Name: Microdialysis Ethanol während operante Ethanol Selbstverwaltung und Ethanol Bestimmung durch Gaschromatographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Lernen Sie Mikrodialyse bei operanter Ethanol-Selbstverwaltung bei Ratten zur Echtzeitüberwachung von Ethanol im Gehirn. Diese Methode ermöglicht kontinuierliche Probenahme während Verhaltensaufgaben.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH / NIAAA (AA11852 und AA007471) unterstützt.

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</ol>

Dieser Artikel wurde von Med Associates, Inc. finanziert

Anwendungen und Grenzen Drug Selbstverwaltung wird in Nagetieren zu modellieren Drogenabhängigkeit eingesetzt. Viele Arzneimittel des Missbrauchs, die auf diese Weise modelliert werden kann intravenös verabreicht werden, in denen der Arzneistoff direkt mit der zentralen Kammer geliefert. Dies ermöglicht eine engmaschige Überwachung der Dosis über einen Selbst-verwaltung Sitzung. Da Ethanol ist in der Regel mündlich selbst verwaltete, ist es viel schwieriger, Wirkstoffspiegel aufgrund individueller Unterschiede in der Absorption und Stoffwechsel überwachen. Durch die Verwendung von Mikrodialyse zur Probe aus dem Gehirn region of interest, sind wir nicht nur in der Lage, um das Muster von Ethanol erreicht die Region zu überwachen, aber wir sind auch in der Lage, gleichzeitig überwachen Neurotransmitter Veränderungen in der gleichen Region im Laufe der Zeit bei jedem Selbstverwaltung Phase. Neurochemischen Änderungen und Medikamenten-induzierten Reaktionen im Gehirn mit Drogenmissbrauch und Abhängigkeit verbunden, so die Fähigkeit, gleichzeitig measicher, neurochemische und Wirkstoffkonzentrationen während bestimmter Selbstverwaltung Phasen bietet eine sehr mächtige und einzigartige Werkzeug. Ein Problem im Auge zu korrelieren Dialysat Konzentrationen an Analyten mit dem Verhalten zu halten, ist die physikalischen Eigenschaften der Mikrodialyse Sanitär. Insbesondere ist die Zeit, die für Fluid aus dem Lumen der Mikrodialysesonde dem Sammelröhrchen übertragen kritisch und kürzere Zeiten sind besser. In unserem Labor konstruieren wir die Sonden so dass die Zeit etwa 90 Sekunden. Mit diesen Bedingungen haben wir gefunden, dass es eine accumbal Dopamin Anstieg zu Beginn der Ethanol Verbrauch, der im Verlauf von der Getränkeindustrie und post-Getränk Perioden als den Dialysat Ethanolkonzentration abnimmt. 2,3,8,9 Diese Experimente , wenn sie mit Daten aus pharmakologischen Studien kombiniert, haben uns erlaubt, zu analysieren, die strikt pharmakologische Wirkungen von Ethanol und Selbstverwaltung verbunden Umweltreize auf changes in Neurotransmitter-Konzentrationen. Es sei darauf hingewiesen, dass diese spezielle Anwendung der kombinierten Verhaltens-Mikrodialyse-Techniken auf die aktuellen Forschungsinteressen unserem Labor wird geeignet sein. Es wurde entwickelt, um das zeitliche Muster von Ethanol das Gehirn erreicht im Vergleich zu dem Muster der Neurotransmitter ändert sich in der Region auszuwerten, so dass wir diese Maßnahmen auch auf synchrone Selbstverabreichung Verhaltensweisen beziehen. Die abgeleiteten Dialysat Ethanolkonzentrationen sind nicht für in vivo-Sonde Recovery korrigiert und sind nur ein Bruchteil des Gehirns Ethanol Gewebskonzentration. Wenn quantitative Mikrodialyse Ethanol erforderlich ist, sollte die Extraktion Bruchteil Ethanol daß aus dem extrazellulären Raum in die Sonde diffundiert experimentell bestimmt werden. Siehe bisherigen Veröffentlichungen aus unserem Labor für Methoden und weitere Diskussion. 10,11,12 Obwohl dieses Protokoll zeigt die Verwendung von Gas-chromatography zusammen mit Festphasenmikroextraktion von Ethanol aus dem Kopfraum des Mikrodialyse Proben könnten andere Methoden zur Analyse der Ethanolgehalt der Mikrodialyse Probe verwendet werden. Allerdings können alternative Methoden aus einigen Nachteilen leiden. Zum Beispiel können weniger empfindlichen analytischen Methoden erfordern einen größeren Probenvolumen das Probenahmen mal größer als die hier dargestellten 5-7 min erfordert. Die Art der hier diskutierten System verwendet eine Festphasenmikroextraktion, die Ethanol konzentriert in der Dampfphase in dem abgedichteten Probenphiole indem Absorption an die Faser in der Phiole Kopfraum platziert. Dies verbessert die Nachweisgrenze im Vergleich zu direkten Kopfraum Probenahme ermöglicht die typischerweise 50-100 Mikroliter des Dampfes zu injizieren. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Dampfraum-Verfahren ist, dass die Probe zur Analyse injiziert extrem sauber und frei von Salzen ist. Direkte Injektion der Flüssigkeit Mikrodialyse Probe kann auch mit höheren Sensit verwendet werdenduktivität, aber dies wird mehr Instrument Ausfallzeiten durch regelmäßige Wartung für die Reinigung der injizierten Salzen erforderlich erfordern. Trouble-shooting und andere Notizen <ol><li> Bevor Ihr Experiment beginnt, geben Sie sich genügend Zeit, um zu überprüfen, dass Ihre Mikrodialyse Set-ups richtig funktionieren und ein störungsfreies schießen keine Probleme. Wir schlagen vor, dass Sie eine zusätzliche Set-up, mit ACSF perfundiert, zum Umstieg bereit sind mit haben eine Fehlfunktion set-up um Zeit zu sparen, da die meisten operante Sitzungen zu einem bestimmten Zeitpunkt auftreten, jeden Tag neigen. </li><li> Sicherstellen, dass die Mikrodialysesonden über einen Zeitraum von etwa 5 min eingesetzt sind, um die Gewebeschädigung durch Scherung des Gewebes, während die Sonde dringt das Gehirn produzierte minimieren. </li><li> Bei der Übertragung der Ratte in den operante Kammer ist es hilfreich, eine zweite Person zu unterstützen, damit die Übertragungsleitung (Teil der Mikrodialyse set-up) nicht verheddert, und so, dass der operante Programm init kanniated auf Zeit. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Sie den Autosampler Wasserbad genügend Zeit, um die richtige Temperatur zu erreichen geben. Unserem System erfordert typischerweise zwei Stunden auf 50 ° C zu erreichen Auch versichern, dass Ihre Proben sind voll, bevor die Analyse der Proben verdampft. Wir in der Regel visuell zu bestätigen, dass dies vor Beginn der Analyse von Proben aufgetreten. </li><li> Norm gute analytische Chemie Praktiken sollten befolgt werden. Diese umfassen, sind aber nicht darauf, Validierung von Individuen, Ausrüstung und Verfahren beschränkt. In kurzen, beschäftigen wir die folgenden Richtlinien: Einzelne Benutzer sollte die Möglichkeit, reproduzierbare Peakhöhe Werte für Standard-Konzentrationen und lineare Eichkurven (R2 ≥ 0,99) über mehrere Tage erstellen zu demonstrieren. So überprüfen Sie die GC-FID-System korrekt arbeitet, sollten Standards immer analysiert werden, bevor irgendwelche Dialysat Proben injiziert werden. Die Standardkurve generiert sollte eine R2 ≥ 0,99. </li><li> Die meisten Geräte verwenden wirwurde durch Varian, Inc., die von Agilent Technologies im Jahr 2010 erworben wurde gekauft. Zu diesem Zeitpunkt erhalten Bruker Scientific Instruments Varian Labor Gaschromatographie Instrumente Geschäft. Für zukünftige Einkäufe, wenden Sie sich entweder Unternehmens. </li><li> Das vorliegende Protokoll zeigt operante Verhalten mit Ratten, aber der Betrachter sollten sich bewusst sein, dass mehr Störungen des Verhaltens, mit dem kleineren Mausmodell auftreten. Ein weiteres Problem zu beachten ist, dass die Platzierung eines Mikrodialysesonde in Hirnregionen andere als die medialen präfrontalen Kortex oder Nucleus accumbens kann operante Verhalten in einem größeren Ausmaß als hier gezeigt zu stören. Es ist wichtig, genau zu prüfen zahlreichen Verhaltensparameter um festzustellen, ob der Schaden durch Aufsetzen der Sonde verursacht zu schweren Veränderungen im Verhalten. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 95% Ethanol </td><td> Aaper Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY </td><td> E190, 111000190 </td></tr><tr><td> Ultra-Pure Sucrose </td><td> MP Biomedicals, LLC, Solon, OH </td><td> 821721 </td></tr><tr><td> Ultra High Purity Helium </td><td> Air Gas </td><td> HE UHP300 </td></tr><tr><td> Luft </td><td> Air Gas </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> Wasserstoff </td><td> Air Gas </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> GC 2 ml-Fläschchen </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0015 </td></tr><tr><td> GC Verschlusskappen mit PTFE / Silikon Septum </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0084 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifisch Reagenzien

microdialysis ethanol während operante ethanol selbstverwaltung und ethanol bestimmung durch gaschromatographie

