Name: Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz In-situ- Hybridisierung (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung viraler RNA in infizierten Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Lokalisierung und Untersuchung des intrazellulären Virus-Traffickings.

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Die Autoren danken der ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern des Labors für Beiträge zur Entwicklung der Methodik hier skizzierten und Alan Cochrane um Rat fragen. LA ist ein Empfänger einer kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Doctoral Fellowship und AJM wird von einem Fraser, Monat und MacPherson Career Award unterstützt. Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss aus dem CIHR (Grant # MOP-56974) unterstützt.

1. Sondenvorbereitung <ol><li> Digest 1 ug die in vitro Transkription Vektor, ausgeführt pKS (+) Pol 236nt 9 mit Kpn1 Enzym bei 37 ° C für 1 Stunde und des linearisierten DNA-Produkt auf einem Agarosegel. Das Fragment sollte etwa 2500 bp sein. </li><li> Schneiden Sie das Fragment aus dem Gel gereinigt und unter Verwendung des Roche Micro Elute Gel Extraction Kit (alle verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt). Führen Sie die endgültige Elution in 30 ul Elutionspuffer. Versuch 5 ul des Produkts auf einem Agarosegel, um die Reinigung zu überprüfen. </li><li> Mischen Sie ein in vitro-Transkriptions-Reaktion (siehe Rezept unten) unter Verwendung des Roche DIG RNA Labeling Kit und bei 37 ° C für 2 Stunden. </li></ol> In-vitro-Transkriptions-Reaktion: <table border="1"><tbody><tr><td> Linearisierte DNA </td><td> 23 ul </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA Labeling Mix (Roche) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 1X Transcription Puffer </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> 20U RNase OUT </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 80U T7-RNA-Polymerase </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 40 ul </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> In 228 U DNase I und bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von EDTA pH 8,0 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM. </li><li> Reinigung der Reaktionsprodukte mit Hilfe der Quick Spin Columns von Roche als vom Hersteller angegeben. </li><li> Reinigen der Sonde durch Fällung mit 1/10 Volumen DEPC-behandeltem 3M NaOAc pH 5,2 und 2,5 Volumina eiskaltem 95% igem Ethanol. Mischen und inkubieren bei -80 ° C für 30 min bis über Nacht. </li><li> Zentrifuge die Sonde für 15 min bei 4 ° C bei 15.000 × g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und wasche das Pellet in eiskaltem 70% Ethanol. Zentrifuge erneut für 5 min bei 4 ° C bei 15.000 × g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet trocknen. Das Pellet in 50 ul wasser (DNase / RNase frei) mit 10 U RNase OUT Invitrogen. </li><li> Schätzen Sie die Konzentration der Sonde durch Spektrophotometrie (Maßnahme RNA bei 260 nm), und mit Wasser auf eine Konzentration von 5 ng / ul. Shop in Aliquots bei -20 ° C für den kurzfristigen Einsatz, oder -80 ° C für eine langfristige Lagerung. Es wird empfohlen, inter-Assay-Vergleiche durchführen, so erhalten einen aliquoten dafür. </li></ol> 2. Zellfixierung <ol><li> Es ist zunächst wichtig, Samen anhaftenden Zellen auf unbehandelten, sterile Deckgläschen so dass die endgültige Konfluenz bei der Ernte beträgt ca. 70-80%. Für nicht-adhärenten Zellen, als normal wachsen und bei Empfang genommen werden, inkubieren mit Deckgläschen, die mit 0,01% w / v Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich, Inc.) wurden für 1 Stunde behandelt. Für einen typischen 12-Well-Polystyrol-Gewebekulturplatte (3,8 cm 2), 150.000 Zellen (zB HeLa) nach 24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert. Nicht-adhärente Zellen kann infiziert oder transfiziert werden wie üblich und man ließ sie adSie hier, um Glasdeckgläschen vor der Fixierung 3. </li><li> Entsorgen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen mit 1X Phosphat-gepufferte Salzlösung in doppelt destilliertem Wasser (DPBS) für 1 Minute vorbereitet. Diethylpyrocarbonat (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.) behandelt 1X PBS können ebenfalls verwendet werden, kann jedoch nicht als unbehandelte PBS darin enthaltener RNase Enzymen. </li><li> Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie 4% Paraformaldehyd, genug, um die Zellen vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie für 15-20 min. </li><li> Entsorgen Sie die paraformaldeyhyde und waschen Sie die Zellen mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie die DPBS und fügen 0,1 M Glycin (gelöst in 1X DPBS). Inkubieren für 10 min. </li><li> Entsorgen Sie das Glycin und waschen Sie die Zellen mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie die DPBS und fügen 0,2% Triton-X (gelöst in 1X DPBS). Inkubieren Sie für 5-10 min. Wenn Färbung für nukleolären oder Kernhüllenproteine, mit Triton X-100 nicht länger als 5 min oder die Protein-Lokalisierung wird diffus permeabilisieren. </li><li> Entsorgen Triton X-100 und wasche einmal in1X DPBS für 1 min. </li><li> Für die langfristige Lagerung, ersetzen PBS mit 70% Ethanol und lagern bei 4 ° C für bis zu vier Monate. Alternativ dazu noch einmal abwaschen mit 1X DPBS und fahren um zu fischen. </li></ol> 3. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) <ol><li> Wenn die Deckgläser in Ethanol gelagert wurden, ersetzen Ethanol mit 1X DPBS und die Zellen für 30 Minuten zu rehydrieren. Rehydrierung kann über Nacht geschehen, wenn die Deckgläser bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Bereiten Sie Folien, die auf Deckgläsern inkubieren, wobei darauf zu reinigen und zu beschriften Sie sie gut. </li><li> Für eine 18mm Deckglas, fügen Sie 50 ul DNase-Lösung (25 Einheiten / Deckglas, im Handel erhältlich) auf den Objektträger. Fügen Sie das Deckglas und achten Sie darauf, um es zu Zell-Seite Platz nach unten, und inkubieren Sie sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Dann werden 50 ul Hybridisierungs-Mix (siehe Rezept unten) pro Deckglas aufeine Rutsche und bebrüten das Deckglas Zelle nach unten für 16-18 h bei 42 ° C Die Inkubation sollte in einem Behälter mit 50% Formamid, 2 × SSPE Mischung (12,5 ml deionisiertes Formamid, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml Wasser) durchgeführt werden. </li></ol> Hybridisierung Mix (für ein Deckglas, 50 ul): <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Aktien </td><td> Material (bei ​​Endkonzentration) </td></tr><tr><td> 25 ul </td><td> Formamid, 50% (entionisiertem, jede Quelle) </td></tr><tr><td> 5 ul (von 10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc.) </td></tr><tr><td> 5 ul (der 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 ul (50 ×) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 ul (von 5 Einheiten) </td><td> RNase OUT </td></tr><tr><td> 5 ul (25 ng von 5 ng / ul) </td><td> Sonde </td></tr><tr><td> 5 ul </td><td> H 2 O DEPC, um die endgültige machenVolumen 50 pl </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Inkubieren Deckgläser Zelle nach unten in 50 l 50% Formamid (verdünnt in 1 × DPBS) für 15 min bei 42 ° C </li><li> Waschen der Deckgläser zweimal in 2 × SSPE durch Inkubation Zelle nach unten in 50 ul 2X SSPE (20 × SSPE in 1X DPBS verdünnt) für jeweils 5 min bei 42 ° C </li><li> Waschen Sie die Deckgläser in 1X DPBS für 1 min. </li></ol> 4. Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Blockieren Sie die Deckgläser Zelle, indem sie sie nach unten in 50 l 1X Roche Blocking-Lösung (10X Roche Blockierungslösung in 1X DPBS verdünnt) für 30 min. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser Zelle nach unten in 50 ul primären Antikörper-Lösung 1 h bei 37 ° C Anti-DIG-Antikörper sollte gemäß den Herstellerangaben Richtung in 1 × Blockierungslösung verdünnt werden. Wenn andere Antikörper verwendet wird, um Proteine ​​zu färben, kann sie an der richtigen Konzentration bereitgestellt hinzugefügt werden, dass alle verwendeten Antikörper aus verschiedenen Host-Spezifikation abgeleiteties. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen für 10 min in 1X DPBS. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser Zelle nach unten in 50 l sekundären Antikörper-Lösung 1 h bei 37 ° C Alexa Fluor-konjugierte Antikörper (Invitrogen) verwendet werden, um einen Bereich von Farben zu erzeugen und an 1:500 in Blocking-Lösung 1X, 1X DPBS verwendet. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser zweimal für jeweils 10 Minuten in 1X DPBS. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser Zelle nach oben auf Whatman-Papier. Beachten Sie unbedingt die Deckgläschen abdecken, um Belichtung und Bleichen zu vermeiden. </li><li> Sobald alle Flüssigkeit verdampft ist, montieren Sie die Deckgläser auf frische Dias mit 8 ul ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.). Klopfen Sie sich das Deckglas, um mögliche Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Bewerben Nagellack zu den Kanten des Deckglases, um es zu fixieren. </li><li> Die Visualisierung von RNA und Proteinen durch Mikroskopie-Techniken ist auch entscheidend für den Erfolg dieser Technik. Einstellungen am Mikroskop eingesetzt werden können fördern oder behindern Visualisierung so ist, dass der SchlüsselEinstellungen am Mikroskop richtig eingestellt sein und konsequent sein von einer Probe zur anderen in einem gegebenen Experiment. Für detaillierte Mikroskopie Einstellungen finden Optik-und Antikörper-Kombinationen siehe Referenzen 1,10. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel der Virus-RNA-Färbung kann in 2 gesehen werden. Die virale RNA von HIV-1 wird im Cytoplasma diffus zum größten Teil angezeigt gesehen, obwohl kleines Cytoplasma Tränenpünktchen nicht ungewöhnlich sind. Die Spezifität kann durch den Vergleich positiver Zellen in die umliegenden Zellen, die keine Fluoreszenz Display abgelesen werden. Wie in der Einleitung erwähnt, erzeugt HIV-1, die die regulatorischen Rev-Protein fehlt RNA, die im Kern gehalten wird: das man sich als helles Signal im Kern kann, und einen Mangel an RNA Fluoreszenzsignal im Zytoplasma. Die Überexpression von zellulären Proteinen ist auch, das fähig ist die Verteilung der HIV-1 Virus-RNA. In Abbildung 2 </strong&gt;, die Überexpression von Proteinen in endosomalen Vesikel Menschenhandel verwickelt sind (z. B. Rab7-Interaktion lysosomalen Proteins (RILP) 11 oder N-terminal deletierten RILP (RILPN) 11, und Proteine, die mit Dynein motorischen Funktion beeinträchtigen [zB p50/dynamitin 1, 12], mit dem normalen steady-state Lokalisation der viralen genomischen RNA, wie durch FISH-Analysen bestimmt stören RILP Ausdruck führt wieder Lokalisation der viralen genomischen RNA an die Mikrotubuli-Organisation Zentrum (MTOC) 13;. RILPN verteilt späten Endosomen innerhalb der Zytoplasma aufgrund der Unfähigkeit, sich an p150 der Dynein motorischer Komplex p50/dynamitin Blöcken 14 und die große Untereinheit der Dynein Motor und Meldungen geklebtem binden späten Endosomen, sondern auch die virale genomische RNA und HIV-1 Proteinen zu der Zellperipherie 1 (Abbildung 2). Die Manipulation der Steady-State-Lokalisation der viralen genomischen RNA, einen wichtigen Beitrag zu der InfektiositätViruspartikel, wäre der Schlüssel zur späteren Entwicklung von Therapeutika. In unseren Händen, erscheint viraler RNA in der Zelle schon nach 3 Stunden nach der Transfektion und Infektion 10 und wird leicht beobachtbaren dieses FISH-Technik von 12 Stunden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufplan des Protokolls über Fisch / IF Co-Analysen. Die Zellen werden auf Deckgläsern gezüchtet und dann mit Paraformaldehyd fixiert. Behandlungen von Glycin und Triton-X durchgeführt werden, bevor die Zellen entweder für FISH / IF verwendet oder gelagert in 70% Ethanol für die Lagerung. Die Zellen dehydriert für die Lagerung sind in 1X DPBS (DEPC-behandeltem PBS) bevor es weiter nach FISH / IF rehydriert. Die Zellen werden mit DNase I behandelt und über Nacht stehen gelassen, um mit der Sonde hybridisieren. Sobald Hybridisierung abgeschlossen ist, werden die Zellen gewaschen, mit Formamid, sowie mit SSPE, und eine letzte 1X DPBS spülen. Blockierungslösung wird auf die Zellen aufgebracht, gefolgt von Inkubation mitdie primären Antikörper. Nach dem Waschen werden Sekundärantikörper aufgetragen. Zwei abschließende Waschungen in 1X DPBS runden das Färbeverfahren, wo auf die Deckgläser getrocknet und auf Objektträger für die Bildgebung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von FISH / IF Co-Analysen. A) HIV-1 wird in HeLa-Zellen und in einigen Fällen mit Konstrukten, die die Überexpression von zellulären Proteinen (RILP, p50/Dynamitin und RILPΔN (eine Amino-Deletionsmutante) zu transfiziert) . FISCH / IF Co-Analysen durchgeführt: RNA ist in grün entweder mit oder G3BP LAMP1 (rot) identifiziert zu unterscheiden. B) HIV-1 wird in HeLa exprimiert und gesammelt zu verschiedenen Zeitpunkten. Viral RNA-Expression wird in grün verfolgt, während die zellulären Proteins, hnRNP A1, in rot gefärbt wird. Größe Bars sind 10 um. Bilder von Referenzen 1 (select Zahlen aus Feld A; RILP, p50/Dynamitin und RILP DeltaN) geändertund 17 (Feld B).

