Name: 确定最佳人力Her2neu特异性CD8 + T细胞的细胞毒活性的比较CR51发行含量xCELLigence系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学习使用xCELLigence阻抗系统和铬释放法比较检测抗原特异性CD8 T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。该方法实现实时无标记监测，具有更高灵敏度和更低细胞用量，适用于免疫学和癌症研究中的细胞毒性评估。

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本研究获得了凯斯·L·克努森（Keith L. Knutson）从苏珊·G·科曼乳腺癌研究基金会（Susan G. Komen for the Cure Foundation）以及美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI 9R01 CA152045 和 P50-CA116201）提供的资助。

1. 短期人源抗原特异性CD8 T细胞系的制备7
<ol>
 <li>使用Ficoll-paque plus从正常健康HLA-A2阳性供体的血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。</li>
 <li>将PBMCs以2 × 106 个细胞/ml的浓度加入6孔板中，每孔2 ml。</li>
 <li>直接向孔中加入HLA-A2结合的HER-2/neu p369-377肽段（氨基酸序列KIFGSLAFL）或HLA-A2结合的流感病毒p58-66肽段（GILGFVFTL），终浓度为10 μg/ml，并将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
 <li>为促进T细胞的活化与扩增，每隔2天向每孔加入250 μl新鲜培养基，其中补充人重组IL-2（储存液：50 单位/μl），使培养基中IL-2的终浓度达到50 单位/ml。</li>
 <li>在首次肽段刺激后一周，用经相同肽段（浓度10 μg/ml）孵育2小时并经照射处理的自体PBMCs（2 × 106 个细胞/ml）重新刺激培养细胞，并以每孔1 ml的体积加入培养体系中。</li>
 <li>按照步骤1.4所述方法，每隔2天向现有培养体系中添加人重组IL-2和新鲜培养基。</li>
 <li>在第二次肽段刺激后一周，按照步骤1.5所述方法，再次用肽段和经照射处理的自体PBMCs对细胞进行重新刺激。</li>
 <li>最后一次重新刺激后至少六天，方可准备使用细胞。</li>
</ol>
2. 乳腺癌细胞的制备
<ol>
 <li>将xCelligence阻抗测量仪（xCelligence站）置于含5% CO2的37 °C培养箱中。</li>
 <li>使用0.25%胰蛋白酶消化并离心（1,000 rpm，5分钟）收集处于75%融合状态的人肿瘤细胞（SKBR3、BT20、MCF7或HCC1419）。</li>
 <li>用血细胞计数板计数肿瘤细胞，并将其重悬于RPMI肿瘤细胞培养基（添加10%胎牛血清（FBS）和500单位/毫升IFN-γ）中，调整浓度为7.5 × 103个肿瘤细胞/100 μl。</li>
 <li>通过设置xCelligence软件的布局页面确定孔板布局，并在时间表页面设定程序，在40小时内每5分钟采集一次阻抗读数。前18小时，xCelligence系统仅对肿瘤细胞进行阻抗检测。</li>
 <li>向xCelligence E-板中每孔加入100 μl RPMI肿瘤细胞培养基，并在无细胞条件下进行背景阻抗读数。</li>
 <li>将肿瘤细胞以每孔100 μl的体积加入E-板中，并将E-板放入xCelligence测量仪内。</li>
 <li>点击xCelligence软件上的启动按钮，开始采集肿瘤细胞的阻抗读数，此时细胞立即开始贴附于E-板表面。</li>
</ol>
3. 肿瘤细胞与CD8 T细胞的共培养
<ol>
 <li>当肿瘤细胞已贴壁并增殖至每孔 1.5 × 104 个细胞（接种后约 18 小时），通过轻柔刮取和振荡收集第 1 节中制备的 T 细胞</li>
