Name: Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA-fragmenten in moleculaire biologie. Deze methode maakt visualisatie en exacte bepaling van fragmentgroottes mogelijk met fluorescerende kleuring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Bereiding van de gel <ol><li> Weeg de juiste massa van agarose in een erlenmeyer. Agarose gels worden bereid met een w / v oplossing percentage. De concentratie van agarose in een gel zal afhangen van de grootte van de DNA fragmenten worden gescheiden, met de meeste gels tussen 0,5% -2%. Het volume van de buffer niet groter dan 1/3 van de capaciteit van de kolf. </li><li> Voeg loopbuffer de agarose-bevattende kolf. Swirl te mengen. De meest voorkomende gel uitgevoerd buffers TAE (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) en TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA). </li><li> Smelt de agarose / buffer mengsel. Dit wordt meestal uitgevoerd door verhitting in een magnetron, maar kan ook via een bunsenvlam. Op 30 s intervallen, verwijder dan de kolf en zwenk de inhoud goed te mengen. Herhaal dit totdat de agarose volledig is opgelost. </li><li> Voeg ethidiumbromide (EtBr) tot een concentratie van 0,5 pg / ml. Als alternatief kan de gel worden gekleurd na electrophoresis in lopende buffer die 0,5 ug / ml EtBr 15-30 min, gevolgd door ontkleuren in loopbuffer een gelijke lengte van de tijd. </li></ol> Let op: EtBr is een verdacht carcinogeen en moet op de juiste wijze te worden van de per instelling regelgeving. Handschoenen moeten altijd gedragen worden bij het werken met gels die EtBr. Alternatieve kleurstoffen voor de kleuring van het DNA zijn beschikbaar, maar EtBr blijft de meest populaire vanwege de gevoeligheid en kosten. <ol start="5"><li> Laat de agarose hetzij op het stationaire of door incubatie afkoelen in een 65 ° C waterbad. Doet u dit niet zal vervormen de gel lade. </li><li> Plaats de gel lade in de casting apparaat. Alternatief kan men ook kleef de open randen van een gel lade een mal maken. Een geschikte kam in de gel vorm aan de putjes maken. </li><li> Giet de gesmolten agarose in de gel mal. Laat de agarose op te zetten bij kamertemperatuur. Verwijder de kam en plaats de gel in de gel doos. Als alternatief kan de gel kunnen worden verpakt in plastic en bewaard bij 4 ° C tot gebruik (Fig. 1). </li></ol> 2. Het opzetten van Gel Apparatuur en scheiding van DNA-fragmenten <ol><li> Voeg laden kleurstof aan de DNA-monsters worden gescheiden (fig. 2). Gel laden kleurstof wordt meestal gemaakt op 6X concentratie (0,25% broomfenolblauw, 0,25% xyleen cyanol, 30% glycerol). Loading kleurstof helpt om bij te houden hoe ver je DNA monster is gereisd, en maakt het ook mogelijk het monster weg te zinken in de gel. </li><li> Programmeer de voeding aan op de gewenste spanning (1-5V/cm tussen de elektroden). </li><li> Voeg genoeg loopbuffer het oppervlak van de gel te dekken. Het is belangrijk om dezelfde buffer uitgevoerd als die welke gebruikt om de gel te bereiden. </li><li> Bevestig de draden van de gel doos om de voeding. Schakel de voeding en controleer of zowel de gel box en de voeding werken. </li><li> Verwijder het deksel. Langzaamzorgvuldig laden DNA monster (s) in de gel (Fig. 3). Een geschikte DNA-marker grootte moet altijd worden geladen, samen met experimentele monsters. </li><li> Plaats het deksel op de gel box. De kathode (zwarte draden) dient het nauwst zijn de putten dan de anode (rode draden). Controleer of de elektroden zijn aangesloten op de juiste sleuven in de voeding. </li><li> Schakel de stroom in. Laat de gel totdat de kleurstof is gemigreerd naar een geschikte afstand. </li></ol> 3. Het observeren van Gescheiden DNA-fragmenten <ol><li> Wanneer elektroforese is voltooid, schakelt u de voeding en verwijder het deksel van de gel doos. </li><li> Verwijder de gel uit de gel doos. Giet overtollige buffer van het oppervlak van de gel. Plaats de gel lade op keukenpapier om extra lopen buffer op te vangen. </li><li> Verwijder de gel uit de gel lade wordt blootgesteld gel met UV licht. Dit wordt meestal uitgevoerd met een gel documentatiesysteem (Fig. 4). DNA-banden moeten tonenals oranje fluorescerende groepen. Een foto van de gel (Fig. 5). </li><li> Gooi de gel en loopt buffer per instelling regelgeving. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Figuur 5 is een typisch resultaat na agarosegelelektroforese PCR-producten. Na scheiding, de verkregen DNA-fragmenten zichtbaar duidelijke band. De DNA standaard of ladder moeten worden gescheiden in een mate waardoor de nuttige bepaling van de grootte van het monster banden. In het getoonde voorbeeld, DNA fragmenten van 765 bp, 880 bp en 1022 bp gescheiden op een 1,5% agarose gel samen met een log2 DNA ladder. <img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Figuur 1. Gestolde agarosegel na verwijdering van de kam. <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Figuur 2. Een student toe te voegen laden kleurstof aan haar DNA-monsters. <img alt="Figuur 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Figuur 3. Een student het laden van het DNA-monster in een goed in de gel. <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Figuur 4. Een voorbeeld van een gel documentatiesysteem. <img alt="Figuur 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Figuur 5. Een beeld van een gel na elektroforese. EtBr werd toegevoegd aan de gel voor elektroforese tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml, gevolgd door afscheiding van 100 V gedurende 1 uur. De gel werd blootgesteld aan UV-licht en de foto genomen met een gel documentatiesysteem.