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

FISCH / IF Co-Analysen ist eine zuverlässige Methode zur Erkennung viraler RNA in Zellen, die inzwischen verfeinert 9,15,16 visualisieren. Im Laufe von mehreren Jahren haben wir eine raffinierte Methode der Färbung für RNA entwickelt. Diese Technik kann auf einer Vielzahl von Zelltypen sofern die Sonde spezifisch an die Ziel-RNA 17 verwendet werden. Durch die Markierung der Sonde mit DIG, sind wir imstande, die Visualisierung der RNA durch eine einfache Färbung. Wenn für die RNA-Färbung und anderen Proteinen kombiniert werden, FISH / IF Co-Analysen zu einem mächtigen Werkzeug, um zelluläre Strukturen und Protein / RNA-Lokalisierung zu beobachten. Die Spezifität der RNA-Detektion ist ziemlich hoch. Dies ist in 2 dargestellt. In einigen der ursprünglichen Arbeiten, die auf viralen genomischen RNA-Lokalisierung, FISH festgestellt, dass ein Mangel an Rev virale RNA im Zellkern 18 gefangen konzentriert. Da dies hat reichlich neue Informationen über die viralen genomischen RNA Lokalisation wurde unter Verwendung des technique hier skizzierte. Durch Überexpression von zellulären Proteinen, können bestimmte Populationen und nicht alle-der viralen RNA gezwungen, zu den verschiedenen Regionen der Zelle lokalisiert werden. RILP Überexpression, welche den Phänotyp erinnert erhalten wird, wenn hnRNP A2 wird durch siRNA in erschöpften HIV-1-exprimierenden Zellen 13, bewirkt, dass die RNA sichtbar zu der MTOC ansammeln. P50/Dynamitin Überexpression oder Knockdown der Dynein schwere Kette 1 führt zur Freisetzung von viralen genomischen RNA aus intrazellulären Domänen der zellulären Peripherie (: Die viralen genomischen RNA kann an der Zellperipherie, indem Sie die Minus-Ende Motorprotein, Dynein geschoben werden Abbildung 2). Eine Mutante von RILP, RILPΔN, die nicht mehr bindet das Dynein-Motor, zerstreut Endosomen (markiert durch LAMP1) in das Zytoplasma, weil sie nicht mehr aktiv an juxtanuclear Domänen lokalisiert sind. Diese Ergebnisse weisen auf die Vorstellung von einem Kunststoff-Population von HIV-1-Genom-RNA und insbesondere, dass verschiedene Pools von HIV-1-Genom-RNA mit teilweise identifizierbaren Rollen in der viralen Replikationszyklus abgegeben. Diese dieselben Begriffe bereits für das Protein von dieser mRNA kodiert Gag 19 identifiziert. Es gibt Einschränkungen für die Verwendungen der FISH / IF Co-Analysen, die auf Antikörper nach Wahl und Verfügbarkeit verbunden sind. Die Optimierung der besten Kombination aus primären und sekundären Antikörper und deren Konzentrationen, wird einige Zeit dauern, um zu optimieren (siehe Tabelle 1 und 2). Antikörper aus Hybridomen gemacht oder von großen Unternehmen hergestellt werden müssen, die überall Konzentrationen variieren von 1:2 bis 1:2000, aber sicher sein, um die Leitlinien der vom Hersteller für beste Ergebnisse befolgen. Die Wirt, in dem der Antikörper produziert muss auch unter Betracht gezogen werden. Mixing Schafe mit Ziegen-Antikörper sollte auch im primären und sekundären Antikörpern, da diese Kombination führt zu hohen Hintergrund durch cross-species Anerkennung (Daten nicht gezeigt) vermieden werden. Für Alexa-Fluor secondary Antikörper, kann die Konzentration an 1:500 für fast jede Antikörper in der Menge verwendet werden. Der andere Nachteil bei FISH / IF Co-Analysen in diesem Bericht beschrieben wird, ist es erfasst die RNA an seinem Standort im Steady-State, nachdem Zellen behoben wurden und permeabilisierten mit Paraformaldehyd und Reinigungsmittel (Abbildung 1). Jedoch hat sich die RNA Bildgebung in lebenden Zellen durch eine Vielzahl von Mitteln erreicht 20-22, meist unter Verwendung von Variationen der viralen RNA-Genome, die durch fluoreszierende Proteine, wie zB GFP versehen sind. Jedoch weiterhin zusätzliche Mittel an die RNA-Lokalisierung in lebenden Zellen zu identifizieren an die Oberfläche. Diese neuen Verfahren beinhalten die Tagging-RNA mittels Spinat 23, SNAP 24 oder MTrip 2. Diese Techniken leiden unter einigen Nachteilen einschließlich der Anforderung, Zellen vor Zugabe von Substraten oder dass eine Einheit konstruiert ist, um die mRNA zu markieren, zu detektieren die mRNA durch Mikroskopie bestimmt werden permeabilisieren. Tatsächlich ist die große ADVAntage von FISH-Analysen in diesem Bericht beschriebenen liegt in der Tatsache, dass die native RNA unverändert ist, die zu den meisten physiologisch relevante Ergebnisse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 18mm Deckgläsern </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Bis 4% machen: Lösen Sie 20 g in 500 mL 1XDPBS bei 60 ° C mit 5 Tropfen Natronlauge. pH-Wert auf 7,2 vor der Hitze und Lagerung bei -20 ° C. Nicht mehr als 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Elute Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Labelling Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transkription T7-RNA-Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Quick Spin Columns </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescent Antibody Enhancer Set für DIG-Erkennung # 4 (Blockierungslösung) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor Sekundärantikörper </td><td> Invitrogen </td><td> Siehe Tabelle 2 </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisierungsofen </td><td> Sci Boekelschaftliche </td><td> Modell 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroobjekttragerglaschen </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Identifizierung von spezifischen Reagenzien und Ausrüstung <table border="1"><tbody><tr><td> Arten von Anti-DIG-Antikörper (Verdünnung; Unternehmen, Katalog-Nummer) </td><td> Farben </td><td> Alexa Fluor gebrauchten (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Maus (1:500; Sigma, B7405) </td><td> grün </td><td> Alexa Fluor 488 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rot </td><td> Alexa Fluor 594 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blau </td><td> Alexa Fluor 647 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sheep (1:200; Roche, 11376623) </td><td> grün </td><td> Alexa Fluor 488 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rot </td><td> Alexa Fluor 594 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blau </td><td> Alexa Fluor 647 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Kombinationen von sekundären Antikörpern und Anti-DIG mit Katalognummern und aufgeführten Konzentrationen.