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant Selbstverwaltung Methoden werden häufig verwendet, um die Verhaltens-und pharmakologische Wirkungen vieler Medikamente von Missbrauch, einschließlich Ethanol zu studieren. Allerdings ist Ethanol in der Regel mündlich statt intravenös wie viele andere Drogen selbst verabreicht. Die Pharmakokinetik von oral verabreichten Medikamenten sind komplexer als intravenös zu verabreichende Arzneimittel. Weil das Verständnis der Beziehung zwischen den pharmakologischen und Auswirkungen auf das Verhalten von Ethanol erfordert Kenntnisse über den zeitlichen Verlauf von Ethanol Erreichen des Gehirns während und nach dem Trinken, verwenden wir in vivo Mikrodialyse und Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektor zum Gehirn Dialysat Ethanolkonzentrationen im Laufe der Zeit zu überwachen. Kombiniert Mikrodialyse-behavioralen Experimenten mit dem Einsatz verschiedener Techniken. In diesem Artikel, stereotaktischen Operation, Verhaltenstraining und Mikrodialyse, die geeignet ist, eine Vielzahl von Selbstverwaltung und neu getestet werden könnenpetrochemischen centered Hypothesen, werden nur einbezogen, um zu zeigen, wie sie zu den nachfolgenden Phasen der Probennahme und Dialysat Ethanol Analyse zusammenhängen. Dialysat Ethanolkonzentration Analyse mittels Gaschromatographie mit Flammen-Ionisations-Detektion, die spezifisch für Ethanol Studien ist, wird im Detail beschrieben. Daten nach diesen Methoden hergestellten zeigen die Muster von Ethanol Erreichen des Gehirns während der Selbstverwaltung Verfahren, und wenn sie mit neurochemischen Analyse der gleichen Dialysat Proben gepaart, lässt Rückschlüsse auf die pharmakologischen und Auswirkungen auf das Verhalten von Ethanol hergestellt werden.

Ein Verfahren, um den Zeitverlauf der Ethanolkonzentration in den Gehirnen von Ratten während operante Ethanol bestimmen Selbstverabreichung beschrieben. Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion wird verwendet, um Ethanol in den Proben zu quantifizieren Dialysat, weil es die Empfindlichkeit für die kleinen Volumina erzeugt werden, die erforderlich ist.

Microdialysis Ethanol während operante Ethanol Selbstverwaltung und Ethanol Bestimmung durch Gaschromatographie

