Name: Fluoreszierend In situ Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Lernen Sie FISH zur Chromosomenkartierung bei Mücken. Diese Methode nutzt Imaginalscheiben von Larven, um hochwertige mitotische Chromosomenpräparate für Anopheles, Aedes und Culex zu erhalten.

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Wir danken Sergei Demin und Tatjana Karamysheva für ihre Hilfe bei Chromosom Vorbereitung und FISH auf Anopheles. Wir danken auch David Severson für die Bereitstellung Aedes und Culex genomische DNA BAC-Klone und Melissa Wade für die Bearbeitung des Textes. 1R21 AI88035-01 bis Maria V. Sharakhova und 1R21 AI094289-01 bis Igor V. Sharakhov: Diese Arbeit wurde durch zwei Zuschüsse aus dem National Institutes of Health unterstützt.

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<li>Kumar, A., Rai, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+localization+and+copy+number+of+18S%2B28S+ribosomal+RNA+genes+in+evolutionary+diverse+mosquitoes+%28Diptera%2C+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hereditas%22%5BJournal%5D)">Chromosomal localization and copy number of 18S+28S ribosomal RNA genes in evolutionary diverse mosquitoes (Diptera, Culicidae).</a> Hereditas. 113, 277-289 (1990).</li>
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<li>Brown, S. E., Severson, D. W., Smith, L. A., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+the+Aedes+aegypti+mosquito+genetic+linkage+and+physical+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of the Aedes aegypti mosquito genetic linkage and physical maps.</a> Genetics. 157, 1299-1305 (2001).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Nichtfluoreszierenden in situ Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen von Moskitos wurde erstmals 1990 von A. Kumar und K. Rai 17 durchgeführt. In dieser Studie ribosomalen 18S und 28S-DNA-Gene, zusammen in einem Plasmid kloniert wird, wurden auf den Chromosomen 20 Stechmückenarten platziert. Die DNA-Sonde wurde radioaktiv markiert und hybridisiert an die Chromosomen aus Gehirn Ganglien. Zwischen drei Moskito Gattungen wurde eine FISH-Technik nur für mitotischen Chromosomen von der Zelllinie von Ae entwickelt. aegypti 10,18,19 und hat noch nie auf mitotische Chromosomen von Live-Mücken durchgeführt. Kürzlich entwickelten wir eine einfache, robuste Technik für den Erhalt hochwertiger Chromosom Zubereitungen aus IDs von 4 th Larven 9. Diese Methode ermöglicht eine hohe Anzahl von Chromosomen in eine Folie erhalten werden und ist universell für alle Arten von Stechmücken verwendet werden. Die Notwendigkeit der Verwendung von nur Larven, nicht Puppen oder Erwachsener stages von Mücken, zum Präparat ist wahrscheinlich die einzige Einschränkung des Verfahrens. Die Standard-FISH-Methode 12 wurde für die Verwendung von genomischen BAC-Klon und IGS rDNA als Sonden für den mitotischen Chromosomen Aedes, Culex und Anopheles optimiert. Zusätzlich zu diesen spezifischen Anwendungen können die FISH-Protokolle hier beschriebenen auch für andere Zwecke verwendet werden. Die fortgeschrittene FISH-Protokoll, das C 0 t DNA Fraktionen zur Blockierung unspezifischer Hybridisierung verwendet, können auch für die Hybridisierung von BAC-Klonen oder anderen großen DNA-Fragmente in heterochromatischen Regionen Anopheles aufgebracht werden. Heterochrome Regionen mit Transposons und andere Wiederholungen angereichert und Sonden aus diesen Regionen produzieren normalerweise starken Hintergrund auf den Chromosomen 3. Verwendung unmarkiert C 0 t DNA Fraktionen werden dazu beitragen, unspezifische Hybridisierung der Sonde an die Chromosomen reduzieren. Die einfache Version des FISH protocol kann für jede rDNA oder sich wiederholende DNA-Sonden auf mitotischen Chromosomen von Mücken und anderen Insekten verwendet werden. Darüber hinaus kann es auch für die Hybridisierung von DNA-BAC-Klons in Spezies mit geringem repetitiven DNA-Gehalt in euchromatischen Regionen wie Anopheles oder Drosophila angewendet werden. Die hier vorgeschlagene Protokoll wird dazu beitragen, hoch fertigen Chromosom Genom-basierten Baugruppen für Mücken zu erhalten, und können allgemein für verschiedene zytogenetische Anwendungen in anderen Gruppen von Insekten verwendet werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> MZ6 Leica Stereomikroskop </td><td> Leica </td><td> VA-OM-E194-354 </td><td> Eine andere Stereomikroskop benutzt werden </td></tr><tr><td> Olympus CX41 Phasenkontrastmikroskop </td><td> Olymp </td><td> CX41 </td><td> Eine andere Phase Mikroskop kann verwendet werden </td></tr><tr><td> Olympus BX61 Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olymp </td><td> BX61 </td><td> Eine andere Fluoreszenzmikroskop benutzt werden </td></tr><tr><td> ThermoBrite Slide Denaturierung / Hybridization System </td><td> Abbott Molecular </td><td> 30-144110 </td><td> Dient als Heizblock und einer feuchten Kammer </td></tr><tr><td> Präpariernadeln </td><td> Feine ScienceTools </td><td> 10130-10</td><td></td></tr><tr><td> Nadelhalter </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26018-17 </td><td></td></tr><tr><td> Präparierschere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td></td></tr><tr><td> 75x25 Doppel frosted micro gleitet </td><td> Corning </td><td> 2949-75x25 </td><td></td></tr><tr><td> 22x22 mm Mikroskop Deckgläser </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-10 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Rubber Cement </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-949-105 </td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Alcohol 200 Proof </td><td> Decon Laboratories </td><td> 2701 </td><td></td></tr><tr><td> Propionsäure </td><td> Sigma-ALDRIch </td><td> 402907 </td><td></td></tr><tr><td> Salzsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumcitratdihydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumacetattrihydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP334-500 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP152-1 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> P5493 </td><td></td></tr><tr><td> 10% NBF (neutral gepuffertes Formalin) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> 99% Formamid </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP227500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextransulfat-Natriumsalz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8906 </td><td></td></tr><tr><td> 20x SSC-Puffer </td><td> Invitrogen </td><td> AM9765 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM YOYO-1-iodid (491/509)-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> Y3601 </td><td></td></tr><tr><td> Antifade verlängern Gold-Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=P36930" target="_blank">P36930</a> </td><td></td></tr><tr><td> dATP, dCTP, dGTP, dTTP </td><td> Fermentas </td><td> R0141, R0151, R0161, R0171 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3-dUTP, Cy5-dUTP </td><td> GE Healthcare </td><td> PA53022, PA55022 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> DNA-Polymerase I </td><td> Fermentas </td><td> EP0041 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Fermentas </td><td> EN0521 </td><td></td></tr><tr><td> S1 Nuclease </td><td> Fermentas </td><td> EN0321 </td><td></td></tr><tr><td> Taq-DNA-Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18038-042 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-99-4 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> USB </td><td> 9001-75-6 </td><td></td></tr><tr><td> Lachssperma-DNA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D7656 </td><td></td></tr><tr><td> Nonidet-P40 (NP40) </td><td> US Biological </td><td> NC9375914 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Blood and Cell Culture Maxikit </td><td> Qiagen </td><td> 13362 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Large Construct Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12462 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