 <li>以 1,000 rpm 离心 5 分钟，使用血细胞计数板计数 T 细胞，并将其重悬于含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基中，按不同比例稀释，起始比例为每 1 个肿瘤细胞对应 40 个 T 细胞，随后进行 2 倍梯度稀释，直至达到每 1 个肿瘤细胞对应 1.25 个 T 细胞的比例。例如，每孔含有 1.5 × 104 个肿瘤细胞时，为实现 1:40 的比例，需向每孔加入 6 × 105 个 T 细胞，并进行 2 倍梯度稀释，直至每孔肿瘤细胞与 T 细胞数量分别为 1.5 × 104 和 1.875 × 104（即 1:1.25 的比例）</li>
 <li>暂停 xCelligence 仪器运行，取出 E-板</li>
 <li>用移液器吸除各孔中的培养基，每孔加入 200 μl 新鲜培养基，或含有相应比例 T 细胞的培养基</li>
 <li>将 E-板放回 xCelligence 仪器中，继续运行软件程序，使在加入 T 细胞后的约 20 小时内，每 5 分钟自动记录一次阻抗读数</li>
 <li>在实验结束时对结果进行归一化处理</li>
</ol>
4. 铬释放试验（CRA）7
<ol>
 <li>使用51Cr及51Cr标记的靶细胞时，应遵循所在机构的辐射安全操作规程。始终使用适当的屏蔽措施以减少辐射暴露。</li>
 <li>将肿瘤细胞以每毫升1×106个细胞的密度与10 μl/ml新鲜的51Cr（0.005 Ci/ml）共同孵育，脉冲标记2小时。</li>
 <li>用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基10 ml洗涤肿瘤细胞，1,000 rpm离心5分钟。将细胞重悬后加入96孔圆底培养板，每孔含1×105个肿瘤细胞，体积为100 μl。</li>
 <li>以不同比例加入T细胞，起始比例为1个肿瘤细胞对应40个T细胞，随后进行2倍系列稀释，直至达到1个肿瘤细胞对应1.25个T细胞的比例。例如，每孔含有1×105个肿瘤细胞时，为实现1:40的比例，每孔加入4×106个T细胞，并对T细胞进行2倍梯度稀释，直至每孔肿瘤细胞与T细胞数量分别为1×105和1.25×105（即1:1.25比例）。</li>
 <li>向培养板中加入自发释放对照组和最大释放对照组。为计算肿瘤细胞中51Cr的自发释放量，设置6个复孔，每孔加入100 μl含1×105个肿瘤细胞的悬液，再加入100 μl含10% FBS的RPMI培养基。为计算51Cr的最大释放量，设置另外6个复孔，每孔加入100 μl含1×105个肿瘤细胞的悬液，再加入100 μl含0.1% Triton X-100的PBS溶液，以完全裂解所有细胞。</li>
 <li>将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育5小时。</li>
 <li>孵育结束后，从每孔中吸取50 μl上清液，转移至Luma检测板中。</li>
 <li>将Luma板过夜干燥，随后使用γ计数仪测定每分钟计数（CPM）。</li>
</ol>
5. 裂解百分比计算
<ol>
 <li>阻抗检测法：在不同时间点获取阻抗读数，以细胞指数（CI）表示，并使用以下公式计算裂解百分比：(仅肿瘤细胞的CI - (肿瘤细胞 + T细胞的CI)) / 仅肿瘤细胞的CI × 100。</li>
 <li>细胞释放法（CRA）：使用以下公式计算裂解百分比：(实验组CPM - 自发释放组CPM) / (最大释放组CPM - 自发释放组CPM) × 100。</li>
</ol>
6. 代表性结果
单独的T细胞不会增加阻抗
通常情况下，T细胞不会黏附于大多数固体表面，且其活化和增殖不需要依赖黏附作用。因此，推测T细胞不应在xCelligence E-板上产生明显的阻抗信号。为验证这一点，实验在孔中分别接种了SKBR3乳腺癌细胞或 freshly purified human CD8 T细胞。在40小时期间内持续检测阻抗，图1A展示了一个代表性结果，表明T细胞本身几乎不产生阻抗变化。相比之下，有观点认为T细胞可能会轻微降低背景阻抗。尽管如此，共培养实验显示，在阻抗检测开始18小时后加入T细胞会导致阻抗信号出现短暂干扰（图1B）。其他研究发现，这种干扰部分源于操作过程中的物理扰动，因为若确保含T细胞的溶液温度与培养箱内部温度一致，信号的下降程度可明显减轻。
T细胞介导的阻抗降低呈剂量依赖性。
