Studie würde dieser Zellpopulation ermöglichen und führen zu einem besseren Verständnis der Rolle Portal Fibroblasten spielen in biliären Fibrose. Portal Fibroblasten wurden isoliert unter Verwendung verschiedener Techniken wie Auswachsen 6, 7 und liver. Perfusion mit enzymatische Verdauung von Größenauswahl 8 an. Der Vorteil der Verdauung und Größe Selektionstechnik gegenüber dem Auswachsen Technik ist, dass Zellen ohne die Notwendigkeit der Passage in Kultur untersucht werden können. Hier beschreiben wir eine modifizierte Version der ursprünglichen Technik von Kruglov und Dranoff 8 zur Isolierung von Portal Fibroblasten aus Rattenleber, dass in einer relativ reinen Population von primären Zellen beschriebenen Ergebnisse.

Eine Technik zur Isolierung Portal Fibroblasten aus Rattenleber beschrieben. Lebern werden perfundiert und verdaut<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit Kollagenase, gefolgt von<em&gt; Ex vivo</em&gt; Verdauung der Leber Gülle und Größe Auswahl von Zellen. Diese Methode stellt eine reine Population von Fibroblasten-Portal ohne die Notwendigkeit für den Durchgang in der Kultur.

Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch<em&gt; In-situ</em&gt; Leberperfusion