Operante Selbstadministrationsmethoden werden häufig eingesetzt, um die behavioralen und pharmakologischen Wirkungen vieler Suchtstoffe, einschließlich Ethanol, zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Ethanolspiegel in Gehirndialysat während einer Sitzung der selbstverabreichenden Ethanolapplikation zu überwachen. Um dieses Maß mit synchronen Verhaltensweisen der Selbstapplikation zu vergleichen, wird dies erreicht, indem zunächst eine Mikrodialyse-Führungs- und Kanülenanordnung sowie ein Befestigungsbolzen chirurgisch implantiert werden und anschließend Ratten trainiert werden, Ethanol operant selbst zu verabreichen. Der zweite Schritt besteht darin, die Tiere an die Kopfhalterung mit dem Flexkabel zu gewöhnen, sodass diese während der Mikrodialyse die Ethanol-Selbstapplikation nicht beeinträchtigt.Danach wird eine Mikrodialyse während einer Alkohol-Selbstapplikationssitzung durchgeführt, bei der ein Teil des Dialysats zur Alkoholanalyse vorbereitet wird. Anschließend werden die Dialysatproben hinsichtlich ihrer Ethanol-Konzentration mittels Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion analysiert. Letztendlich zeigen die erhaltenen Ergebnisse den zeitlichen Verlauf des Alkohols, der während einer Alkohol-Selbstapplikationssitzung die untersuchte Hirnregion erreicht.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Punktion der Schwanz- oder Safenvene besteht darin, dass dieses Verfahren zum Zeitpunkt der Probenentnahme minimal invasiv ist und die Messung von Medikamentenkonzentrationen im Zeitverlauf in der gewünschten Hirnregion ermöglicht, während das Tier eine Verhaltensaufgabe ausführt. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da sie eine Reihe spezialisierter Fähigkeiten erfordert, von denen viele nur durch wiederholte Übung oder praktische Erfahrung erworben werden können. Die Durchführung der Methode wird außerdem von Jeffrey Dilley, einem studentischen Hilfskraft in unserem Labor, demonstriert. Alle gezeigten Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas genehmigt und entsprechen den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Für diese Verhaltens-Mikrodialyse-Experimente werden Ratten des Long-Evans-Typs verwendet, die an der University of Texas at Austin gehalten werden, über eine akkreditierte ALAC-Einrichtung verfügen und mit einer 21-Gauge-Kanüle über dem gewünschten Hirnareal chirurgisch implantiert wurden. Alle Tiere sollten mindestens eine Woche postoperative Pflege und Erholung erhalten und vor Beginn der folgenden Verfahren gesund sein.Stellen Sie die Ratte in eine Operantenkammer von Med Associates, die mit einem lichterartigen versenkbaren Hebel und einem Tippgefäss ausgestattet ist, und trainieren Sie sie dazu, den Hebel zu betätigen, um Zugang zu einer 10%igen Saccharoslösung zu erhalten. Nachdem die Ratte darauf trainiert ist, auf die Saccharoslösung zu reagieren, beginnen Sie mit einem geeigneten Trainingsplan, bei dem über mehrere Trinkphasen hinweg in der Nacht vor der vorletzten operanten Sitzung schrittweise Ethanol in die Lösung gegeben wird. Nach der Anästhesie des Tieres und Überprüfung des Sedierungsniveaus befestigen Sie die Schlaufe der Feder an der Schraubhalterung am Kopfplatz der Ratte, um sie an die Vorrichtung zu gewöhnen, die aus einem Ausgleichshebel, Arm, drehbarem Schlauch, Feder und Ringständer besteht.Lassen Sie die Ratte die Nacht über im operanten Versuchsraum in ihrem Heimkäfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser verbringen und führen Sie am nächsten Tag die Trainingssitzung mit dem Tether und der dazugehörigen Ausrüstung durch, und zwar am Tag vor dem Mikrodialyse-Experiment. Nach der Anästhesie der Ratte mit Isofluran überprüfen Sie die Sedierung durch einen Zehenquetschtest und setzen eine mit künstlichem zerebrospinalem Liquor perfundierte Mikrodialysesonde ein. Sichern Sie die Sonde ordnungsgemäß und stellen Sie anschließend die Flussrate der Sonde auf 0,2 µL pro Minute ein.Stellen Sie die Ratte mit der gesamten Dialyseausrüstung in ihrem Heimkäfig im operanten Versuchsraum über Nacht unter Zugang zu Futter und Wasser. Am Tag nach dem Einsetzen der Sonde, mindestens zwei Stunden vor Versuchsbeginn, erhöhen Sie die Sonde auf ihre Arbeitsflussrate. Überprüfen Sie mithilfe einer Hamilton-Spritze, ob die Flussrate der Sonde konstant ist und mindestens 90 % der eingestellten Flussrate beträgt.Wenn Neurotransmitter in den Dialysatproben untersucht werden sollen, entnehmen Sie Proben während aller Phasen des Experiments. Sammeln Sie zunächst Dialysatproben, während sich das Tier in seinem Heimkäfig befindet. Lagern Sie die Proben angemessen für eine spätere Analyse.