利用基于阻抗的检测方法比较样本中细胞毒性T细胞活性的有效性，取决于能够区分不同浓度的抗原特异性T细胞。为验证该方法是否可行，将SKBR3细胞与不同浓度的来源于HER-2/neu p369特异性T细胞系的T细胞进行共培养。如图2A所示，阻抗的降低程度依赖于T细胞的剂量。图2B显示，在T细胞浓度范围内，10小时时的细胞指数符合简单的二阶多项式关系。因此，xCelligence系统可通过细胞指数的下降，实时监测CD8 T细胞介导的SKBR3肿瘤细胞的死亡过程。
基于阻抗的检测法可检测抗原特异性T细胞
为了确定HER-2/neu和HLA-A2阳性的乳腺癌肿瘤细胞系SKBR3在HER-2/neu p369特异性T细胞作用下阻抗降低是否具有抗原特异性，另设独立孔组，将SKBR3细胞与来源于流感病毒（FLU）特异性T细胞系的T细胞共同孵育。FLU特异性T细胞作为非特异性对照，其虽为HLA-A2阳性，但无法识别HER-2/neu抗原。如图3所示，HER-2/neu p369特异性T细胞与FLU特异性T细胞之间的杀伤活性存在显著差异（p&lt;0.0001）。在某些情况下，非肿瘤特异性的T细胞（例如FLU特异性T细胞或经抗CD3/抗CD28刺激活化的T细胞）表现出较低水平的杀伤活性（图3A-B）。T细胞可通过两种方式介导杀伤：一种是非特异性的Fas:Fas配体相互作用，另一种是抗原特异性的颗粒酶和穿孔素释放。为进一步验证HER-2/neu特异性T细胞以抗原特异性方式杀伤靶细胞的假设，我们加入了抗Fas配体的阻断抗体。如图3B所示，该抗体并未降低HER-2/neu p369特异性T细胞的杀伤活性。然而，该抗体能够抑制Fas与Fas配体之间的相互作用，这一点已在经抗CD3/CD28磁珠非特异性激活的T细胞中得到证实。这些结果提示，当将肿瘤特异性T细胞与非肿瘤特异性T细胞进行比较时，可能需要采用Fas配体阻断策略，以将非TCR介导的相互作用降至最低。此外，在使用短期培养的T细胞系时，若其中仅有一部分T细胞对用于体外（ex vivo）扩增的抗原具有特异性，则可能发生由MHC不匹配介导的T细胞活化，从而导致非特异性裂解。在此情况下，添加阻断无关HLA分子的抗体可能是必要的。为了确定p369特异性T细胞是否以HLA I类分子依赖的方式杀伤肿瘤细胞，在共培养体系中分别加入抗HLA I类分子抗体或同型对照抗体。如图3C所示，加入抗HLA I类分子抗体后，p369特异性T细胞的裂解作用受到抑制，表明其杀伤效应受HLA I类分子限制。最后，由于本检测方法的建立主要基于SKBR3细胞，因此有必要验证其他表达HLA-A2和HER-2/neu的贴壁肿瘤细胞是否也能被p369特异性T细胞杀伤。因此，将T细胞以1:5的比例加入表达HLA-A2和HER-2/neu的肿瘤细胞SKBR3、MCF-7和HCC1419中。HLA-A2阴性的肿瘤细胞系BT20作为阴性对照。如图3D所示，除BT20外，所有其他肿瘤细胞均通过阻抗检测被证实可被杀伤。因此，该方法似乎适用于多种贴壁型肿瘤靶细胞。
基于阻抗的检测法在检测细胞毒性T细胞活性方面比标准的铬释放检测法更敏感
铬（51Cr释放试验（CRA）作为测量细胞溶解活性的长期金标准，被广泛用于监测CD8 T细胞应答。在该试验中，靶细胞（如肿瘤细胞）被标记上 51Cr。在大多数情况下，健康的靶细胞在检测过程中能够保留大部分放射性标记。将CD8 T细胞以通常不同的浓度加入靶细胞中，通过检测靶细胞释放的放射性标记物来判断其杀伤情况。 51Cr进入培养基。除了使用具有危害性的辐射外，CRA的另外两个主要问题是灵敏度不足，以及通常需要大量的CD8 T细胞，从而限制了其应用。为了确定基于阻抗的检测方法是否比CRA更灵敏，我们制备了针对HER-2/neu p369特异性的T细胞 体外 并以不同量分别加入含有未标记肿瘤细胞的E-板或标准聚丙烯板中 51Cr标记的靶细胞。在加入T细胞5小时后，检测阻抗或游离铬含量。 图4一个代表性示例表明，阻抗检测法优于铬释放法。
基于阻抗的检测方法在同一批次内的变异通常低于20%。
由于该检测方法的广泛应用在很大程度上取决于其可重复性和变异程度，因此对其批内变异进行了考察（图5）。两条特异性针对p369的T细胞系分别独立建立，间隔30天，并以不同肿瘤细胞与T细胞比例设置三个复孔进行实验。图5中的插图显示，这两条T细胞系在裂解SKBR3细胞方面基本相当。在每种细胞比例下计算变异系数（CV）的百分比并作图。如图5所示，在1:40至1:5的比例范围内，%变异系数低于15%。然而，在1:2.5和1:1.25的比例下，变异系数较高或不可预测。由于存在较大的生物学变异，无法使用原代T细胞系来评估批间变异。