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%22">Molecular Cloning</a>. , 3rd, (2001).</li>
<li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+agarose+gel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis+of+large+DNA+molecules%3A+theory+and+applications%22%5BJournal%5D)">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li>
<li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endonuclease+R%E2%80%A2EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li>
<li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li>
<li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+electrophoresis+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li>
<li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li>
<li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDevor%2C+EJ+%22IDT+tutorial%3A+gel+electrophoresis%22">IDT tutorial: gel electrophoresis</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf">http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf</a> (2010).</li>
<li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gels%3A+properties+and+use+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li>
<li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion%3A+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose%2C+carrageenan+and+galactomannans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li>
<li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Agarosegelelektroforese blijkt een efficiënte en effectieve manier te scheiden nucleïnezuren zijn. Hoge gel Agarose de kracht maakt de behandeling van lage percentage gels voor het scheiden van grote DNA-fragmenten. Moleculaire zeef wordt bepaald door de grootte van de poriën gegenereerd door de bundels agarose 7 in de gelmatrix. In het algemeen hoger de concentratie van agarose, hoe kleiner de poriëngrootte. Traditionele agarose gels meest effectief bij de scheiding van DNA-fragmenten van 100 bp tot 25 kb. DNA-fragmenten groter dan 25 kb scheiden, wordt een puls moeten gebied gelelektroforese 6, waarin de toepassing van wisselstroom uit twee verschillende richtingen omvat gebruiken. Op deze wijze grotere afmetingen DNA fragmenten worden gescheiden door de snelheid waarmee ze zich oriënteren van de veranderingen in stroomrichting. DNA-fragmenten kleiner dan 100 bp beter gescheiden door Polyacrylamide gel elektroforese. Andersagarose gels, wordt de polyacrylamidegel matrix gevormd door een vrijeradicaalmechanisme aangedreven chemische reactie. Deze dunnere gels zijn van hogere concentratie, zijn verticaal lopen en hebben een betere resolutie. In moderne DNA sequentiebepaling capillaire elektroforese wordt gebruikt, waarbij capillairen worden gevuld met een gelmatrix. Het gebruik van capillaire buizen voorziet in de toepassing van hoge spanningen, waardoor de scheiding van DNA-fragmenten (en de bepaling van de DNA-sequentie) snel. Agarose kan worden aangepast aan laag smeltpunt agarose creëren door middel van hydroxyethylation. Laagsmeltende agarosegel wordt gewoonlijk gebruikt bij de isolatie van DNA-fragmenten gescheiden gewenst. Hydroxyethylation vermindert de dichtheid van de agarose bundels, effectieve vermindering van hun poriegrootte 8. Dit betekent dat een DNA fragment van dezelfde grootte langer duurt om door een laagsmeltende agarosegel in tegenstelling tot een standaard agarosegel. Omdat de bundels met elkaar koppelendoor niet-covalente interacties 9 is het mogelijk hersmelten een agarosegel na het uitharden. EtBr is de meest voorkomende reagens DNA vlek in agarose gels 10. Bij blootstelling aan UV-licht, elektronen in de aromatische ring van ethidium molecuul geactiveerd, waardoor het vrijkomen van energie (licht) als elektronen terugkeer naar grondtoestand. EtBr werkt door te intercaleren zich in de DNA-molecuul in een concentratie-afhankelijke wijze. Dit maakt een schatting van de hoeveelheid DNA in een bepaalde DNA-band op de intensiteit. Door de positieve lading, het gebruik van EtBr vermindert de DNA migratie met 15%. EtBr is een verdacht mutageen en carcinogeen, daarom moet men voorzichtig met agarose gels waarin het voorkomt. Bovendien wordt EtBr als een gevaarlijke en worden afgevoerd. Alternatieve vlekken voor DNA in agarose gels zijn onder andere SYBR Goud, SYBR groen, Crystal Violet en Methyl Blue. HiervanMethyl Blue en kristalviolet niet nodig blootstelling van de gel met UV licht visualisatie van DNA-banden, waardoor de kans mutatie indien herstel van het DNA-fragment uit de gel wordt gewenst. Maar hun gevoeligheid lager dan EtBr. SYBR goud en SYBR groen zijn beide zeer gevoelig, uv afhankelijk van kleurstoffen met een lagere toxiciteit dan EtBr, maar ze zijn aanzienlijk duurder. Bovendien alle alternatieve kleurstoffen hetzij niet of niet goed werken als direct toegevoegd aan de gel, waardoor de gel moeten na gekleurde na elektroforese. Vanwege de kosten, gebruiksgemak, en gevoeligheid, EtBr blijft de kleurstof van de keuze voor vele onderzoekers. Echter, in bepaalde situaties, zoals bij het gevaarlijk afval is moeilijk of wanneer de jonge studenten een experiment uitvoeren, kan een minder giftige kleurstof de voorkeur. Laden kleurstoffen in gelelektroforese dienen drie doeleinden. Eerst toe te voegen dichtheid om het monster, Waardoor het te zinken in de gel. Ten tweede, de kleur en kleurstoffen vereenvoudigen het laadproces. Ten slotte is de kleurstoffen verplaatsen standaardtarieven door de gel, waardoor de schatting van de afstand die DNA-fragmenten zijn gemigreerd. De exacte maten van gescheiden DNA fragmenten kunnen worden bepaald door het uitzetten van de log van het molecuulgewicht van de verschillende banden van een DNA standaard tegen de afstand van elke band. De DNA-standaard bevat een mengsel van DNA-fragmenten van vooraf bepaalde afmetingen kunnen worden vergeleken met de onbekende monsters DNA. Het is belangrijk op te merken dat verschillende vormen van DNA door de gel te bewegen met verschillende snelheden. Plasmide DNA, vanwege de compacte bouw, zich door de gel snelste, gevolgd door een lineaire DNA fragment van dezelfde grootte, met de open cirkelvorm reizen de laagste. Tenslotte, aangezien de toepassing van agarose gels in 1970 voor de scheiding van DNA, heeftbewezen als een van de meest bruikbare en veelzijdige technieken in de biologische wetenschappen onderzoek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Agarose I </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Boorzuur </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Broomfenolblauw </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidiumbromide </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Kankerverwekkende-moet worden afgevoerd als gevaarlijk afval </td></tr><tr><td> IJsazijn </td><td> Visser </td><td> BP2401-212 </td><td> Bijtend </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Visser </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylene cyanol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Onderzoeker / FX gel documentatiesysteem </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Uil Easycast B1 mini gel-elektroforese-systeem </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 voeding </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarosegelelektroforese voor de scheiding van dna fragmenten

