Name: Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Lernen Sie eine schnelle Aspirationstechnik zur Isolierung humaner embryonaler Stammzellkolonien aus MEF-Kokulturen. Diese Methode bewahrt Pluripotenz und ermöglicht effiziente Aufreinigung.

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Diese Arbeit wurde von einem New Faculty Award II vom California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1) und einer NIH-finanzierten National Research Award (F32-HL104924) finanziert

Ein. Vorbereitung der embryonalen Feeder <ol><li> Die MEFs in der Co-Kultur von HES verwendet werden zuvor durch Bestrahlung oder Mitomycin-C, um die Zellen vor Teilung durchläuft inhibieren behandelt werden. </li><li> Zwei Stunden vor MEF Aussaat, Mantel je 60 mm Plasma-Kulturschale mit 2 ml 0,05% Gelatine behandelt. </li><li> Auftauen ein Fläschchen behandelten MEFs und Platte bei ~ 20.000 Zellen / cm 2. </li><li> Lassen Sie die Zellen über Nacht zu halten. </li></ol> 2. Co-seeding hESCs auf MEFs <ol><li> Neue Kolonien können von kryokonservierten Kulturen oder Passagierung aktuellen Kulturen auf neue MEF-beschichteten Schalen initiiert werden, wie unten. </li><li> Waschen Sie die Platte mit den großen hESC Kolonien passagiert 1 Mal mit 3 ml erwärmte 1x PBS werden. </li><li> 3 ml Collagenase IV / PBS-Lösung (1 mg / ml) und Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C. (Hinweis: Die Zellen werden nicht deutlich werden oder Kugel als mit Trypsin gesehen). </li><li> Während die Zellen noch in derKollagenase, verwenden eine Kante einer 5 ml Pipettenspitze, eine Rastermuster auf den Kolonien, brechen sie in kleine Zellklumpen. </li><li> Verwenden das Ende der Pipettenspitze (statt in senkrechter Weise an der Kulturplatte), um den Boden der Kulturschale schaben, Verdrängen alle Zellen von der Oberfläche. </li><li> Sammeln der Zellen in ein Falcon-Röhrchen und drehen sich mit (1000 UpM) für 5 min. </li><li> Nach Zentrifugation, Absaugen des Mediums, so dass das Zellpellet im Falcon-Röhrchen. </li><li> Saugen Sie die MEF Medium aus dem MEFs plated am Tag zuvor. </li><li> Re-Platte die Zellen bei einem Verhältnis von 1:3 aus dem ursprünglichen Platte, und Futtermitteln mit 3 ml Medium hESC </li></ol> 3. Depleting MEFs aus der Co-Kultur Anmerkung: Human ESC Kulturen müssen mit hoher Dichte, in der Regel zwischen 10 und 14 Tagen der Kultur. <ol><li> Setzen Sie die Spitze eines Absaugen Pipette am Rand der Platte und damit der Sog ziehen Sie den Rand des MEF Blatt. </li><li> ReMove die Medien aus der Schüssel und lassen die Spitze der Zellschicht zu fangen und bewegen Sie langsam die Spitze in einer gebogenen Weise oberhalb der Platte. Anmerkung: Die Folie kann in der Spitze der Pipette verstopfen, aber dies ist nicht problematisch, da es nicht sollte dem Benutzer aus manuelles Ziehen des Blattes von der Oberfläche der Kulturschale. Wenn die Zellen bis zum Ende des Saugers stecken, können Sie den oberen Teil der Kulturschale zum Aufbrechen der Zellrasen für komplette Aspiration. </li><li> Ersetzen hESC Medium unmittelbar und legte die Platte wieder in den Inkubator. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Das Endergebnis des MEF Löschvorgang produziert kleine ungestörten hESC Kolonien (1D) in der Lage, signifikante Expansion in sehr großen Kolonien (Abbildung 2) zu unterziehen und gleichzeitig Ausdruck der Pluripotenz Entscheidungsträger SSEA-4, Oktober ¾ und Tra 1-81 (Abbildung 3). Abbildung 1. ESC Colony Morphologie vor und nach MEF Removal. Humanen embryonalen Stammzellen Kolonien bei A) Tag 1 und B) Tag 2 nach der Aussaat auf Kulturschalen. C) High Density Menschlichen embryonalen Stammzellen Kolonien (H7) von MEFs umgeben. Die beiden hESC Kolonien in roten Strichen skizziert. D) Nach MEF Entfernung mit dem Bestreben beschriebene Technik, sind wir mit einem isolierten hESC Kolonie mit sehr wenigen MEFs um die intakte Kolonie verlassen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" /> Abbildung 2. ESC Colony Expansion von 10 Tagen nach MEF Removal. Die ursprüngliche hESC Kolonie unmittelbar nach MEF Depletion (links) darf in einem sehr großen Kolonie (rechts) ent ausbauenximately 800 um, 10x. Beachten Sie, dass die ursprüngliche Kolonie in derselben Vergrößerung (10x) als zusammengesetztes Kolonie abgebildet wird. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" /> Abbildung 3. Immunfärbung von MEF-abgereicherte hESC Kolonien. Immunfluoreszenz Identifizierung der Kolonien bis zu 10 Tage nach der MEF Erschöpfung zeigt, dass Kolonien ihre Expression von Pluripotenz Marker als offensichtlich durch Oktober ¾, SSEA-4 und Tra-1-81-Färbung erhalten. Darüber hinaus sind diese hESC Kolonien zeigen keine Differenzierung in Richtung einer mesodermalen Schicksal, angedeutet durch die Abwesenheit von Flk-1. A, E, I und M) Transmissionslichts Bilder der immunoflouscently gefärbten Kolonien, 20, 10, 10 und 2x, . bzw. B, F, J und N) zeigen die Kerne -. DAPI gefärbten Zellen der immunofluorescently gefärbten Kolonien, 20, 10, 10 und 2x bzw. CD) zeigen die Expression vonMenschen Stammzellmarker SSEA-4 nur, und zusammengesetzte Bild, 20x. GH) zeigen die Expression des humanen Stammzellmarker Oktober ¾ nur, und zusammengesetzte Bild, 10x. KL) zeigen die Expression des humanen Stammzellmarker Tra 1-81 nur und Composite-Bild, 10x. MP) Die letzte Zeile, wenn Bilder zeigen eine Kolonie porträtiert die typischen glatten Grenzen bei dieser Vergrößerung, 2x, und dieser Kolonien gesehen nicht ausdrückliche O) Flk-1, ein früher Marker von Mesoderm Differenzierung, noch sie P) enthalten keine Fibroblasten als durch die Abwesenheit von DDR2-Färbung dargestellt. Supplemental Video. Entfernen Fibroblasten von Blatt Aspiration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> .