<img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig1.jpg" alt="肿瘤与T细胞相互作用、随时间变化的细胞指数曲线图、免疫应答实验结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">
 图1. 添加T细胞后需对阻抗信号进行归一化处理。图A： 显示仅肿瘤细胞（红线）而非T细胞（蓝线）产生阻抗信号。图中展示了单独培养的肿瘤细胞或T细胞在40小时内的阻抗变化曲线。另一项独立实验也获得了相似结果。请注意，约20小时处的信号扰动代表向不含肿瘤细胞的孔中添加T细胞的时间点。图B： 显示将T细胞加入肿瘤细胞后，阻抗测量信号出现短暂干扰，因此需要在添加T细胞后的某个时间点进行信号归一化处理（见图中标记的归一化时间点）。所有曲线均基于重复实验数据点绘制。单独肿瘤细胞的曲线以红色表示；其余曲线代表肿瘤细胞与HER-2/neu p369特异性T细胞共培养的结果（蓝色：T细胞与肿瘤细胞比例为1.25:1；绿色：比例为40:1）。每条曲线均由培养期间每5分钟采集一次的重复数据计算得出。结果为3次独立实验的代表性数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig2.jpg" alt="T细胞对肿瘤细胞指数的影响；图表显示了不同时间及加入T细胞后细胞比例与指数的变化。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2">
 图2. T细胞介导的阻抗降低呈剂量依赖性。图A： 显示单独培养的SKBR3肿瘤细胞，或与不同浓度的肿瘤特异性T细胞共培养时的阻抗变化曲线。每条曲线基于培养期间每5分钟采集的三个重复数据点计算得出。结果代表3次独立实验。图B： 显示在10小时时，所有T细胞/肿瘤细胞浓度下的细胞指数。虚线表示仅肿瘤细胞的细胞指数。每个符号代表三次重复测定的平均值（±标准误）。结果代表3次独立实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig3.jpg" alt="使用柱状图和散点图显示裂解百分比，分析FasL对T细胞毒性的效应。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3">
 图3. 基于阻抗的检测法可检测抗原特异性的细胞毒性T细胞反应。图A 显示HER-2/neu p369特异性T细胞（红色）或FLU特异性T细胞（蓝色）在共培养后5、10和15小时对SKBR3细胞的裂解水平。每个数据点为三次重复测量的平均值（±标准误）。结果代表3次独立实验。 图B 显示p369特异性T细胞或非特异性活化的T细胞对SKBR3细胞的裂解，表明抗原特异性裂解并非由Fas-Fas配体相互作用引起。黑色柱代表共培养体系中添加了Fas配体抗体的条件。每根柱为T细胞加入后5小时三次重复的平均裂解率（±标准误）。结果代表3次独立实验。 图C 显示p369特异性T细胞在加入SKBR3细胞10小时后的裂解作用依赖于HLA-I类分子。共培养期间加入了HLA-I类分子阻断抗体或同型对照抗体。每根柱为三次重复的平均裂解率（±标准误）。该实验重复两次，结果相似。 图D 显示p369特异性T细胞对多种HLA-A2阳性且表达HER-2/neu的肿瘤细胞系在T细胞加入10小时后的裂解百分比。BT20是一种HLA-A2阴性的乳腺癌细胞系，用作阴性对照。每个点代表一次独立实验，由三次重复测定计算得出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" alt="肿瘤T细胞比率图，阻抗检测法与铬释放法，裂解率分析，实验结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 基于阻抗的检测法在检测肿瘤抗原特异性T细胞方面比铬释放检测法更敏感。 图中显示了使用阻抗检测法和铬释放检测法，在肿瘤细胞与T细胞共孵育5小时后，不同浓度的p369特异性T细胞对SKBR3细胞的裂解率（%）。每个数据点表示三个重复样本的平均值（±标准误）。结果代表了三次独立实验的典型数据。