fluoreszierend<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierung auf mitotischen chromosomen der moskitos

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die routinemäßig von vielen Labors verwendet werden, um die chromosomale Position von DNA und RNA-Sonden zu bestimmen. Eine wichtige Anwendung dieser Methode ist die Entwicklung von hochwertigen physischen Karten nützlich für die Verbesserung der Genom-Baugruppen für verschiedene Organismen. Die natürliche Bandenmuster polytene und mitotische Chromosomen enthält Leitlinien für die präzise Anordnung und Ausrichtung der genomischen supercontigs. Unter den drei Gattungen Moskito, nämlich Anopheles, Aedes und Culex, ein gut etabliertes Chromosomen-Mapping-Technik ist nur für Anopheles, deren Mitglieder besitzen lesbaren Polytänchromosomen 1 entwickelt worden. Als Ergebnis der Bemühungen Genomkartierung, 88% der Ein. gambiae Genoms hat eine präzise Chromosom Positionen 2,3 gelegt. Zwei weitere mosquito Gattungen Aedes und Culex, haben schlecht Chromosomen b polytenizedeil der signifikante Überrepräsentation von Transposons in ihrem Genom 4, 5, 6. Nur 31 bzw. 9% der genomischen supercontings haben ohne Ordnung und Orientierung an Chromosomen Ae zugewiesen wurde. aegypti 7 und Cx. quinquefasciatus 8 auf. Mitotischen Chromosomen Vorbereitung für diese beiden Arten zuvor auf Gehirn Ganglien und Zelllinien beschränkt. Allerdings Chromosom Dias aus dem Gehirn Ganglien Mücken vorbereitet enthalten in der Regel geringe Zahl von Metaphase Platten 9. Außerdem, obwohl eine FISH-Technik wurde für mitotischen Chromosomen aus einer Zelllinie von Ae entwickelt. aegypti 10, macht die Ansammlung von mehreren chromosomalen Umlagerungen in Zelllinie Chromosomen 11 sie nutzlos für die Genom-Mapping. Hier beschreiben wir eine einfache, robuste Technik zur Gewinnung hochwertiger mitotischen Chromosomen Präparationen aus Imaginalscheiben (IDs) von 4 th Larvenstadium die ceine für alle drei Gattungen von Moskitos verwendet werden. Ein Standard-FISH-Protokoll 12 ist für die Verwendung von BAC-Klone von genomischer DNA als eine Sonde auf mitotischen Chromosomen Ae optimiert. aegypti und Cx. quinquefasciatus, und zur Verwendung einer intergenischen Spacer (IGS) Region der ribosomalen DNA (rDNA) als Sonde auf einem. gambiae Chromosomen. Neben physikalische Kartierung, kann die entwickelte Technik zur Bevölkerung Zytogenetik und Chromosom Taxonomie / Systematik der Mücken und andere Insekten Gruppen angewandt werden.

