Name: Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie den Nachweis invasiver pulmonaler Aspergillose bei hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie. Diese Methode ermöglicht die schnelle Detektion von Aspergillus-Antigenen in Serum und BAL-Flüssigkeiten.

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1. Sammlung, Lagerung und Vorbereitung von Serum-und bronchoalveolären Lavage <ol><li> Serum, entnommen aus unbehandelten Blutproben, indem sie die Blutgerinnung bei 4 ° C, und speichern Serum als Aliquots bei -20 ° C erwärmen lassen. Bronchoalveolären Lavage (BAL) sollte auch als Aliquots bei -20 ° C gelagert werden Hinweis: Die Lagerung von Serum und BAL als Aliquots das Potenzial für den Abbau der Ziel-Antigen, das durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben während einer Wiederholung des Tests begrenzt. </li><li> Tauwetter Proben und mischen Sie die Serum und BAL-Proben gründlich durch Vortexen und Zentrifugation für 1 min bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Für die Routineprüfung der menschlichen Serumproben, verdünnt das Serum 1:1 (v / v) mit Gewebekulturmedium (TCM). TCM besteht aus RPMI-1640-Medium, 10% (v / v) fötalem Kälberserum, 1% (v / v) von 200 mM L-Glutamin-Lösung, und Natriumazid (0,02% w / v) als Konservierungsmittel. Das Medium wird im Voraus vorbereitet und können bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert werden. Tragen Sie 100 ul der DILUTed Serum auf die LFD. </li><li> Für menschliche BAL-Flüssigkeiten, und für BAL-Flüssigkeiten aus Tiermodellen, gelten 100 ul Probe ordentlich auf die LFD, ohne Vorbehandlung. </li><li> Für Serum von Tiermodellen, verdünnte Serum 1:2 (v / v) mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, enthaltend 4% (w / v) EDTA, Wärme für 3 min in einem kochenden Wasserbad, Zentrifuge für 5 min bei 14.000 rpm und Einsatzes von 100 ul des reinen Überstands an die LFD-Gerät. </li></ol> 2. Anwendung von Serum und BAL auf die Lateral-Flow Geräte- <ol><li> Lagern Sie die Lateral-Flow-Geräten bei Raumtemperatur (23 ° C). Bei dieser Temperatur sind Geräte für 12 Monate stabil. Entfernen Sie die Geräte aus den Beuteln und Ort auf einer ebenen Fläche. </li><li> Mit einer sterilen Pipettenspitze, gelten 100 ul vorbehandelten Serum oder ordentlich BAL-Probe zur Freisetzung Port des Geräts. </li><li> Lassen Sie die Assay für 15 Minuten bei Raumtemperatur, zu welchem ​​Zeitpunkt die Ergebnisse der Prüfungen aufzuzeichnen ausgeführt werden soll. Hinweis: Innerhalb von Sekunden wird die Flüssigkeit an sich seinde durch Kapillarwirkung entlang der Nitrocellulose-Membran im Beobachtungsfenster zu migrieren. </li></ol> 3. Aufnahme und Interpretation LFD Ergebnisse <ol><li> Die LFD besteht aus einem internen Steuerleitung (angedeutet durch den Buchstaben C auf dem Kunststoff-Gehäuse) und eine Testlinie (gekennzeichnet mit dem Buchstaben T). Die Steuerung sollte in jedem Fall unabhängig von Aspergillus-Antigen werden im Serum oder BAL-Probe. Dies zeigt, dass der Test korrekt ausgeführt werden. </li><li> Wenn die Aspergillus-Antigen im Serum oder BAL-Probe, wird die Testlinie auch innerhalb 15 Minuten der Probe Anwendung angezeigt. Da die Intensität der Testlinie ist proportional zu der Menge von Aspergillus-Antigen in der Probe vorhanden, die Testlinie kann schwach positiv (+) angezeigt wird, eine moderate positiv (+ +) oder als stark positiv (+ + +) . Jedoch eine beliebige positive Testleitung, unabhängig von Intensität, deutet dies auf der Aspergillus-Antigen in der Probe. In the Abwesenheit von Aspergillus-Antigen, wird keine Testlinie erscheinen, und das Ergebnis wird als negativ aufgenommen (-). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Beispiele für negative, schwach positive, mäßig positive und stark positive Ergebnisse mit LFD BAL und Serum-Proben sind in Abbildung 1 dargestellt. Ergebnisse der Antigen-positiven Tests LFD (schwache und starke) oder negativ LFD Tests mit BAL-Flüssigkeiten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach Anspruch EORTC / MSG diagnostischen Kriterien diagnostiziert werden in Tabelle 1 gezeigt. In dieser Tabelle sind die entsprechenden klinischen und mykologischen (Galaktomannan und Kultur) Daten und Ergebnisse einer Aspergillus-spezifischen PCR-Test in St. Bartholomews Krankenhaus 8 entwickelt, für jeden Patienten. Die Diagnose der Krankheit wurde am Wirtsfaktoren (Neutropenie, verlängerter Einsatz von Kortikosteroiden, Behandlung mit anderen anerkannten T-Zell-immunos Basisuppressants), klinische Kriterien und GM Positivität für BAL (hier als GM-Index-Wert&gt; 0,8 definiert). Unter den 2002 EORTC / MSG-Richtlinien 10, Patienten, 12, 13 und 16 wurden mit &quot;möglich&quot; IA auf der Basis von Host-Faktoren und klinischen Kriterien oder GM Positivität diagnostiziert. Nach den revidierten (2008) EORTC / MSG-Richtlinien 2, Wirtsfaktoren und GM Positivität allein oder Host-Faktoren und klinischen Kriterien allein würde nicht darauf hin, &quot;möglich&quot; invasiven Pilzinfektion, es sei denn durch Belege aus klinischen Daten und Mykologie bzw. begleitet. Patient 6 wurde mit &quot;wahrscheinlich&quot; IA unter beiden Richtlinien 2002 und 2008 wegen der Wirtsfaktoren, größere und kleinere klinische Merkmale und GM Positivität diagnostiziert. Beachten Sie, dass, während weder die LFD noch PCR-Assays zur Zeit in EORTC / MSG-Richtlinien enthalten sind, gibt es starke Übereinstimmung zwischen den beiden Assays und der kommerziellen Galaktomannan Test auf das Vorhandensein von Aspergillus-Antigen und Nukleinsäure in der BAL-Probe<html> s der Patienten 6 und 12. Zusätzliche Ergebnisse von Studien, die die Wirksamkeit der LFD und PCR-Test bei der Diagnose von IPA kann in Johnson et al 8 zu finden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> Abbildung 1. Negativ (Steuerleitung nur) und positiven (Kontroll-und Testlinie) Ergebnisse der Tests mit LFD Serum und BAL. Die Intensitäten der Testlinie Reaktionen sind proportional zu den Konzentrationen der Ziel-Antigen im Serum und BAL-Proben. Reaktionen typischerweise im Bereich von schwach (+) durch moderate (+ +) bis stark (+ + +). Unabhängig von Testlinie Intensität würden alle drei Serum-positiven Reaktionen zeigen Lungenaspergillosen Krankheit aufgrund der Anwesenheit von zirkulierenden Aspergillus-Antigen im Blut. Positiv BAL Reaktionen (schwach, mittel oder stark) würde anzeigen, Keimen der Sporen und Entwicklung von potentiell pathogenen Hyphen in der Lunge. pdflinebreak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Patient nicht. </td><td> PatiHNO-Informationen </td><td> Klinische Kriterien 1 </td><td> BAL Kultur 2 </td><td> GM EIA Index 3 </td><td> EORTC / MSG (2002) 4 </td><td> EORTC / MSG (2008) 5 </td><td> Aspergillus PCR-Ergebnis </td><td> LFD Ergebnis </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td> Große CT Zeichen (Knötchen und Halo) und eine kleinere </td><td> Negativ </td><td> 0,9 (positiv) </td><td> Wahrscheinlich </td><td> Wahrscheinlich </td><td> Positiv </td><td> Schwache positive (+) </td></tr><tr><td> 12 </td><td> Aus Mangel an früheren Pilzinfektion </td><td> Kein großer, ein minderjähriges </td><td> Candida glabrata </td><td> 6,43 (stark positiv) </td><td> Möglich </td><td> Keiner </td><td> Positiv </td><td> Starke positive (+ + +) </td></tr><tr><td> 13 </td><td> Koagulase-negative Staphylokokkenylococcus und E. coli im Blut </td><td> Keine große, zwei kleinere </td><td> Negativ </td><td> 0,25 (negativ) </td><td> Möglich </td><td> Keiner </td><td> Negativ </td><td> Negative (-) </td></tr><tr><td> 16 </td><td> Brust-Infektion </td><td> 3 Minor Kriterien einschließlich neuer infiltrieren und Plural Erguss </td><td> Negativ </td><td> 0,16 (negativ) </td><td> Möglich </td><td> Keiner </td><td> Negativ </td><td> Negative (-) </td></tr></tbody></table> Ein Knötchen oder Halos auf einer Computertomographie ist suggestive der Pilzinfektion 2 Candida glabrata in der BAL würde als Verunreinigung angesehen werden, da es die zweithäufigste Hefe als Teil der normalen menschlichen Flora 9 isoliert ist 3 Ein Index von&gt; 0,8 in der GM EIA Test der BAL ist bezeichnend für Aspergillus-Infektion 4 auf den 2002 EORTC / MSG diagnostischen Kriterien für &#39;Basierend possible &quot;,&quot; wahrscheinlich &quot;oder&quot; bewiesen &quot;invasive Pilzerkrankung 10 5 auf den überarbeiteten (2008) EORTC / MSG diagnostischen Kriterien für &quot;möglich&quot;, &quot;wahrscheinlich&quot; oder &quot;bewiesen&quot; invasive Pilzerkrankung 2 Basierend Tabelle 1. Die Ergebnisse der Tests von LFD BAL-Proben von akuter myeloischer Leukämie Patienten mit wahrscheinlicher IPA und Kontrolle von AML-Patienten (keine Anzeichen einer Infektion) und EORTC / MSG Diagnose einer Infektion.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Definitive Identifizierung von IPA können nur dann wirklich durch Isolierung der Erreger aus Biopsie-Proben erreicht werden, sondern Wiederherstellung geeigneter Proben ist häufig nicht in sehr kranken Patienten möglich und Aspergillus ist selten wiederherstellbar aus dem Blut. Während die großen Fortschritte in der Anwendung von Computertomographie Abtasten der Brust in IPA Diagnose gemacht worden sind, sind Eigenschaften, die suggestive der pulmonalen IPA wie der &quot;Halo&quot; oder &quot;Luft-Halbmond&quot;-Schilder sind entweder flüchtig oder kann, um die Atmung Artefakten zugeschrieben werden oder andere Pilzinfektionen 11,12. Solche Daten sind deshalb mit serologischen Techniken, die zur Unterzeichnung Moleküle (GM und β-Glucan) aus Pilzen, die im Serum des Patienten im Umlauf sind oder, die in BAL-Flüssigkeiten, Sputum oder Urin-Proben ermittelt werden, 13 sind ergänzt. Während diese Tests zufriedenstellend Empfindlichkeit zeigen, fehlt ihnen ausreichende Spezifität oder leiden an Störungen unter bestimmten Bedingungen 1,6 </sup&gt;. Die LFD-Test für den IPA-Erkennung hier vorgestellten ermöglicht das &quot;Point-of-Care&quot; Diagnostik von IPA und Exploits Technologie, die verwendet wurde, um in Tests für den Nachweis von Viren, Bakterien, Parasiten und Giftstoffe 14-19 Laufenden und, am bekanntesten, für die Schwangerschaftstests zuerst von Unipath 1988 eingeführt. In der hier