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegelelektroforese de meest effectieve manier te scheiden DNA fragmenten van variërende grootte van 100 bp tot 25 kb 1. Agarose is geïsoleerd van het zeewier geslachten Gelidium en Gracilaria, en bestaat uit herhaalde agarobiose (L-en D-galactose) subeenheden 2. Tijdens gelering, agarose polymeren niet-covalent geassocieerd en een netwerk vormen bundels die poriegrootten bepalen van een gel moleculaire zeven eigenschappen. Het gebruik van agarose gel elektroforese revolutie de scheiding van DNA. Voorafgaand aan de vaststelling van agarose gels, werd DNA in de eerste plaats gescheiden met behulp van sucrose dichtheidsgradiënt centrifugeren, die alleen voorzien in een aanpassing van de grootte. DNA met agarose gel elektroforese scheiden, wordt het DNA geladen prefab putjes in de gel en een stroom toegepast. De fosfaat ruggengraat van het DNA (en RNA) molecuul negatief geladen derhalve, wanneer geplaatst in een elektrisch veld wordt DNA fragmenten migreren naar de positively geladen anode. Omdat DNA heeft een massa / ladingsverhouding worden DNA-moleculen gescheiden op grootte op een agarose gel in een zodanig patroon dat de afstand afgelegd omgekeerd evenredig met de log van het molecuulgewicht 3. De belangrijkste model DNA bewegen door een agarose gel wordt &quot;voorgespannen reptation&quot;, waarbij de voorrand voren beweegt en trekt de rest van het molecuul aan 4. De snelheid van migratie van een DNA molecule via een gel wordt bepaald door de volgende: 1) maat van DNA-molecuul; 2) agarose concentratie 3) DNA conformatie 5, 4) toegepaste voltage, 5) de aanwezigheid van ethidiumbromide, 6) type agarose en 7) elektroforese buffer. Na de scheiding kan het DNA moleculen zichtbaar onder UV-licht na kleuring met een geschikte kleurstof. Door het volgen van dit protocol, moet de student in staat zijn om: <ol><li> Begrijpen mechanisme waardoor DNA fragmenten worden gescheiden in een gelmatrix </li><li> Begrijpen hoe conformatie van deDNA-molecuul zal zijn bepalend voor de mobiliteit door middel van een gel matrix </li><li> Vaststellen van een agarose-oplossing van geschikte concentratie voor hun behoefte </li><li> Bereid een agarose gel elektroforese van DNA </li><li> Stel de gel elektroforese apparatuur en voeding </li><li> Kies een geschikte spanning voor de scheiding van DNA-fragmenten </li><li> Begrijp het mechanisme waarmee ethidiumbromide zorgt voor de visualisatie van DNA-banden </li><li> Bepaal de grootte van DNA fragmenten gescheiden </li></ol>