nachweis viraler rna durch fluoreszenz<em&gt; in-situ-</em&gt; hybridisierung (fish)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viren infizieren die Zellen auszulösen spezifische Änderungen an normalen Zellfunktionen, die Energie und Ressourcen für die virale Replikation ablenken zu dienen. Viele Aspekte der Wirtszelle Funktion von Viren requiriert, üblicherweise durch die Expression von viralen Genprodukten, rekrutieren Wirtszellproteinen und Maschinen. Darüber hinaus, Viren Ingenieur-spezifischen Membran-Organellen oder Schild auf die mobile Vesikel und Motorproteine ​​Regionen der Zelle (während der de novo-Infektion, Viren kooptieren molekularen Motor Proteine ​​in den Kern Ziel gewirkt, später während der Virus Anordnung, werden sie kapern zellulären Maschinen, die in der Montage von Viren helfen wird). Weniger ist, wie Viren, insbesondere solche mit RNA-Genome, koordinieren den intrazellulären Transport von sowohl Protein und RNA-Komponenten und deren Anordnung zu erreichen infektiöser Partikel an bestimmten Orten in der Zelle zu verstehen. Die Untersuchung der RNA Lokalisation begann in früheren Arbeiten. Entwicklung von niederen eukaryotischen emEmbryonen und neuronale Zellen lieferten wichtige biologische Informationen, und auch die Bedeutung von RNA-Lokalisation in der Programmierung der Genexpression Kaskaden. Die Studie in anderen Organismen und Zellsysteme hat ähnlich wichtige Informationen lieferte. Viren sind obligate Parasiten und müssen ihre Wirtszellen zu nutzen, um zu replizieren. Somit ist es wichtig zu verstehen, wie RNA-Viren die RNA-Genome aus dem Kern zu leiten, durch die nukleäre Pore, durch das Cytoplasma und einem seiner endgültigen Bestimmungsort in reifen Viruspartikel 1. FISH dient als nützliches Instrument, um Veränderungen in der Steady-State-Lokalisierung von viraler RNA zu identifizieren. Wenn sie mit Immunfluoreszenz (IF) Analyse 22, FISH / IF Co-Analysen werden Informationen über die Co-Lokalisation von Proteinen liefern mit der viralen RNA-3 kombiniert. Diese Analyse ist somit ein guter Ausgangspunkt, um für die RNA-Protein-Wechselwirkungen mit anderen biochemischen oder biophysikalischen testenTests 4,5, da die Co-Lokalisierung allein ist nicht genug Beweise sicher zu sein, von einer Wechselwirkung. Bei der Untersuchung viraler RNA-Lokalisierung mit einem Verfahren wie diesem, hat eine Fülle von Informationen auf beiden viralen und zellulären RNA Menschenhandel Veranstaltungen 6 gewonnen. Zum Beispiel produziert HIV-1 RNA in den Zellkern der infizierten Zellen, aber die RNA nur in dem Cytoplasma übersetzt. Wenn eine Taste virales Protein fehlt (Rev) 7 hat FISH der viralen RNA zeigte, dass der Block die virale Replikation durch die Beibehaltung der genomischen HIV-1 RNA im Kern 8 ist. Hier stellen wir die Methode für die visuelle Analyse der viralen genomischen RNA in situ. Das Verfahren ermöglicht die Verwendung eines markierten RNA-Sonde. Diese Sonde ist so konzipiert, dass komplementär zu den viralen genomischen RNA. Während der in vitro-Synthese von Antisense-RNA-Sonde, die das Ribonukleotid mit Digoxigenin (DIG) modifiziert wird in einem in vitro transcr enthalteniption Reaktion. Sobald die Sonde an die Ziel-mRNA in Zellen hybridisiert hat, werden nachfolgende Schritte Antikörpermarkierung (1) zeigen die Lokalisation der mRNA als auch Proteine ​​von Interesse bei der Durchführung FISH / IF.