beschriebenen Aspergillus LFD wird die Aspergillus-spezifischen MAb JF5 einer Einfangzone (die Testlinie) auf einer porösen Nitrozellulosemembran immobilisiert. Anti-Maus-Immunglobulin immobilisiert auf die Membran in einer gesonderten Zone diente als eine interne Kontrolle (control line). Bei Zugabe von Serum oder BAL-Flüssigkeit zu der Öffnung für die Freisetzung bindet MAb JF5-Gold-Komplexe in der Freigabestellung Kontaktstelle mit der Ziel-Antigen und der Komplex dann entlang der porösen Membran durch Kapillarwirkung. MAb JF5 in der Abfangzone immobilisiert bindet an die JF5-Gold-Antigen-Komplexes, was zu einer roten Testlinie. Nicht gebundenes JF5-GoldKonjugat bindet an die interne Kontrolle darauf hinweist, dass der Test korrekt ausgeführt werden. Dies führt zu einer rote Kontrolllinie. Der Test ist schnell, wobei nur 15 Minuten zu führen, ist billig im Vergleich zu Serum und BAL Tests an GM und β-Glucan-Erkennung basiert und erfordert keine teure Ausrüstung oder umfangreiche Laboreinrichtungen zu laufen. Darüber hinaus bedeutet MAb JF5 nicht mit den Drogen oder Verunreinigungen, die gezeigt haben, um falsch-positive Reaktion in der GM-und β-Glucan-Tests 1,4,6 verursachen kreuzreagieren. Ein weiterer großer Vorteil gegenüber aktuellen diagnostischen Tests ist die Fähigkeit, LFD Aktivität, die indikativ für invasive Wachstum von Aspergillus-Spezies ist zu erkennen. Ein entscheidender Schritt bei der LFD Verfahren ist die Notwendigkeit zum Lesen der Ergebnisse von 15 min nach Anwendung des Serum oder BAL auf die Vorrichtung. Der Test sollte nicht länger als 15 min vor der Aufnahme die Ergebnisse gelassen werden, da dies zu Verzerrungen führen könnte interpretatiauf. Eine schwache Reaktion wird nicht durch die Verlängerung der Inkubationszeit verbessert werden. Wärmebehandlung von Serum aus Tiermodellen der Infektion wurde vor dem Test die Empfindlichkeit zu verbessern. Eine Einschränkung des Tests ist, dass es qualitative ist, und setzt auf die Betreiber, um eine subjektive Einschätzung der Positivität zu machen. Die Intensität der Testlinie variiert je nach den Antigen Inhalt Serum und BAL-Proben (1). Jedoch zeigt eine positive Reaktion (bestimmt durch Vergleich mit bekannten Negative) das Vorhandensein von Aspergillus Antigen und daher Infektion. Um die Subjektivität der LFD-Assays zu begrenzen, sind Handheld-Geräte verfügbar, die es erlauben die Quantifizierung der LFD Testlinie Intensitäten und ermöglichen die Festlegung von Schwellenwerten für Antigennachweis 20. Zukünftige Entwicklungen des LFD sind seine Kommerzialisierung und die Entwicklung eines Multiplex-LFD, die simultane Detektion von anderen invasiven Pilzerreger erlaubtmit hochspezifischen MAbs 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Aspergillus LFD </td><td> University of Exeter </td><td></td><td> Frei ab dem entsprechenden Autor auf Anfrage </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Sigma </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Kälberserum </td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td> Andere Quellen von fötalem Kälberserum in der Herstellung von TCM verwendet werden </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis des invasiven pulmonale aspergillose bei malignen hämatologischen patienten mit lateral-flow-technologie