<img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig5.jpg" alt="肿瘤：T细胞比例与%CV关系图，插图显示裂解率；免疫应答数据分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 基于阻抗的T细胞细胞毒性实验的板内变异系数（%CV）。 图中显示了在不同浓度抗原特异性T细胞作用下，裂解SKBR3细胞的板内变异系数（%CV）的平均值（±SD）。每个符号代表三个重复的均值。图中所示数字为平均%CV值。插图显示了在不同浓度p369-377特异性T细胞作用下，SKBR3细胞裂解率的平均值（±s.e.m, n=3）。图中展示了使用来自两个不同供体的T细胞分别独立建立的两条p369特异性T细胞系。

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<li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor%2C+viral+peptide+and+HLA-A2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li>
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</ol>

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CD8 T细胞在适应性免疫应答中具有重要作用，能够直接杀伤被感染的细胞或恶性细胞4. 尽管有多种方法可用于检测抗原特异性CD8 T细胞数量（如ELIspot、四聚体、流式细胞术），但通常更有助于了解这些细胞是否具有功能性的细胞毒性3评估细胞毒功能最广为人知的检测方法是细胞毒性释放试验（CRA），该方法被视为金标准检测。4CRA 的主要局限性包括：（1）需要使用放射性物质，（2）灵敏度不足，（3）无法提供机制性信息，（4）需要大量细胞，以及（5）操作繁琐。因此，在过去十年中，人们逐渐关注采用新策略以尽量减少这些局限性。较新的方法包括检测caspase释放的方法4，BLT酯酶活性5，以及CD107的表面表达6本文稿表明，在罗氏xCelligence系统上进行的基于阻抗的检测方法也可作为克隆形成分析法（CRA）的一种替代方案。采用基于阻抗方法的可行性依据在于：T细胞对表面黏附性较弱，对阻抗信号影响甚微，因而基本无需担忧T细胞对检测结果产生直接干扰。使用阻抗检测系统所需的劳动量预计将显著减少，主要原因是无需处理放射性物质所带来的监管问题。基于阻抗检测系统的唯一明显缺点是需投入50,000至60,000美元购买xCelligence设备。然而，该设备无需配备放射性计数仪，且功能更加多样，除可用于检测T细胞杀伤活性外，还可用于评估药物对细胞的效应以及细胞迁移等。 8.
如图2所示，肿瘤细胞阻抗的降低呈剂量依赖性，且其变化曲线符合简单的二次函数关系，斜率较为陡峭，这表明该检测方法可用于有限稀释分析（LDAs），以估算细胞毒性细胞的频率9。基于阻抗的方法的一个优势在于，其所需的T细胞和肿瘤细胞数量少于传统铬释放法（CRA），从而使有限稀释分析更具可行性。例如，在CRA中，当效靶比为1:40时，每孔需接种1 × 105个肿瘤细胞，相应地每孔需要4 × 106个T细胞。而在基于阻抗的检测中，每孔仅需1.5 × 104个肿瘤细胞，相应消耗的T细胞总数仅为每孔6 × 105个。因此，基于阻抗的检测方法可减少85%的T细胞和肿瘤细胞使用量。这种显著减少提示，基于阻抗的系统可能适用于人体临床试验中的免疫学监测，尤其是在采血量有限的情况下。此外，CRA仅能提供单一时间点的数据，而基于阻抗的检测可连续采集实时数据，使研究者能够在同一次实验中比较多个裂解时间点，且无需额外耗费大量人力和细胞。频率计算结果还可与其他不依赖功能检测的方法（如四聚体分析）相结合，用于确定功能性细胞毒性T细胞与总抗原特异性CD8 T细胞之间的比例10。基于阻抗方法最吸引人的特点之一是，与其他大多数检测方法不同，它能够实时监测细胞毒性效应，从而更便于利用抑制剂或抗体研究细胞间的相互作用。另一个优势是，该方法可能适用于那些难以标记的肿瘤细胞。最后，由于未被杀伤的肿瘤细胞未被标记且保持无菌状态，因此可进一步收获并用于对T细胞抵抗性细胞的研究。