Überführen Sie die Ratte vorsichtig in die operante Kammer und starten Sie das Programm, das die Kammer steuert. Setzen Sie die Probenahme fort, während die Ratte wartet, bis der Hebel in die Kammer ausgefahren wird – nehmen Sie zwei Proben, bevor der Hebel ausgefahren wird. Beginnen Sie damit, einen Teil jeder Dialysatprobe für die Ethanol-Analyse zu sammeln, indem Sie ein geeignetes Aliquot Dialysat in ein zwei Milliliter fassendes Glasfläschchen pipettieren und das Fläschchen mit einer luftdichten Septumkappe verschließen; pipettieren und verschließen Sie die Ethanol-Proben schnell. Da Ethanol flüchtig ist und das Probenvolumen gering ist, führt eine inkonsistente oder langsame Probenvorbereitung zu ungenauen Ergebnissen. Bewahren Sie den Rest für die Neurotransmitteranalyse auf. Die 20-minütige Trinkphase beginnt, nachdem das Med-Associates-Computerprogramm den Hebel in die Kammer ausgefahren hat und die Ratte ihn betätigt, um Zugang zu einer Flasche Trinklösung zu erhalten.Nehmen Sie weiterhin Proben während des gesamten Trinkzeitraums; nach Beendigung des Trinkzeitraums zieht das Computerprogramm die Flasche aus der Kammer zurück. Halten Sie das Tier am Ende des Mikrodialyseexperiments für einen zusätzlichen 20-minütigen Post-Trinkzeitraum in der Kammer. Nach der Anästhesie der Ratte entfernen Sie die Sonde.Wenn das Tier nicht unverzüglich human euthanasiert wird, ersetzen Sie den Obturator, um die Sichtbarmachung der Sondebahn sicherzustellen. Sammeln Sie das Gehirn innerhalb von drei Tagen nach dem Experiment. Analysieren Sie die Proben zusammen mit externen Ethanolstandards mittels eines Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor, einem Headspace-Autosampler, der auf 50 Grad Celsius erhitzt wird, und einer Kapillarsäule mit Helium als mobile Phase.Verwenden Sie eine Chromatographie-Workstation-Software, um das System für die Ethanol-Analyse vorzubereiten, und nehmen Sie die Aufzeichnung und Analyse der Chromatogramme vor. Heizen Sie die Probengabeplatte mit einem Umlaufwasserbad auf und öffnen Sie die Luft- und Wasserstoffflaschen. Starten Sie anschließend das Startprogramm.Wenn es bereit ist, führen Sie eine 20-minütige Verbrennung durch, die die Faser desinfiziert. Stellen Sie Standardlösungen her, indem Sie 238 Mikroliter 95 %igem Ethanol in einem 100-Milliliter-Messkolben mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 Milliliter verdünnen. Erstellen Sie die Standardreihen durch eine serielle Verdünnung im Verhältnis eins zu eins.Pipettieren Sie die Standards in Glasfläschchen und verschließen Sie diese genau wie die Proben. Achten Sie darauf, zusätzlich zu den Standards eine Wasserprobe (Leerprobe) mitzuführen. Geben Sie die Standards und Proben in das Probengeberfach des Autosamplers und erhitzen Sie sie, bis die gesamte flüssige Aliquot vollständig verdampft ist. Um die Standards und Proben zu analysieren, erstellen Sie eine Probenliste, in der vermerkt ist, welche Probe sich in welchem Platz des Automatenprobengebers befindet, und notieren Sie, dass jede Probe angebohrt werden sollte. Leiten Sie anschließend die Datendateien in einen ausgewählten Ordner weiter, wählen Sie eine geeignete Methode für die Proben aus und starten Sie die Analyse. Nachdem das System alle Proben durchlaufen hat, überprüfen Sie, ob das Programm jeden Peak korrekt integriert hat.Tragen Sie die Peakhöhe in Abhängigkeit von jedem bekannten externen Standard auf. Ethanol-Konzentration. Verwenden Sie die durch die Punkte gegebene lineare Funktion, um die Ethanol-Konzentration jeder Dialysatprobe zu interpolieren.Diese Abbildung zeigt Beispiel-Chromatogramme für drei Konzentrationen von Ethanol-Standards sowie eines für eine Ratten-Dialysatprobe, die am Ende der Ethanol-Selbstapplikationssitzung gesammelt wurde. Die Ethanol-Peaks sollten relativ symmetrisch sein, konsistente Retentionszeiten aufweisen und ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 10 aufweisen. Wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind, muss das System gewartet werden. Hochwertige Chromatographie und korrekte Standards ergeben eine lineare Eichkurve, mit deren Hilfe die Ethanol-Konzentration der Dialysatproben berechnet wird, die während der Selbstapplikationsphase von den Tieren gesammelt wurden.Die ermittelten Ethanol-Konzentrationen im Dialysat sind nicht für die in-vivo-Probenrückgewinnung korrigiert und stellen nur einen Bruchteil der ethanolkonzentration im Gehirngewebe dar. Falls eine quantitative Mikrodialyse von Ethanol erforderlich ist, wird der Extraktionsanteil von Ethanol, der aus dem extrazellulären Raum in die Sonde diffundiert, experimentell bestimmt. Wenn man diese Methode einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa vier bis fünf Stunden durchgeführt werden.Das hängt von der Dauer der Verhaltenssitzung ab. Ein erfolgreicher Abschluss der Mikrodialysephase des Experiments hängt weitgehend von der Qualität der vorbereitenden Phasen ab. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass Ihre Ratten gut angefasst wurden und Sie sie an alle möglicherweise störenden Reize gewöhnt haben, die während des Dialyseexperiments auftreten könnten, damit das Selbstapplikationsverhalten der Tiere nicht beeinträchtigt wird.

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