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonale Aspergillose (IPA) ist eine führende Ursache für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit hämatologischen Malignomen und hämatopoetischen Stammzelltransplantation Empfänger ein. Erkennung von IPA stellt eine beeindruckende diagnostische Herausforderung und, in Ermangelung eines &quot;Goldstandard&quot;, beruht auf einer Kombination von klinischen Daten und der Mikrobiologie und Histopathologie wo dies möglich ist. Die Diagnose der IPA sind an die Europäische Organisation für Forschung und Behandlung von Krebs und dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mykologie Study Group (EORTC / MSG) Konsens zur Definition der &quot;bewährten&quot;, &quot;wahrscheinlich&quot; und &quot;möglich&quot;, invasive Pilzkrankheiten 2 entsprechen . Derzeit sind keine Nucleinsäure-basierten Tests wurden auf äußere IPA Detektion und so Polymerase-Kettenreaktion (PCR) validiert ist nicht im aktuellen EORTC / MSG diagnostischen Kriterien enthalten. Identifizierung von Aspergillus in histologischen Schnitten ist wegen der problematischen Simimäßigkeiten in Hyphen Morphologien mit anderen invasiven Pilzerreger 3 und bewährte Identifikation erfordert die Isolierung der Erreger in Reinkultur. Kultur-basierte Ansätze beruhen auf der Verfügbarkeit von Biopsie-Proben, aber diese sind nicht immer zugänglich in kranken Patienten, und nicht immer nachgeben lebensfähig Vermehrungseinheiten für Kultur, wenn erhalten. Ein wichtiges Merkmal in der Pathogenese von Aspergillus ist Angio-Invasion, eine Eigenschaft, die Chancen, den Pilz zu verfolgen immunologisch mittels Tests, die charakteristische Signaturen antigenen Moleküle nachzuweisen im Serum und in der bronchoalveolären Lavage (BAL) Flüssigkeiten bietet. Dies hat zu der Entwicklung der Platelia Enzymimmunoassay (GM-EIA), die Aspergillus Galactomannan und eine &quot;pan-Pilz&quot;-Assay (Fungitell Test), die den konservierten Zellwand-Komponente erkennt (1 → 3)-β-D-detektiert geführt Glucan, aber nicht in den Mucorales, die diese Komponente in ihren Zellwänden 1,4 fehlt. Istverklagt rund um die Genauigkeit dieser Tests 1,4-6 hat auf die jüngste Entwicklung der nächsten Generation monoklonaler Antikörper (MAK)-basierte Assays, die Surrogatmarker der Infektion erkennen 1,5 geführt. Thornton 5 Kürzlich beschrieb die Erzeugung eines Aspergillus-spezifischen mAb (JF5) unter Verwendung von Hybridom-Technologie und deren Verwendung, um eine Immun-chromatographisches Lateral-Flow-Gerät (LFD) für den Point-of-Care (POC) Diagnose von IPA zu entwickeln. Ein großer Vorteil des LFD ist seine Fähigkeit, die Aktivität zu erkennen, da MAb JF5 bindet an eine extrazelluläre Glykoprotein-Antigen, das während der aktiven Wachstum des Pilzes nur 5 sezerniert wird. Dies ist eine wichtige Überlegung bei der Verwendung von Flüssigkeiten, wie zB Lungen-BAL zur Diagnose IPA seit Aspergillus-Sporen ein gemeinsamer Bestandteil der Atemluft sind. Der Nutzen der Vorrichtung bei der Diagnose von IPA wurde gezeigt, mit einem Tiermodell der Infektion, wobei die LFD verbesserte Empfindlichkeit und Spezifikation angezeigtificity dem Platelia GM und Fungitell (1 → 3)-β-D-Glucan-Assays 7 verglichen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren, um LFD Aspergillus-Antigen in humanem Serum und BAL-Flüssigkeiten zu erkennen. Seine Geschwindigkeit und Genauigkeit bietet eine neuartige Ergänzung Point-of-Care-Test zur Diagnose von IPA in malignen hämatologischen Patienten.