总之，尽管两种系统均可提供特定T细胞介导的肿瘤杀伤数据，但基于阻抗的检测方法比CRA更敏感，并且提供了更灵活的实验平台。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>用于从血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs） </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>细胞培养基 </td></tr><tr><td>FBS </td><td>德文特科学公司</td><td>FB5001-H</td><td>细胞培养基 </td></tr><tr><td>人 IL-2 </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>用于刺激T细胞生长 </td></tr><tr><td>人干扰素γ </td><td>细胞科学</td><td>CR2026</td><td>用于刺激肿瘤细胞中MHC的表达 </td></tr><tr><td>HER-2/neu p369-377 肽 </td><td>梅奥诊所多肽合成中心</td><td>氨基酸序列 KIFGSLAFL</td><td>与 HLA-A2 结合 </td></tr><tr><td>流感病毒p58-66肽 </td><td>梅奥诊所多肽合成中心</td><td>氨基酸序列 GILGFVFTL</td><td>与 HLA-A2 结合 </td></tr><tr><td>人CD3/CD28 Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>用于非特异性T细胞活化与扩增 </td></tr><tr><td>铬-51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>CRA标记试剂 </td></tr><tr><td>E-板 </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 罗氏集团</a></td><td>05469830001</td><td>用于 xCelligence 阻抗仪 </td></tr><tr><td>Luma 96 孔板 </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>用于在Top Count NXT中测量放射性活性。 </td></tr><tr><td>xCelligence RTCA DP 站 </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 罗氏应用科学</a></td><td>RTCA DP</td><td>阻抗单位 </td></tr><tr><td>顶部计数 NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>闪烁 &amp;amp; 发光计数器 </td></tr><tr><td>Fas配体 抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>556372</td><td>用于阻断 Fas-Fas 配体 相互作用</td></tr><tr><td>HLA-A2 BB7.2 抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>551230</td><td>用于阻断 HLA I 类分子</td></tr><tr><td>小鼠 IgG2b， &amp;#954;</td><td>BD 生物科学</td><td>555740</td><td>HLA I类分子同型对照</td></tr><tr><td>SKBR3 肿瘤细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>腺癌</td></tr><tr><td>MCF7 肿瘤细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>腺癌</td></tr><tr><td>HCC1419 肿瘤细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>原位导管癌</td></tr><tr><td>BT20 肿瘤细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>癌</td></tr></tbody></table>