Die Leberfibrose ist definiert durch die übermäßige Ablagerung von extrazellulärer Matrix durch aktivierte Myofibroblasten. Es gibt mehrere Vorläufer von hepatischen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine relativ reine Population primärer portaler Fibroblasten aus der Ratte zu isolieren, ohne dass ein Durchlauf in Kultur erforderlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst die Rattenleber in situ mit einer Lösung aus Kollagenase perfundiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Gallengangbaum vom Leberparenchym zu trennen.Anschließend wird der Gallengang weiter mit enzymatischen Lösungen verdaut. Im letzten Schritt wird der verdauten Gallengang durch ein feines Sieb geführt, um Portalfibroblasten anhand ihrer Größe zu isolieren; abschließend erfolgt die Immunfluoreszenzmikroskopie für Elastin und alpha glatte Muskulatur. Aktin kann verwendet werden, um die relativ reine Population der aus der Rattenleber gewonnenen Portalfibroblasten nachzuweisen.Der Vorteil dieser Methode gegenüber etablierten Verfahren wie der Aussprossungstechnik besteht darin, dass bei anderen Methoden Portal fibroblasten zunächst in einer Pathogenkultur gezüchtet werden müssen, bevor sie untersucht werden können. Mit dieser Methode kann eine vergleichsweise reine Population primärer Zellen direkt aus der Leber gewonnen werden, ohne dass eine Kultur von Pathogenzellen erforderlich ist. Vor Beginn des Verfahrens spülen Sie das Perfusionsystem mit warmem HBSS ohne Calcium und Magnesium vor. Sobald die Sedierung durch Zehenquetschung bestätigt wurde, legen Sie die adulten, anästhesierten männlichen Ratten in Rückenlage auf ein Kunststofftablett und befestigen die Gliedmaßen mit Klebeband am Tablett. Nach der Reinigung des Abdomens mit 70 % Ethanol einen kleinen Schnitt in der Haut entlang der Mittellinie des Abdomens mit sterilen Scheren anlegen. Einen großen, U-förmigen Schnitt im Bauchbereich anbringen, um die Haut von der Faszie zu lösen, und anschließend das Bauchmuskulaturgewebe auf die gleiche Weise durchtrennen, um die Peritonealhöhle freizulegen. Danach mit zwei Wattestäbchen vorsichtig die Baucheingeweide nach rechts verschieben, um die Pfortader freizulegen.Führen Sie dann zwei sterile 2,0-Seidennähte unter die Pfortader ein und binden Sie sie locker. Kanülieren Sie nun die Pfortader mit einem IV-Katheter der Größe 16 bis 18 und sichern Sie den Katheter, indem Sie die Nähte festziehen. Injizieren Sie verdünntes Heparin über den IV-Katheter.Beachten Sie, dass die Leber blass wird, wenn sie ordnungsgemäß perfundiert ist. Verbinden Sie den intravenösen Katheter mit dem Perfusionsystem und perfundieren Sie die Leber mit HBSS ohne Calcium und Magnesium.Quer durchtrennen die untere Hohlvene unterhalb der Leber, um den Abfluss von Blut zu ermöglichen, und perfundieren Sie acht, wobei das Blut aspiriert wird, während es in den Bauchraum eindringt. Setzen Sie die Perfusion mit einer Geschwindigkeit von 20 Milliliter pro Minute fort. Nachdem die HBSS-Perfusion abgeschlossen ist, wechseln Sie nach 10 Minuten das Perfusionsfluid zu einer 0,3 %igen Kollagenaselösung. Bedecken Sie die Leber mit der zuvor präparierten Bauchdeckenklappe, um sie während der Kollagenase-Perfusion feucht zu halten.Halten Sie die intraabdominale Temperatur bei etwa 37 Grad Celsius, indem Sie einen Petrischalen-Deckel über die Bauchdeckenklappe legen und eine Wärmelampe über dem Bereich positionieren. Entnehmen Sie zunächst die perfundierte Leber aus dem Tier und legen Sie sie in eine sterile Gewebekultur-Schale, die mit kaltem Leibovitz's L-15-Medium gefüllt ist, und arbeiten Sie dabei in der Gewebekulturhaube.Lösen Sie die Leberkapsel ab und trennen Sie vorsichtig das Leberparenchym mit einer Pinzette. Führen Sie die Leber durch mehrere Schalen mit Levy's L 15-Medium, wobei Sie weiterhin das Parenchym ablösen, bis der Gallengangbaum vollständig isoliert ist. Beachten Sie, dass das Leberparenchym bräunlich gefärbt ist, während der Gallengangbaum weiß ist.Geben Sie den Gallengangbaum in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen, das mit 10 Milliliter Penicillin-Streptomycin gefüllt ist, und stellen Sie das Röhrchen anschließend 15 Minuten lang auf Eis. Danach überführen Sie den Gallengangbaum in ein sauberes 50-Milliliter-Röhrchen und zerkleinern ihn mit sterilen Scheren. Fügen Sie dann etwa fünf Milliliter Enzymlösung Nummer eins zum Röhrchen hinzu und setzen Sie das Zerkleinern des Gallengangbaums fort, bis eine breiartige Konsistenz erreicht ist.Geben Sie die Suspension in eine sterile Glasflasche. Spülen Sie das Röhrchen mit der verbleibenden Lösung Nummer eins aus und gießen Sie die Lösung anschließend in die Glasflasche. Inkubieren Sie die Gewebesuspension 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 100 U/min und filtrieren Sie die Suspension dann in einen mit einer einzigen Schicht von 30 Mikron abgedeckten Becher.Gießen Sie Nylonmasche. Gießen Sie anschließend etwa 25 Milliliter der Lösung Nummer zwei in eine sterile 15-Zentimeter-Petri-Schale. Entfernen Sie dann vorsichtig die Masche aus dem Becher, indem Sie sie an den Rändern halten.Drehen Sie nun das Netz um und tauchen Sie es in die Lösung in der Petrischale. Um eventuell verbliebene Gewebestücke zu entfernen, geben Sie die Lösung aus der Petrischale in eine saubere Glasflasche. Spülen Sie anschließend die Petrischale mit den verbleibenden 25 Millilitern der Lösung Nummer zwei und geben Sie die Spülflüssigkeit in dieselbe Glasflasche.Inkubieren Sie die Gewebelösung in der Glasflasche bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 100 U/min für 30 Minuten. Gießen Sie in der Zwischenzeit das Filtrat aus dem Becher in ein 50-Milliliter-Gefäß. Nach der Zentrifugation des Filtrats bei 460 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur wird das Überstand entfernt und das Pellet in 25 Milliliter Lösung Nummer drei resuspendiert.Filtern Sie nun die Gewebelösung aus der Glasflasche in einen zweiten sauberen Becher, der mit einem neuen 30-Mikron-Mesh abgedeckt ist. Danach die Gewebelösung zentrifugieren und das erhaltene Pellet mit 25 Milliliter Lösung Nummer drei resuspendieren. Kombinieren Sie anschließend die beiden Geweberschlämme, zentrifugieren Sie die vereinigte Lösung erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter Kulturmedium für Portal-Fibroblasten. Zählen Sie abschließend die Zellen auf ihrer Vitalität hin und säen Sie etwa 0,5 bis 5 × 10⁶ Zellen pro 10 cm² Gewebekulturplatte aus.Hier werden repräsentative primäre Pfortaderfibroblasten am ersten, dritten und siebten Tag nach der Isolierung gezeigt. Beachten Sie, dass die Zellen langgestreckt sind und eine typische Fibroblasten-Morphologie aufweisen. Die Zellen können mit einem Anti-Elastin-Antikörper, hier grün dargestellt, angefärbt werden, um die Reinheit zu bestätigen.Außerdem beachten Sie, wie Portalfibroblasten in der Kultur eine myofibroblastäre Differenzierung durchlaufen, was in dieser Abbildung durch die rote Immunfärbung für alpha-smooth-muscle-Aktin demonstriert wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Portalfibroblasten aus einer roten Leber durch Ihre Leberperfusion isoliert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