Ein Fluoreszenz-<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)-Methode wurde entwickelt, um visuell Nachweis der viralen genomischen RNA mittels Fluoreszenzmikroskopie. Eine Sonde mit Spezifität zu der viralen RNA, die dann identifiziert unter Verwendung einer Kombination der Hybridisierung und Immunfluoreszenz-Techniken gemacht werden können. Diese Technik bietet den Vorteil der Identifizierung der Lokalisation der viralen RNA oder DNA im Steady-State, Bereitstellung von Informationen über die Kontrolle der intrazellulären Virus Menschenhandel Veranstaltungen.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viren, die Zellen infizieren, rufen spezifische Veränderungen der normalen Zellfunktionen hervor, die dazu dienen, Energie und Ressourcen für die virale Replikation umzuleiten. Viele ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Lokalisation von viraler RNA in C zwei innerhalb von Zellen sichtbar zu machen. Um dies zu erreichen, züchten Sie zunächst die Zellen, die transfiziert oder infiziert werden sollen, auf Glasdeckeln. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen nach erfolgreicher Transfektion oder Infektion mit 4 % Paraformaldehyd zu fixieren. Als Nächstes inkubieren Sie die Zellen mit einer Hybridisierungslösung, die die RNA markiert. Dazu wird die Deckglasseite mit den Zellen nach unten auf die Hybridisierungslösung auf einem Objektträger gelegt. Der letzte Schritt dieses Verfahrens besteht darin, Antikörper zur Färbung der Zellen für die RNA-Markierung zu verwenden.Letztlich wird die Lokalisation der markierten RNA innerhalb der Zelle mittels Fluoreszenz in der C-Zwei-Hybridisierung oder FISH sichtbar gemacht. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen Methoden wie der RNA-Bildgebung in lebenden Zellen unter Verwendung von Markern besteht darin, dass native RNA nachgewiesen werden kann, im Gegensatz zu modifizierter RNA. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie sorgfältige Behandlung der Deckgläser, Standardisierung des Verfahrens sowie präzise Timing erfordert.Während der Inkubationen hängt das genaue Verfahren zur Kultivierung von Zellen für die Fixierung von der Art der Zellen ab. Für anheftungsabhängige Zellen ist es zunächst wichtig, sie auf unbeschichteten sterilen Glas-Deckgläsern auszusäen, sodass die endgültige Konfluenz beim Ernten etwa 70 bis 80 % beträgt. Anheftungsunabhängige Zellen sollten bis zur Sammlung auf die übliche Weise kultiviert werden.Anschießend inkubieren Sie sie mit Deckgläsern, die mit Poly-L-Lysin beschichtet wurden, für eine typische 12-Loch-Polystyrol-Zellkulturschale mit 150.000 Zellen pro Loch 24 Stunden vor der Infektion oder Transfektion. Inkubieren Sie die Zellen auf den Deckgläsern eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um mit der Fixierung der Zellen zu beginnen. Entsorgen Sie das Medium durch vorsichtige Aspiration und geben Sie vorsichtig eine mit PBS hergestellte und doppelt destillierte Wasser hinzu.Oder DPBS, um die Zellen eine Minute lang zu waschen. Dathyl pyro CARBATE oder DEPC-behandeltes 1×PBS kann ebenfalls verwendet werden. Verwenden Sie kein unbehandeltes PBS, da es Rnase-Enzyme enthalten könnte.Entfernen Sie das DPBS und geben Sie vorsichtig so viel 4 % Paraformaldehyd zu, dass die Zellen vollständig bedeckt sind. Inkubieren Sie 15 bis 20 Minuten. Danach entfernen Sie das Paraformaldehyd und waschen die Zellen einmalig mit DPBS für eine Minute. Entfernen Sie das DPBS und geben Sie 0,1 molare Glycinlösung zu. Inkubieren Sie 10 Minuten.Entfernen Sie anschließend das Glycin und waschen Sie die Zellen eine Minute lang mit DPBS. Nach dem Verwerfen des DPBS geben Sie 0,2 % Triton X-100 hinzu und inkubieren für fünf bis 10 Minuten. Falls Nukleolar- oder Kernhüllenproteine gefärbt werden sollen, permeabilisieren Sie mit Triton X-100 nicht länger als fünf Minuten, da sonst die Proteinsignallokalisierung diffus wird.Verwerfen Sie Triton X-100 und waschen Sie zweimal mit DPBS, jeweils eine Minute lang, bevor Sie mit dem Verfahren für die Fische beginnen. Bereiten Sie Unterlagen zum Inkubieren der Deckgläser vor und achten Sie darauf, diese sorgfältig zu reinigen und zu beschriften. Geben Sie für ein 18 Millimeter großes Deckglas 50 Mikroliter DNA-Lösung auf den Objektträger.Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist das sachgemäße Umgreifen von Deckgläsern. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die richtige Seite des Deckglases inkubiert wird, und sie vorsichtig zu handhaben. Um Brüche zu vermeiden, fügen Sie das Deckglas auf den Objektträger hinzu, wobei Sie darauf achten müssen, es mit der Zellseite nach unten zu platzieren, und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 15 Minuten legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach oben in eine Kulturbox mit einem X-D-P-B-S.Die Deckgläser eine Minute lang waschen. Diese Mischung enthält Folgendes: 50 % desionisiertes Ameisensäure, ein Milligramm pro Milliliter tRNA, zwei X-S-S-P-E, fünf X dnar RNAs, Sonden und DEPC-wasser bis zu einem Endvolumen von 50 Mikrolitern.Die Sonde ist eine mit Digoxigenin markierte RNA-Sonde, die komplementär zur viralen genomischen RNA konzipiert ist. Platziere jede Deckglaszelle mit der Zellseite nach unten auf die Hybridisierungsmischung auf dem Objektträger. Die Inkubation sollte in einer Schale durchgeführt werden, die eine 50%ige FIDE two X-S-S-P-E enthält.Mischen Sie und inkubieren Sie 16 bis 18 Stunden bei 42 Grad Celsius. Anschließend inkubieren Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach unten in 50 Mikrolitern 50 % Fide für 50 Minuten bei 42 Grad Celsius. Waschen Sie die Deckgläser zweimal in zwei X-S-S-P-E, indem Sie sie jeweils für fünf Minuten mit der Zellseite nach unten in 50 Mikrolitern zwei X-S-S-P-E bei 42 Grad Celsius inkubieren.Schließlich waschen Sie die Deckgläser ein Mal in X-D-P-P-S für eine Minute. Um diesen Vorgang zu beginnen, blockieren Sie die Deckgläser, indem Sie die Zellseite in 50 Mikroliter einer 1× Roche-Blockierungslösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur nach unten legen. Sobald die Blockierung abgeschlossen ist, legen Sie jedes Deckglas mit der Zellseite nach unten in 50 Mikroliter einer Primärantikörperlösung, die alle für das Experiment benötigten Primärantikörper in ihren jeweils geeigneten Konzentrationen enthält. Inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius, nach Ablauf dieser Stunde.Legen Sie die Deckglasseite mit der Zellseite nach oben in eine Kulturschale, die DPPS enthält, und waschen Sie die Deckgläser 10 Minuten lang. Geben Sie anschließend für jedes Deckglas 50 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung mittels Pipette auf einen Objektträger. Alexa-Fluor-konjugierte Antikörper können verwendet werden, um eine Farbpalette zu erzeugen, und werden im Verhältnis 1:500 in einer x Blockierungslösung und einem X-D-P-B-S verdünnt. Legen Sie jedes Deckglas mit der Zellseite nach unten in die sekundäre Antikörperlösung und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad.Die Deckgläser zweimal für jeweils 10 Minuten waschen. Die Deckgläser in DPBS mit der Zellseite nach oben auf ein Stück Filterpapier legen, um sie zu trocknen. Achten Sie darauf, die Deckgläser abzudecken, um eine Belichtung und Ausbleichung zu vermeiden.Nachdem die gesamte Flüssigkeit verdunstet ist, werden die Deckgläser auf frische Objektträger aufgebracht. Unter Verwendung von acht Mikrolitern Immuno Mount wird das Deckglas vorsichtig angetippt, um Luftblasen zu entfernen, und anschließend wird Nagellack an den Rändern des Deckglases aufgetragen, um es zu fixieren. Die Visualisierung von RNA und Proteinen mittels mikroskopischer Verfahren ist ebenfalls entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens.Die Einstellungen am Mikroskop können die Visualisierung unterstützen oder erschweren. Daher ist es entscheidend, dass die Mikroskopeinstellungen korrekt vorgenommen und innerhalb eines gegebenen Experiments von einer Probe zur nächsten konsistent gehalten werden. Ein repräsentatives Ergebnis der Visualisierung viraler RNA mittels FISH und der Proteinlokalisation mittels Immunfluoreszenz zeigt diese Abbildung.In diesem ersten Panel, in dem Hela-Zellen mit HIV-1 transfiziert wurden, ist die virale RNA für HIV-1, die grün markiert ist, überwiegend diffus im Zytoplasma sichtbar, obwohl kleine zytoplasmatische Pünktchen nicht ungewöhnlich sind. Die Spezifität zeigt sich im Vergleich positiver Zellen mit angrenzenden Zellen, die keine Fluoreszenz aufweisen, wie das Schwarz-Weiß-Einzelbild veranschaulicht, das lediglich die Färbung der viralen RNA darstellt. Die rote Färbung entspricht der Immunfluoreszenz des Ross-GA-PSH-Dreidomänen-bindenden Proteins oder G3BP, das hauptsächlich das Zytoplasma markiert. Wenn Hela-Zellen mit HIV-1 transfiziert werden, das das regulatorische