通过比较cr51释放实验与xcelligence系统确定人her2/neu特异性cd8 t细胞的最佳细胞毒活性

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

细胞毒性CD8 T细胞是T细胞的一个亚群，能够诱导被感染或恶性宿主细胞的死亡1这些细胞表达一种特化的受体，称为T细胞受体（TCR），能够识别与HLA I类分子结合的特异性抗原肽2通过HLA I类分子识别被感染细胞或肿瘤细胞，可导致颗粒酶和穿孔素等溶细胞分子的产生，进而引起靶细胞死亡。尽管使用ELIspot或流式细胞术等方法检测抗原特异性CD8 T细胞频率具有重要意义，但通过细胞毒性实验评估CD8 T细胞应答的强度也同样具有价值。3评估细胞毒功能最常用的检测方法是铬释放试验（CRA），该方法被视为标准检测手段。 4CRA 存在若干局限性，包括细胞暴露于伽马辐射、缺乏可重复性以及需要大量细胞。在过去十年中，人们逐渐关注采用新策略以克服这些局限性。较新的方法包括检测caspase释放的方法 4，BLT酯酶活性 5 CD107的表面表达 6基于阻抗的检测方法在本研究中利用罗氏xCelligence系统，探讨其作为传统细胞毒性T细胞反应（CRA）检测替代方案的潜力。当贴壁肿瘤细胞结合至电极板时，会产生对电流的阻抗或阻力；肿瘤细胞在被杀伤后发生脱落，导致电学阻抗降低，这一变化可由xCelligence系统实时测量。将基于阻抗的方法用于评估细胞介导杀伤的可行性，依赖于以下观察结果：T细胞通常不易紧密黏附于大多数表面，且对阻抗信号影响甚微，因而显著降低了T细胞对检测信号直接干扰的可能。结果表明，相较于标准CRA，基于阻抗的检测方法在检测抗原特异性细胞毒性CD8 T细胞水平变化时具有更高的灵敏度。基于上述结果，基于阻抗的检测技术可能成为CRA或其他旨在评估细胞毒性CD8 T细胞功能的方法的良好替代选择。

关键词：阻抗检测，xCelligence系统，细胞毒性CD8 T细胞，细胞介导杀伤，肿瘤细胞，电学阻抗，CRA

铬释放试验是一种检测细胞毒性T细胞活性的常用方法，但存在若干局限性。本文利用抗原特异性的CD8 T细胞和人乳腺癌肿瘤细胞系SKBR3，考察了一种基于阻抗的方法在检测细胞杀伤能力方面的可行性。

通过比较Cr51释放实验与xCELLigence系统确定人HER2/neu特异性CD8 T细胞的最佳细胞毒活性

细胞毒性CD8+ T细胞是T细胞的一个亚群，能够诱导被感染或恶性宿主细胞的死亡1。这些细胞表达……

以下实验的总体目标是通过比较基于阻抗的EXOGEN系统方法与铬释放实验，来测定细胞毒性T细胞的活性。第一步是利用菲可分离液从全血中分离外周血单个核细胞。接下来，将PBMC与肽类抗原、人重组IL-2以及经辐照的PBMC一同加入孔板中，以生成抗原特异性的CD8 T细胞。在两种检测中，抗原特异性的CD8+ T细胞随后与肿瘤细胞共培养，以诱导肿瘤细胞死亡。通过阻抗法和铬释放实验均可获得结果显示肿瘤细胞的裂解百分比。与现有的铬释放实验等方法相比，该技术的主要优势在于基于阻抗的系统能够采集实时数据，并且所需细胞数量更少，且无需任何标记。在本实验方案中，来自健康HLA-A*02阳性供体的血液可作为外周血单个核细胞（PBMC）的来源，具体操作遵循制造商的说明书。使用F型细胞分选仪（F call PA plus）从血液中分离外周血单个核细胞（P BMCs）。随后，将约400万个P BMCs加入六孔板中，每孔加入2毫升培养基。每孔加入HLAA二聚体结合肽，使其终浓度为10微克/毫升培养液。每隔一天更换培养基，以促进T细胞的刺激与扩增。加入含有重组人IL-2的新鲜培养基，使其终浓度为每毫升50个单位。一周后，制备自体PBMC培养物，对细胞进行照射处理，并用相同的HLA分子脉冲致敏两小时。以每毫升10微克的双结合肽重新刺激培养物，向每个样本中加入一毫升经照射的自体外周血单个核细胞。继续每隔一天补充含有IL-2的新鲜培养基，一周后以相同方式第二次重新刺激培养物。再经过六天培养后，细胞即可用于后续实验。将智能阻抗检测仪置于5%二氧化碳环境中，于37摄氏度平衡至少1小时，以准备使用。用0.25%胰蛋白酶消化并结合离心法收集75%融合度的人肿瘤细胞。使用血细胞计数板对肿瘤细胞进行计数，并将其重悬于RPMI培养基中。肿瘤培养基浓度为每微升7,500个细胞。