Unter den drei Gattungen Moskito, nämlich<em&gt; Anopheles,</em&gt;<em&gt; Aedes</em&gt;, Und<em&gt; Culex</em&gt; Wurden physikalische Kartierung des Genoms Techniken nur für etablierte<em&gt; Anopheles</em&gt; Besitzen, deren Mitglieder lesbar Polytänchromosomen. Für den Gattungen<em&gt; Aedes</em&gt; Und<em&gt; Culex</em&gt; Bleibt jedoch zytogenetische Zuordnung wegen der schlechten Qualität der Polytänchromosomen Herausforderung. Hier präsentieren wir ein universelles Protokoll für den Erhalt hochwertiger Präparate von mitotischen Chromosomen und eine optimierte FISH-Protokoll für alle drei Gattungen von Mücken.

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die in vielen Laboratorien routinemäßig eingesetzt wird, um die chromosomale Position von DNA- und RNA-Sonden zu bestimmen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache Technik zur Chromosomenkartierung von Mückengenomen zu entwickeln. Dies wird zunächst erreicht, indem Imaginaldiske von Mückenlarven des vierten Instars verwendet werden, um qualitativ hochwertige Chromosomenpräparationen zu erhalten. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden sowie nicht markierte repetitive DNA-Fraktionen zur Blockierung unspezifischer Hybridisierung der Sonde vorzubereiten.Der dritte Schritt besteht darin, fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden an die Chromosomen zu hybridisieren. Der letzte Schritt ist die Detektion der chromosomalen Lokalisation der Sonden mittels fluoreszenzmikroskopischer Analyse. Der Vorteil der Verwendung von Imaginalscheiben gegenüber Zelllinien oder Gehirnganglien liegt darin, dass eine hohe Anzahl bändertragender, ausbreitbarer Chromosomen leicht durch mechanische Einwirkung aus der Mückenlarve des Sternmückens (star mosquito) gewonnen werden kann, und zwar unter Anwendung standardisierter Protokolle.Schlüpfen Sie Mückeneier bei 28 Grad Celsius; nach zwei bis drei Tagen überführen Sie Larven des zweiten oder dritten Instars in Inkubatoren mit 16 Grad Celsius oder 22 Grad Celsius, abhängig von der Art. Der Instar-Entwicklungsstadium basiert auf der Größe der Kopfkapsel. Sobald vierte-Instar-Larven verfügbar sind, immobilisieren Sie diese auf Eis und überführen Sie die Larven anschließend auf einen Objektträger mit einem Tropfen kalter hypotonischer Lösung.Wählen Sie unter einem Stereomikroskop Larven mit ovalförmigen Imaginalanlagen für die weitere Dissektion aus. Der Begriff Imaginalanlagen wird mit IA abgekürzt. Die Auswahl des richtigen Entwicklungsstadiums der Mückenlarven mit ovalförmigen Imaginalanlagen ist äußerst wichtig, um qualitativ hochwertige Chromosomenpräparate zu erhalten.Amputieren Sie mit einer Schere die Larvenköpfe und schneiden Sie das Cuticula an der ventralen Seite des Rumpfes auf. Führen Sie einen zusätzlichen Schnitt im zweiten oder dritten Bauchsegment durch, um den Darm zu präparieren. Öffnen Sie nun das Cuticula und entfernen Sie den Darm und den Fettkörper aus den Larven. Die hypotonische Lösung vom Objektträger mit Filterpapier aufsaugen. Die Lösung durch einen frischen Tropfen hypotonischer Lösung ersetzen, der direkt über den IDs platziert wird. Die Larven 10 Minuten lang in der hypotonischen Lösung belassen.Entfernen Sie anschließend die Lösung mit Filterpapier und geben Sie die Car-Farblösung hinzu. Die ID's färben sich sofort weiß und sind unter dem Mikroskop leicht sichtbar. Entfernen Sie die ID's mithilfe von Präpariernadeln aus der Larve.Ein Tropfen 50 %iger Propionsäure hinzufügen, anschließend die Präparate mit einem Deckglas abdecken und weitere 10 Minuten warten, bevor fortgefahren wird. Danach das Objektträgerplättchen mit Filterpapier bedecken und das Gewebe durch intensives Antippen mit dem Radiergummi eines Bleistifts auf dem Deckglas plattieren. Die Qualität des Präparats kurzzeitig im Phasenkontrastmikroskop bei 100×- oder 200×-Vergrößerung analysieren.Präparationen mit mehr als 50 Chromosomenpräparaten können als geeignet für FISH betrachtet werden. Tauchen Sie den Objektträger nun in flüssigen Stickstoff ein und halten Sie ihn dort, bis das Blasen aufhört. Entfernen Sie die Deckglas mit einem Rasiermesser und überführen Sie den Objektträger unverzüglich in einen Behälter mit 70 %igem Ethanol, der bei minus 20 Grad Celsius gekühlt ist.Zur Dehydrierung sammeln Sie die Objektträger in kaltem 70%igen Ethanol, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Danach