Eine schnelle und genaue Point-of-Care-Test für invasiver pulmonaler Aspergillose wird vorgestellt. Es nutzt die Vorteile der Lateral-Flow-Technologie unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörper, der an ein bindet<em&gt; Aspergillus</em&gt; Antigen bei Infektionen der Lunge ausgeschieden. Der Assay ist kompatibel mit Serum und brochoalveolar Lavage und stellt einen neuartigen Zusatz-Test zur Diagnose von Krankheitsbildern.

Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Die invasive pulmonale Aspergillose (IPA) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit hämatologischen Malignomen und nach einer hämatopoetischen Stammzell-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anwendung eines Lateral-Flow-Geräts zur schnellen Nachweisung des diagnostischen Antigens von Aspergillus in menschlichem Serum und BAL-Flüssigkeiten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Serum- oder BAL-Probe auf die Freigabebuchse des Lateral-Flow-Geräts aufgetragen wird. Der zweite Schritt besteht darin, der Lösung zu ermöglichen, entlang der Membran zu wandern. Der nächste Schritt besteht darin, die Gültigkeit des Tests durch Untersuchung der internen Kontrolllinie zu überprüfen. Der letzte Schritt ist die Interpretation des Testergebnisses durch Untersuchung der Testlinie. Letztendlich dient das Lateralfluss-Testsystem zum Nachweis des diagnostischen Antigens von Aspergillus in Serum- oder BAL-Flüssigkeiten.Der Aspergillus-LFD kann als ergänzender Test zur Diagnose einer invasiven pulmonalen Aspergillose verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie dem Aspergillus-Galacto-Mannan-Enzymimmunoassay, dem Panf- und Fundal-Beta-Glucan-Assay sowie dem Aspergillus-PCR-Test besteht darin, dass es sich um einen schnellen, am Versorgungsort durchführbaren Diagnosetests handelt, der minimale Laborausrüstung und geringe Schulungsanforderungen benötigt. Obwohl der LFD zur Detektion von Aspergillus-Arten entwickelt wurde, kann die Lateralfluss-Technologie auch zur Nachweisung anderer infektiöser Pathogene wie Cetosporium-, Fusarium- und Riser-Arten eingesetzt werden.Durch die Verwendung monoklonaler Antikörper, die spezifisch für diese Organismen sind, ist die visuelle Darstellung dieser Methode entscheidend. Da die Interpretation der LFD-Ergebnisse eine Vertrautheit mit dem Testformat erfordert, sollten Serum- und Bronchoalveoläre Lavage- (BAL-)Flüssigkeiten nach der Gewinnung aus unbehandelten Blutproben, bei denen das Blut bei vier Grad Celsius gerinnen darf, als Aliquots bei minus 20 Grad Celsius vor der Verwendung gelagert werden. Die Lagerung als Aliquots begrenzt das Potenzial für den Abbau des Zielantigens durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben während wiederholter Tests. Um Serum- und BAL-Proben für die Analyse vorzubereiten, tauen Sie die Proben bei Raumtemperatur auf und stellen Sie sie anschließend auf Eis. Mischen Sie gründlich durch Vortexen und zentrifugieren Sie dann eine Minute bei 14.000 U/min. Für den routinemäßigen Test menschlicher Proben verdünnen Sie das Serum im Verhältnis 1:1 mit Zellkulturmedium. Alternativ, um das Zielantigen von serumgebundenen Immunkomplexen abzulösen, verdünnen Sie das Serum 1:2 mit PBS, das 4 % EDTA enthält, erhitzen Sie drei Minuten im siedenden Wasserbad und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 14.000 U/min.Menschliche BAL-Flüssigkeiten erfordern keine Vorbehandlungen. Eine BAL-Probe wurde aufgetaut, vortexiert und zentrifugiert, was eine klare Probe ergibt, die direkt auf das Lateral-Flow-Gerät aufgetragen werden kann. Zum Testen werden die