Een basisprotocol voor het scheiden van DNA-fragmenten met agarose gel elektroforese beschreven.

Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Agarosegelelektroforese is de meest effectieve methode om DNA-fragmenten van verschillende groottes, variërend van 100 bp tot 25 kb, te scheiden1. Agarose wordt geïsoleerd uit ...

Het algemene doel van deze procedure is het scheiden van DNA-fragmenten van verschillende groottes. Dit wordt bereikt door eerst een gel te bereiden met de juiste concentratie agarose en een fluorescerende kleurstof. De tweede stap is het gieten van de gel in een geschikte mal en deze vervolgens te laten stollen.De monsters worden in de gel geladen en er wordt een stroom op aangelegd. De laatste stap is het visualiseren van de gescheiden DNA-fragmenten onder ultraviolet licht. Samenvattend wordt AGROS-gelelektroforese gebruikt in alle situaties waarin de routinematige scheiding van DNA-fragmenten vereist is.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van destijds bestaande methoden, zoals sucrose-dichtheidsgradiëntcentrifugatie, is dat het visualisatie van DNA-banden mogelijk maakt en ons in staat stelt de exacte grootte van het DNA-fragment te bepalen wanneer dit gelijktijdig met een DNA-marker wordt gescheiden. Deze methode is essentieel in het levenswetenschappelijk onderzoek, zoals bij het klonen van genen en de zuivering en sequencing van DNA-moleculen. Hoewel deze methode over het algemeen wordt gebruikt om DNA-fragmenten tussen de 100 baseparen en 25 kilobasen te scheiden, kan deze ook worden aangepast om DNA-fragmenten tot een grootte van 10 megabasen te scheiden.Agros-gels worden bereid met een gewichtspercentage ten opzichte van het volume. De concentratie agrose in een gel is afhankelijk van de grootte van de te scheiden DNA-fragmenten. Weeg voor het begin van de procedure voor het maken van een gel de juiste massa agrose af in een erlenmeyer en voeg het juiste volume loopbuffer toe aan de kolf.Het volume van de buffer mag niet groter zijn dan een derde van de capaciteit van de fles. Draai de fles om te mengen en smelt het agarose-buffermengsel door deze op maximaal vermogen in een magnetron te verhitten. Verwijder de fles elke 30 seconden en draai de inhoud om te mengen. Herhaal dit proces totdat de agarose volledig is opgelost.Voeg vervolgens Atheriumbromide toe tot een concentratie van 0,5 µg/ml. Het is belangrijk om op te merken dat atheriumbromide carcinogeen is, dus er moeten altijd handschoenen worden gedragen bij het hanteren van gels die atheriumbromide bevatten; laat de agarose afkoelen door incubatie in een waterbad van 65 °C. Als dit niet gebeurt, zal de geltray vervormen terwijl de agarose afkoelt.Bereid de gelvorm voor door de geltray in het gietapparaat te plaatsen. Alternatief kunnen de open randen van een geltray met tape worden afgeplakt om een vorm te creëren. Plaats een passende kam in de gelvorm om de putjes te maken.Giet de mal en de aros in de gelmal. Laat de aros uitharden bij kamertemperatuur. Zodra de aros is uitgehard, verwijdert u de kam.Als de gel niet onmiddellijk wordt gebruikt, wikkel deze dan in vershoudfolie en bewaar deze bij vier graden Celsius tot gebruik. Als de gel onmiddellijk wordt gebruikt, plaats de