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Verfahren in diesem Manuskript vorgelegt bietet eine schnelle und kostengünstigere Alternative zu eliminieren Fibroblasten-Feeder-Zellen aus menschlichen embryonalen Zellkulturen. Die erfolgreiche Entfernung von Fibroblasten ist abhängig vom Vorhandensein eines dicht konfluente Monoschicht von diesen Zellen, die in mehr Stammzellkulturen entwickelt. Nach 7-10 Tagen werden die wachsenden hESC Kolonien den Feeder-Fibroblasten in einer Richtung nach außen zu drücken, erzeugen ein immer dichter werdendes Fibroblasten Mo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Fibroblast Marker </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268298 </td><td> Zellkern Marker </td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> Menschliche ESC Marker </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> Menschliche ESC Marker </td></tr><tr><td> Flk-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555307 </td><td> Frühe Differenzierung Marker </td></tr><tr><td> Tra-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> Menschliche ESC Marker </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Tabelle spezifischer reagents verwendet für die Immunfärbung die hESC.

schnelle fibroblast entfernung aus high density humanen embryonalen stammzellen kulturen

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) wurden verwendet, um menschliche embryonale Stammzellen (hES) Kulturen nach Blastozyste Trennung 1 zu etablieren. Dieser Anleger System hält hESCs vom unterziehen spontane Differenzierung während der Zellteilung Expansion. Allerdings ist diese Co-Kultur-Methode arbeitsintensiv, erfordert hoch qualifiziertes Personal, und die Renditen niedrig hESC Reinheit 4. Vielen Laboratorien haben versucht, die Anzahl von Feeder-Zellen in Kulturen hESC (dh Einbeziehung Matrix-beschichteten Schalen oder andere Zelltypen Feeder 5-8) zu minimieren. Diese modifizierten Kultur-Systeme haben einige Versprechen gezeigt, aber nicht die Standard-Methode zur Kultivierung hESCs mit Mitomycin C-behandelten Maus embyronic Fibroblasten um unerwünschte spontane Differenzierung der hESC Kulturen verzögern verdrängt. Daher sollten die Feeder-Zellen in hESC Expansion verwendet während der Differenzierung Experimenten entfernt werden. Obwohl mehrere Techniken zur Reinigung des hESC Zusammenarbeit zur Verfügunglonies (FACS, MACS, oder die Verwendung von resistenten Vektoren) von Feeder, sind diese Techniken arbeitsintensiv, teuer und / oder schädlich für die hESC. Das Ziel dieses Projektes war es, ein Verfahren zur Reinigung, die die Ernte von einer reineren Bevölkerung hESCs ermöglicht erfinden. Wir haben beobachtet, dass in einer konfluenten hESC Kultur, die MEF Population entfernt kann mit einer einfachen und schnellen Absaugen des MEF Blatt werden. Diese Entfernung ist abhängig von verschiedenen Faktoren, darunter seitliche Zell-zu-Zell-Bindung MEFs, die eine niedrigere Bindungsaffinität für das Styrol Kulturschale haben, und die Fähigkeit der Stammzellenkolonien die Fibroblasten nach außen während der Erzeugung der eigenen push &quot; Nische &quot;. Der HES wurden dann für SSEA-4, Oct3 / 4 und 1 bis 81 Tra Expression bis zu 10 Tage nach Entfernung MEF untersuchenden Aufrechterhaltung der Pluripotenz zu gewährleisten. Darüber hinaus waren hESC Kolonien in der Lage, weiter zu wachsen aus in größeren Formationen nach MEF Entfernung und bietet eine zusätzliche Ebene der hESC Expansion.

Trotz anhaltender Bemühungen, um den Übergang Kulturen Feeder-freien Bedingungen, bleiben die Ableitung und Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) weitgehend abhängig von Co-Kulturen mit embryonalen Feeder (MEF). Hier zeigen wir eine neuartige Methode zur schnellen Beseitigung Zubringer vom hESC Kulturen vor den Experimenten.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Mausembryonale Fibroblasten (MEFs) wurden verwendet, um nach der Blastozystenisolierung Kulturen aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) zu etablieren1. Dieses Feeder-System ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, menschliche Stammzellkolonien auf schnelle und effiziente Weise zu isolieren. Dies wird erreicht, indem menschliche embryonale Zellen auf einer dichten Schicht von murinen embryonalen Fibroblasten kultiviert werden. Mit der Zeit führt die Expansion der Stammzellpopulation zu einer Zunahme der Anzahl menschlicher Stammzellen, ermöglicht es diesen aber auch, in der MEF-Schicht kolonieartige Inseln zu bilden.Anschließend wird die Meth-Schicht durch Aspiration entfernt, wodurch die einzelnen Kolonien menschlicher embryonaler Stammzellen zurückbleiben. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung für Stammzellmarker zeigen, dass dies eine wirksame Isolationsmethode zur Beseitigung von Fütterungszellen und zur Aufrechterhaltung der Kolonieintegrität ist. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals während der Co-Kultivierung von Zellen in unserem Labor, als ich die Stammzellkulturen vor überkonfluenten Kultursystemen retten wollte.Das Hauptproblem, das die meisten Personen bei der Anwendung dieses Systems aufgrund mangelnder Erfahrung mit der Kultur menschlicher Stammzellen haben werden, betrifft die Handhabung. Wir hab

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.

Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Dieses Manuskript beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von papillären und Netzfibroblasten von der menschlichen Haut. Sie umgeht in der vitro-Kultur, die mit dem häufig verwendeten Isolationsprotokoll über Explantationskulturen unvermeidlich war. Die ausstrahlenden fibroblasten Untersätze sind funktional unterscheidbar und zeigen eine differenzierte Genexpression und Lokalisierung innerhalb der Dermis.

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Dieses Protokoll skizziert eine schnelle Methode, um gleichzeitig Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus der Haut von 0-4 Tage alten Mäusen zu erzeugen. Diese Primärkulturen können in vitro gepflegt und manipuliert werden, um eine Vielzahl physiologisch relevanter Prozesse zu untersuchen, einschließlich Hautzellbiologie, Pigmentierung, Wundheilung und Melanom.

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe für eine Parallelkultur von 48 Geweben in einer Multi-Well-Platte mit Doppelpolen vorgestellt, die für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Screening-Anwendungen geeignet ist. Das Protokoll ist kompatibel mit Fibroblasten aus verschiedenen Organen und Spezies und wird hier mit menschlichen primären kardialen Fibroblasten veranschaulicht.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Lernen Sie eine schnelle Aspirationstechnik zur Isolierung humaner embryonaler Stammzellkolonien aus MEF-Kokulturen. Diese Methode bewahrt Pluripotenz und ermöglicht effiziente Aufreinigung.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

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