Lateral-Flow-Geräte (LFD) bei Raumtemperatur oder 23 °C gelagert, bei der sie 12 Monate stabil sind.Um den Test zu beginnen, nehmen Sie die Geräte aus ihren Beuteln und stellen Sie sie auf eine ebene Fläche. Geben Sie mithilfe einer sterilen Pipettenspitze innerhalb von Sekunden 100 Mikroliter vorbehandeltes Serum in die Freigabebuchse des Geräts. Die Flüssigkeit sollte durch Kapillarwirkung entlang der nitrocellulosehaltigen Membran im Beobachtungsfenster wandern.Auf dieselbe Weise 100 Mikroliter einer unverdünnten BAL-Probe auf die Freisetzungsöffnung des Geräts auftragen. Den Assay 15 Minuten bei Raumtemperatur laufen lassen, wobei zu diesem Zeitpunkt die Testergebnisse aufgezeichnet werden sollten. Der Test sollte nicht länger als 15 Minuten vor der Aufzeichnung der Ergebnisse belassen werden.Da dies die Ergebnisinterpretation verfälschen könnte, wird eine schwache Reaktion nicht durch eine Verlängerung der Inkubationszeit verstärkt. Der LFD besteht aus einer Kontrolllinie, die durch den Buchstaben C auf dem Kunststoffgehäuse gekennzeichnet ist, und einer Testlinie, die durch den Buchstaben T gekennzeichnet ist. Die Kontrolllinie sollte unabhängig vom Vorhandensein von Aspergillus-Antigen in der Serum- oder BAL-Probe immer erscheinen. Dies zeigt an, dass der Test ordnungsgemäß durchgelaufen ist, falls Aspergillus-Antigen in der Serum- oder BAL-Probe vorhanden ist.Die Testlinie erscheint ebenfalls innerhalb von 15 Minuten nach der Probenapplikation. Die Intensitäten der Test- und Lyme-Reaktionen stehen in proportionalem Verhältnis zu den Konzentrationen des Zielantigens in den Serum- und VAL-Proben. Der anspruchsvollste Aspekt dieses Verfahrens ist die Interpretation der Testergebnisse.Die LFD-Ergebnisse sollten nach 15 Minuten abgelesen und mit dem hier gezeigten repräsentativen Beispiel verglichen werden. In dieser Abbildung sind repräsentative Beispiele für schwache, positive, mäßig positive und stark positive LFD-Ergebnisse mit BAL- und Serumproben dargestellt. Jede positive Testlinie in der Serumprobe, unabhängig von ihrer Intensität, weist auf eine invasive Pary-Aspergillose oder IPA-Erkrankung hin, da zirkulierendes Aspergillus-Antigen im Blutkreislauf vorliegt. Positive BAL-Reaktionen, unabhängig von ihrer Intensität, weisen auf die Keimung von Sporen und die Entwicklung potenziell pathogener Hyphen in der Lunge hin.Bei Abwesenheit von Aspergillus-Antigen erscheint keine Testlinie, und das Ergebnis wird als negativ dokumentiert. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse von LFD-Tests unter Verwendung von BAL-Flüssigkeiten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder einer ML-Diagnose, die gemäß den diagnostischen Kriterien der European Organization for Research and Treatment of Cancer und der National Institute of Allergy and Infectious Diseases Study Group gestellt wurde. In diese Tabelle sind die entsprechenden klinischen und psychologischen Daten sowie die Ergebnisse eines ASPERIA-spezifischen PCR-Tests für jeden Patienten aufgenommen.Gemäß den E-O-R-T-C-M-S-G-Leitlinien von 2002 erhielten die Patienten 12, 13 und 16 die Diagnose einer möglichen invasiven pulmonalen Aspergillose (IPA) basierend auf Wirtsfaktoren sowie klinischen Kriterien oder GM-Positivität. Laut den überarbeiteten E-O-R-T-C-M-S-G-Leitlinien von 2008 würden alleinige Wirtsfaktoren mit GM-Positivität oder alleinige Wirtsfaktoren mit klinischen Kriterien nicht ausreichen, um eine mögliche invasive Pilzinfektion anzudeuten, sofern nicht jeweils unterstützende Hinweise aus klinischen Daten beziehungsweise der Mykologie vorliegen. Patient sechs erhielt sowohl nach