gel dan in de gelbox. Om deze procedure te starten, voegt u gellaadkleurstof toe aan de DNA-monsters die gescheiden moeten worden.Laadkleurstof wordt doorgaans in een zesvoudige concentratie gemaakt. Stel de spanningsbron in op de gewenste spanning en voeg nu voldoende runbuffer toe aan de gelbak om het oppervlak van de gel te bedekken. Het is belangrijk om dezelfde runbuffer te gebruiken als degene die voor het bereiden van de gel is gebruikt. Sluit de aansluitingen van de gelbak aan op de spanningsbron en zet de spanningsbron aan. Controleer of zowel de gelbak als de spanningsbron correct functioneren.Het verschijnen van bellen bij de elektroden geeft aan dat er stroom loopt. Omdat onze handen van nature geneigd zijn om een beetje te trillen, kan het lastig zijn om een kleine pipetpunt in een klein putje te krijgen. Een manier om het trillen van de hand te voorkomen, is door deze te laten rusten op de andere arm of op de gelbak.Verwijder het deksel van de gelbak langzaam en voorzichtig. Laad de DNA-monsters in de gel. De laadkleurstof in het monster zorgt ervoor dat het monster in de gel zinkt en helpt bij het volgen van de afstand die het monster heeft afgelegd. Er moet altijd een DNA-lengtemarker worden geladen naast de experimentele monsters.Plaats het deksel terug. Controleer zorgvuldig of de elektroden in de juiste aansluitingen van de voeding zijn geplaatst. Schakel de stroom in en laat de gel lopen totdat de kleurstof over een passende afstand is gemigreerd.Wanneer de elektroforese is voltooid, schakelt u de stroomvoorziening uit en verwijdert u het deksel van de gelbak. Haal de gel uit de gelbak en giet overtollige buffer van het oppervlak van de gel af. Plaats de gelbak op papieren handdoeken om de resterende loopbuffer te absorberen.Om de DNA-fragmenten te visualiseren, haalt u de gel uit de gelbak en stelt u de gel bloot aan ultraviolet licht. Dit gebeurt meestal met een gelsystematiek- of documentatiesysteem. DNA-banden moeten zichtbaar worden als oranje fluorescerende banden.Maak aan het einde van het experiment een foto van de gel en voer de gel en de loopbuffer op de juiste wijze af volgens de institutionele voorschriften. Deze afbeelding representeert een typisch resultaat na agarosegelelektroforese van PCR-producten. Na scheiding zijn de resulterende DNA-fragmenten zichtbaar als duidelijk gedefinieerde banden.De DNA-standaard of ladder moet zodanig worden gescheiden dat de grootte van de monsterbanden nauwkeurig kan worden bepaald. In dit voorbeeld worden DNA-fragmenten van 765 base pairs, 880 base pairs en 1022 base pairs gescheiden op een 1,5%AROS-gel met een two log DNA-ladder. Het is belangrijk om tijdens de procedure de plaatsing van de elektroden dubbel te controleren voordat de stroom wordt ingeschakeld.Dit is om ervoor te zorgen dat de DNA-moleculen in de juiste richting bewegen. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het voorbereiden van een agarosegel, het scheiden van DNA-fragmenten van verschillende grootten en het verkrijgen van representatieve afbeeldingen van uw resultaten. Vergeet niet dat werken met ethidiumbromide uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas, altijd moeten worden getroffen bij het uitvoeren van deze procedure.