Rev-Protein fehlt, bleibt die produzierte virale RNA im Kern zurück.Dies kann als helles grünes Signal im Kern und als Fehlen eines RNA-Fluoreszenzsignals im Zytoplasma visualisiert werden. Die Verteilung der HIV-einzelsträngigen RNA kann ebenfalls durch die Überexpression bestimmter zellulärer Proteine verändert werden. Beispielsweise führt die Überexpression des mit RAB7 interagierenden lysosomalen Proteins oder REAL, eines Proteins, das an der endosomalen Vesikeltransportierung beteiligt ist, zur erneuten Lokalisation der in grün markierten viralen genomischen RNA zum Mikrotubuli-Organisationszentrum.Hier werden die Endosomen durch Lamp1 markiert und rot angefärbt. Im Gegensatz dazu führt die Überexpression eines aminoterminal deletierten Delta N, das nicht an P150 der Dynin-Motor-Subkomplexe binden kann, zur Streuung später Endosomen im Cytoplasma. Die Überexpression von P150-Dynin blockiert die große Untereinheit des Dynin-Motors und setzt späte Endosomen sowie die virale genomische RNA und die HIV-V1-Strukturproteine an die Zellperipherie frei. Wenn HIV-1 in HELO-Zellen exprimiert wird und anschließend die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und analysiert werden, erscheint die virale RNA bereits drei Stunden nach Transfektion und Infektion in der Zelle und ist mittels dieser FISH-Technik ab zwölf Stunden deutlich sichtbar.Hier wird die virale RNA-Expression in Grün verfolgt, während das zelluläre Protein H-N-R-N-P-A1 in Rot angefärbt ist. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie am ersten Tag in 20 Minuten und am zweiten Tag in vier Stunden und dreißig Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Deckgläser vorsichtig zu handhaben, um sie nicht zu beschädigen, und sicherzustellen, dass nach der Applikation des sekundären Antikörpers Licht vermieden wird. Vergessen Sie nicht, dass beim Arbeiten mit HIV V1 und anderen hochpathogenen Erregern vor der Fixierung eine extreme Gefährdung besteht und Vorsichtsmaßnahmen wie ausreichende Schulung und sichere Eindämmung stets getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video wurden die mit MCPyV-Virionen infizierten Zellen einer in situ Hybridisierungskettenreaktion unterzogen, um MCPyV-spezifische Genome nachzuweisen. Darüber hinaus wurde die DNA-HCR-Technik mit FISH kombiniert, um die MCPyV-DNA in infizierten menschlichen Hautzellen sichtbar zu machen.

HCR-DNA FISH: Eine Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnik zum Nachweis viraler DNA in infizierten Zellen

Quelle: Vallery, T. K. &amp; Steitz, J. A. Quantitative Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen. J. Vis. Exp. (2019)In diesem Video wird die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Visualisierung viraler RNA in virusinfizierten Zellen demonstriert. Es werden die Schritte der Sondenhybridisierung, Signalverstärkung und konfokalen Bildgebung erläutert.

Bestimmung der viralen RNA-Verteilung in Wirtszellen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Dieses Video demonstriert die Anwendung der Hybridisierungskettenreaktion (HCR)-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von subgenomischer SARS-CoV-2-RNA. Die Kombination von HCR mit Immunfluoreszenztechniken hat das Potenzial, Einblicke in Wirt-Virus-Interaktionen auf Einzelzellebene zu geben.

Verwendung von Immun-RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von SARS-CoV-2

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Darmmikroben, einschließlich extrazellulärer Bakterien und intrazellulärer Krankheitserreger wie dem Orsay-Virus und Mikrosporidien (Pilze), sind oft mit wilden Caenorhabditis-Nematoden assoziiert. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroben vor, die C. elegans-Nematoden besiedeln und/oder infizieren, und zur Messung der Erregerlast nach kontrollierten Infektionen im Labor.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Dieses Video-Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie man eine Samenprobe Prozess zu einer qualitativ hochwertigen Fluoreszenz zu...

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Lernen Sie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung viraler RNA in infizierten Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Lokalisierung und Untersuchung des intrazellulären Virus-Traffickings.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz

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