Primäre Hepatozyten ein wertvolles Instrument, um biochemische, molekulare und metabolische Funktionen in einem physiologisch relevanten experimentellen Systems zu evaluieren. Wir beschreiben ein zuverlässiges Protokoll für Ratte in situ Leberperfusion, die konsequent erzeugt lebensfähigen Hepatozyten bis bis 1,0 ×...

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Leberperfusion von Mäusen durch die Pfortader unter Verwendung von Kollagenaselösung vor der Isolierung von Leberzellen.

In vivo murine Leberperfusion: Eine Methode zur Infusion der Nagetierleber mit Lösung über die Pfortader

Die gefensterte sinusoidale Endothelzelle der Leber ist ein biologisch wichtiges Filtersystem, das stark von verschiedenen Krankheiten, Toxinen und physiologischen Zuständen beeinflusst wird. Diese Veränderungen wirken sich erheblich auf die Leberfunktion aus. Wir beschreiben Methoden zur Standardisierung der Messung der Größe und Anzahl der Fenster in diesen Zellen.

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

Marginating-hepatische Leukozyten weisen im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Eigenschaften und unterschiedliche immunologische Funktionen auf. Hier beschreiben wir eine Methode zur selektiven Entnahme dieser spezifischen Leberzellpopulation durch erzwungene Perfusion der Leber von Ratten oder Mäusen. Marginating-hepatische Leukozyten scheinen entscheidend für die Bestimmung der Anfälligkeit für hepatische Erkrankungen und Metastasen zu sein.

Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten

Das Ziel dieses Protokolls ist, hohe Wirtschaftlichkeit und hohe Ausbeute von Hepatozyten und sinusförmigen endothelial Zellen von Leber zu erhalten. Dies geschieht durch die Vorrichtung der Leber mit einer Typ IV Kollagenase Lösung über die Pfortader, gefolgt von differentielle Zentrifugation, Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen zu erhalten.

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

Dies ist ein Protokoll, um Gewebe extrazelluläre Vesikel (EVs) aus der Leber zu isolieren. Das Protokoll beschreibt einen zweistufigen Prozess mit Kollagenaseperfusion, gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation, um Lebergewebe-EVs zu isolieren.

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziellen intravenösen Katalysators, eines standardisierten sterilen Einwegschlauchs, einer Temperaturregelung, die durch Echtzeitüberwachung ergänzt wird, und eines Alarmsystems für ein zweistufiges Kollagenase-Perfusionsverfahren, um die Konsistenz der Lebensfähigkeit, Ausbeute und Funktionalität isolierter primärer Rattenhepatozyten zu verbessern.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Das Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Resektion einer intakten Mausleber für Stoffwechselstudien durch Pfortaderperfusion.

Ex vivo Leberperfusion durch die Portalader in der Maus

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Lernen Sie die Isolierung primärer Portal-Fibroblasten aus Rattenleber durch In-situ-Perfusion mit Kollagenase. Diese Methode liefert reine Zellpopulationen ohne Kultivierung für Leberforschung.

Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch

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