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video tonen we een methode voor de elektroforetische scheiding van eiwitten met behulp van poly-acrylimide gelelektroforese (PAGE).

Elektroforetische scheiding van eiwitten

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Traditionele platengelektroforese (SGE) experimenten vereisen een ingewikkeld apparaat en een hoog chemisch verbruik. Dit werk bevat een protocol dat een goedkope methode om DNA-fragmenten te scheiden binnen een kort tijdsbestek beschrijft.

Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van thiazole oranje voor de opsporing van DNA in gel elektroforese experimenten. Het gebruik van thiazole oranje kunt eliminatie van ethidiumbromide en fluorescentie detectie kan worden bereikt met UV of blauw licht.

De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen

Denaturerende gradiënt Gel Elektroforese (DGGE)

Deze video toont het protocol van een in vitro angiogenese test die recapituleert verschillende stadia van angiogenese. Time-lapse beelden van kiemen, lumen vorming, vertakking en anastomose - belangrijkste kenmerken van angiogenese - worden weergegeven.

Geoptimaliseerde fibrinegel Bead Assay voor de Studie van Angiogenese

We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.

Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device

SDD-AGE is een nuttige techniek voor de detectie en karakterisering van amyloid-achtige polymeren in de cellen. Hier laten we zien een aanpassing dat maakt deze techniek vatbaar is voor grootschalige toepassingen.

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Denaturerende ureum polyacrylamidegelelektroforese wordt gebruikt voor het enkelstrengs DNA gescheiden of tot RNA tot een limiet van 500 nucleotiden. Ureum in combinatie met de hitte gedenatureerd monsters en ongestructureerde enkele strengen migreren binnen de gel matrix op basis van hun moleculair gewicht.

Denatureren Ureum polyacrylamide gel elektroforese (Urea PAGE)

Leer agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA-fragmenten in moleculaire biologie. Deze methode maakt visualisatie en exacte bepaling van fragmentgroottes mogelijk met fluorescerende kleuring.

Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Meer video's verkennen