den Leitlinien von 2002 als auch von 2008 die Diagnose einer wahrscheinlichen IPA aufgrund von Wirtsfaktoren, klinischen Haupt- und Nebenmerkmalen sowie GM-Positivität.Beachten Sie abschließend, dass weder der LFD-Assay noch der PCR-Assay derzeit in den E-O-R-T-C-M-S-G-Leitlinien für BAL-Proben von Patienten sechs und zwölf enthalten sind; dennoch besteht eine starke Übereinstimmung zwischen beiden Assays und dem kommerziellen Galactomannan-Test, die auf das Vorhandensein von Aspergillus-Antigen und -Nukleinsäure nach diesem Verfahren hinweist. Andere Methoden wie der Platellia-Galactomannan-Enzymimmunassay, panf, der Test auf pilzliches Beta-Glucan oder Aspergillus-PCR-Tests können parallel durchgeführt werden, um eine invasive Pilzerkrankung zu bestätigen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blutserum und BAL-Flüssigkeiten äußerst gefährlich sein kann, und dass die Gerätebediener stets gegen Krankheiten wie Hepatitis B und Tuberkulose geimpft sein sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Hier beschreiben wir ein Protokoll Anti - Pilz - Aktivität von primären humanen Immunzellen in Echtzeit zu bewerten unter Verwendung von fluoreszierendem Aspergillus Reportern Konidien in Verbindung mit Live-Zell - Videomikroskopie und Durchflusszytometrie. Erzeugten Daten geben einen Einblick in die Wirts zell- Aspergillus Wechselwirkungen wie fungizide Aktivität, Phagozytose, Zellmigration und Hemmung des Pilzwachstums.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur pulmonalen Pilz Belastung bei Mäusen mit invasiver Aspergillose durch Quantifizierung der Gomoris modifizierten Methanamine Silber Färbung in histologischen Abschnitte bestimmen. Verwendung dieser Methode führte zu vergleichbaren Ergebnissen mit weniger Tiere im Vergleich zu Bewertung der Pilzinfektionen Belastung durch quantitative PCR der Lunge Pilz DNA.

Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Wir beschreiben die Methode zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groß) in den Atemwegen von Mäusen. Die Methode kann auch für die Analyse von Mikropartikeln und Nanopartikelagglomeratverteilung in den Atemwegen in verschiedenen pathologischen Zustandsmodellen verwendet werden.

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Verschiedene bakterielle Krankheitserreger können Atemwegsinfektionen verursachen und zu ernsthaften Gesundheitsproblemen führen, wenn sie nicht genau erkannt und sofort behandelt werden. Der schnelle und genaue Nachweis dieser Erreger durch schleifenvermittelte isotherme Amplifikation ermöglicht ein effektives Management und eine effektive Kontrolle von Atemwegsinfektionen im klinischen Umfeld.

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Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Zwei-Photonen (2P)-Mikroskopie Ansatz zur Untersuchung Leukozyten homing in der Maus Fußballen. Wir besprechen die technischen Aspekte unserer Tissue Imaging Vorbereitung und gehen den Leser durch ein typisches Experiment von der ersten bis zur Ausführung und Datensammlung eingestellt.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

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In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

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Erfahren Sie den Nachweis invasiver pulmonaler Aspergillose bei hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie. Diese Methode ermöglicht die schnelle Detektion von Aspergillus-Antigenen in Serum und BAL-Flüssigkeiten.

Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

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