接下来，Excel代理软件设置带有孔板布局的页面。设置时间表页面，要求在40小时期间内每5分钟采集一次阻抗读数；在前18小时内，Xceligent系统仅采集肿瘤细胞的阻抗读数。然后每孔加入 100 µL RPMI 肿瘤培养基。在未接种细胞的情况下，通过测量阻抗获取 EPLs 的背景读数。加入肿瘤细胞后，将培养板放入 thence 站点并开始采集读数。肿瘤细胞将立即开始黏附到EPL上。经过约18小时的培养后，肿瘤细胞已附着于EPL，并增殖至每孔15,000个肿瘤细胞。此时，通过轻柔刮取并振荡离心收集已准备好的T细胞。将T细胞重悬于含10% FBS的RPMI培养基中，并使用血细胞计数板进行计数。确定细胞密度后，制备T细胞的两倍系列稀释液，使得当200微升T细胞加入肿瘤细胞时，最高浓度为每肿瘤细胞40个T细胞。系列稀释的最后一个浓度应为每肿瘤细胞1.25个T细胞。暂停 EXOGEN 仪器，使用移液器取出 EPL。吸除孔中的培养基，然后使用稀释系列中的所有浓度 T 细胞作为阴性对照，每孔加入 200 微升。使用纯培养基，将 EPL 放回仪器，继续运行程序直至检测结束。标准化结果。在使用铬51及铬51标记的靶细胞时，务必遵循机构的辐射安全规程，并使用屏蔽装置以减少辐射暴露。首先，将肿瘤细胞以每毫升100万个细胞的浓度与新鲜的铬51按每毫升10微升的量共同孵育2小时。接下来，用 10 毫升含 10% FBS 的 RPMI 培养基洗涤肿瘤细胞，离心后重悬于相同培养基中，浓度为每毫升 100 万个细胞。然后向 96 孔圆底培养板中每孔加入 100,000 个肿瘤细胞，用于计算自发释放率。在其中六个孔中不添加任何物质，而在另外六个孔中加入100微升Triton X-100以裂解细胞，从而计算最大释放量。使用先前配制的系列稀释液将T细胞加入到培养板中。现在将培养板孵育5小时，并从每个孔中收集50微升上清液样品，在室温下于生物安全柜中过夜干燥后，将样品加样至luma板。使用γ计数器检测T细胞和SKBR3癌细胞的CPM。癌细胞在X智能培养板中培养，测定细胞指数，该指数反映培养板的阻抗，因为T细胞增殖无需贴壁。在40小时的培养过程中，它们对阻抗的影响可忽略不计。单独培养的癌细胞显示出阻抗测量值持续上升。然而，在18小时加入T细胞后，这一趋势被打破。该事件在加入T细胞后需要进行软件归一化处理，并将在下一个实验中进一步研究。当SK BR 3细胞与不同浓度的T细胞共培养时，阻抗的降低表现出明显的剂量依赖性；数据在三次重复实验中每五分钟采集一次，直至10小时时间点。在T细胞浓度范围内，细胞指数符合二阶多项式变化趋势，表明Exogen系统能够实时监测CD8+ T细胞介导的SK B 3肿瘤细胞死亡过程，其表现为细胞指数下降。为确定T细胞引起的SK BR 3细胞阻抗降低是否具有抗原特异性，将SK KBR三个细胞与HLA A2阳性的流感特异性T细胞进行共培养，这些T细胞不识别HER2新抗原。这些细胞的裂解活性显著较低。为了进一步确定HER2新抗原特异性T细胞是否以抗原特异性方式杀伤靶细胞，将抗Fas配体抗体加入共培养体系中。该抗体并未降低HER2新抗原P360-9特异性T细胞的裂解活性。然而，对于通过抗 CD3 和 CD28 磁珠非特异性激活的 T 细胞，该抗体确实抑制了裂解作用，以确定杀伤是否以 HLA I 类分子依赖的方式发生。在共培养体系中分别加入了抗 HLA I 类抗体或同型对照抗体。实验结果为此假设提供了强有力的支持。随后将T细胞以1比5的比例与其它癌细胞共培养。HLA-A2阴性的肿瘤细胞系BT-20被用作阴性对照。结果显示，该方法适用于多种靶向贴壁肿瘤细胞。将HER2新P3609特异性T细胞与经铬51标记的靶细胞进行共培养，随后进行CRA分析。该检测方法在分析一致性方面表现出更高的敏感性。批内变异系数通过计算每个细胞比例（1:40至1:5）下的变异百分比得出。在最低细胞比例下，该值低于15%。然而，变异系数（CV）较高或不可预测。此外，还检测了不同P3609特异性T细胞系与SK-BR-3细胞共培养时对T细胞溶解作用的变异性。数据相隔30天生成。实验均设三个重复，结果非常相似。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基于阻抗的方法，通过抗原特异性的CD8 T细胞和肿瘤细胞来测定细胞毒性T细胞的活性。

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