dehydrieren Sie die Objektträger in einer Reihe von Ethanolbädern jeweils fünf Minuten lang und lassen Sie anschließend bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Bewahren Sie die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius auf, bevor Sie genomische DNA aus Fisch extrahieren und DNA zurückklonieren sowie die repetitiven DNA-Fraktionen aus der gewünschten Mückenart isolieren, um die Sondenmarkierung durch Rückklonung von DNA unter Verwendung der NIC-Translation und I-G-S-R-D-N-A mittels PCR vorzubereiten.Die Verfahren für diese beiden Sonden unterscheiden sich geringfügig bei Fischen mit Rückenklonen. Beginnen Sie damit, die ID-Objektträger 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in zwei XSSC zu inkubieren. Überführen Sie anschließend die Objektträger in ein Gefäß mit einer Pepin-Lösung in Salzsäure und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Nach dem Pepin-Bad die Objektträger fünf Minuten lang in 1× PBS waschen, bevor sie in ein Gefäß mit Formalin in PBS gegeben werden. Die Chromosomen 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Das Formalin mit 1× PBS fünf Minuten lang abwaschen und anschließend die Objektträger mit derselben Ethanolreihe wie zuvor dehydrieren.Trocknen Sie die Präparationen abschließend an der Luft. Denaturieren Sie danach die Objektträger in einem Behälter mit vorgewärmter 70%iger Ameisensäure zwei Minuten lang bei 72 Grad Celsius. Anschließend dehydrieren Sie die Objektträger in einer Ethanolreihe und trocknen sie anschließend bei 37 Grad Celsius an der Luft. Zu diesem Zeitpunkt die Fisch-Hybridisierungsmischung vorbereiten. Die DNA nun durch Zugabe von 0,1 Volumen 3-molarer Natriumacetatlösung und zwei Volumina Ethanol ausfällen. Die Mischung bei minus 20 Grad Celsius für ein bis drei Stunden lagern.Als Nächstes das präzipitierte DNA zentrifugieren, den Ethanol abpipettieren und das Pellet lufttrocknen. Das Pellet bei Raumtemperatur zwei bis drei Minuten trocknen lassen. Anschließend das DNA-Pellet vollständig in 10 Mikrolitern Hybridisierungspuffer auflösen.Denaturieren Sie die Hybridisierungslösung sieben Minuten lang bei 97 Grad Celsius. Stellen Sie sie anschließend unmittelbar für eine Minute auf Eis. Führen Sie danach eine Vorhybridisierung der Lösung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten durch.Die Vorhybridisierung der DNA-Sonde mit unmarkierten repetitiven DNA-Anteilen ist entscheidend, um unspezifische Hybridisierung der Sonde an die Chromosomen zu verhindern. Geben Sie 10 Mikroliter der Hybridisierungsmischung auf einen Objektträger und decken Sie diese vorsichtig ab. Entfernen Sie zufällig entstandene Luftblasen durch sanften Druck auf das Deckglas und versiegeln Sie die Deckgläser am Rand mit Kautschukzement. Anschließend die Objektträger über Nacht in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius stellen. Am nächsten Tag den Gummizement und den Deckgläser vom Objektträger entfernen. Die Objektträger zwei Minuten lang in Prewarm-Lösung bei 73 Grad Celsius waschen, gefolgt von fünf Minuten in Lösung zwei bei Raumtemperatur.Färben Sie die Objektträger mit Yo-Yo-Eins in einer dunklen Kammer bei Raumtemperatur nach. Schließlich montieren Sie die Chromosomen in einer kleinen Menge verlängerten Gold-Antifa-Reagenz mit einem Deckglas und analysieren die Präparationen mittels FISH mit einer I-G-S-R-D-N-A-Sonde. Behandeln Sie die Chromosomenpräparation vorab mit einer RNA-Lösung. Fügen Sie nicht die repetitiven DNA-Fraktionen hinzu und denaturieren Sie die Chromosomenpräparation und eine Sonde nicht gleichzeitig. FISH wurde an den Mitosechromosomen von Aedes aegypti unter Verwendung von Rückklon-DNA-Sonden durchgeführt. Die Chromosomen werden mit YOYO-1-Iodid gegengefärbt.Zum Vergleich wurde FISH mit Back-Clone-DNA-Sonden ebenfalls an den mitotischen Chromosomen von Oryzias latipes durchgeführt. Schließlich FISH mit einer I-G-S-R-D-N.Es wurde eine Sonde an den Mitosechromosomen von Anomalien, Gambier, nach deren Entwicklung durchgeführt. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Ologie den Weg, Chromosomen zu untersuchen und die Genomkartierung bei verschiedenen Mückenarten und anderen Insekten voranzutreiben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Zeitliche und räumliche Genexpressionsanalysen spielen eine entscheidende Rolle in der funktionellen Genomik.

Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Der Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektor-Mücken

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Chromosomenmalerei ist eine nützliche Methode, um die Organisation des Zellkerns und die Evolution des Karyotyps zu untersuchen. Hier zeigen wir einen Ansatz zur Isolierung und Verstärkung bestimmter Interessenbereiche von einzelnen Polytenchromosomen, die anschließend  für die zwei- und dreidimensionale Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet werden.

2D und 3D Chromosom Malerei in Malaria-Mücken

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Durchführung einer Fluoreszenz-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH) vor, um sich wiederholende heterochromatische Sequenzen auf Objektträger-montierten Chromosomen zu visualisieren. Die Methode benötigt nur minimale Reagenzien und ist vielseitig einsetzbar für kurze oder lange Sonden, verschiedene Gewebe und den Nachweis mit Fluoreszenz- oder nicht-fluoreszenzbasierten Signalen.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

Aufgrund ihrer einfachen Anatomie bieten Anopheles-Hoden ein gutes zytologisches Modell für die Untersuchung der Spermatogenese. Dieses Protokoll beschreibt die Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung , eine Technik, die zur Untersuchung dieses biologischen Prozesses verwendet wird, sowie den Phänotyp transgener Stämme, die Mutationen in den Genen aufweisen, die an der Spermienproduktion beteiligt sind.

Ganzkörper-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Untersuchung der Spermatogenese in der Anopheles-Mücke

Der Artikel beschreibt die Methoden und Reagenzien, die notwendig sind, um eine Hybridisierungskettenreaktion, RNA-Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) durchzuführen, um Einblicke in die räumliche und zelluläre Auflösung von chemosensorischen Rezeptorgenen in der Moskitoantenne und im Oberkieferpalp zu erhalten.

Hybridisierung Kettenreaktion RNA Whole-Mount Fluoreszenz in situ Hybridisierung von chemosensorischen Genen in Riechanhängen von Mücken

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung...

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Eine neuartige High-Throughput-Verfahren beschrieben, die ermöglicht den Nachweis und die relative Quantifizierung von kleinen RNA-und mRNA-Expression von einzelnen Bakterienzellen Verwendung gesperrt Nukleinsäure-Sonden und...

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Ein auf lebenden Zellen basierendes Verfahren zur Beleuchtung von zellulären Vakuolen (Einschlüssen), die Chlamydien enthalten, wird beschrieben. Diese Strategie ermöglicht eine schnelle, automatisierte Bestimmung der Infektiosität von Chlamydien in Proben und kann zur quantitativen Untersuchung der Wachstumsdynamik des Einschlusses verwendet werden.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

Lernen Sie FISH zur Chromosomenkartierung bei Mücken. Diese Methode nutzt Imaginalscheiben von Larven, um hochwertige mitotische Chromosomenpräparate für Anopheles, Aedes und Culex zu erhalten.

Fluoreszierend

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