Name: Appétitive apprentissage olfactif associatif en Drosophila Les larves (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Découvrez l'apprentissage olfactif associatif appétitif chez les larves de Drosophila melanogaster. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes neuronaux de la mémoire et du conditionnement.

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Nous tenons particulièrement à remercier les membres du laboratoire Gerber pour obtenir des instructions techniques sur leur dispositif expérimental et commentaires sur le manuscrit. Nous remercions également Lyubov Pankevych pour les soins et l&#39;entretien de la mouche du type cantons stock sauvage. Ce travail est soutenu par la DFG TH1584/1-1 subvention, la subvention SNF 31003A_132812 / 1 et le Zukunftskolleg de l&#39;Université de Konstanz (tout à AST).

1. Préparation <ol><li> Drosophile de type sauvage larves sont élevées à 25 ° C et 60% -80% d&#39;humidité dans un cycle de 14/10 lumière / obscurité. Pour le contrôle de l&#39;âge exact des larves toujours 20 femelles sont mises avec 10 hommes dans un flacon (6 cm de hauteur et 2,5 cm de diamètre) qui comprend environ 6 ml de nourriture volée standard. Les mouches sont autorisés à pondre des œufs pendant 12 heures et sont transférés dans un nouveau flacon, le deuxième jour. 5-6 jours après la ponte des larves atteignent le stade d&#39;alimentation 3 ème étape si élevée à 25 ° C et peut maintenant être utilisé pour l&#39;expérience comportementale. Cependant, il faut s&#39;assurer de ne prendre larves qui en sont encore à la nourriture et non les larves de la paroi du flacon. Ces larves ont déjà atteint «l&#39;errance 3 e stade larvaire scène» - peu de temps avant la nymphose - et leur utilisation complique l&#39;interprétation des résultats. </li><li> Préparation de 2,5% des boîtes de Pétri d&#39;agarose (d&#39;autres laboratoires utilisent également des concentrations de gélose de 1% tout au long de l&#39;expérience, commentconcentrations de plus en plus faibles peuvent permettre l&#39;alimentation 3 e stade larvaire de creuser dans le substrat): Dissoudre 2,5 g d&#39;agarose dans 100 ml ddH O. 2 Chauffer la solution dans un four micro-ondes jusqu&#39;à ce qu&#39;il commence à bouillir. Soigneusement agiter la solution et le remettre au micro-ondes jusqu&#39;à ce que tous agarose est dissous. Verser la solution d&#39;agarose à chaud dans des boîtes de Pétri de telle sorte que le fond des boîtes de Pétri est complètement recouvert de la solution d&#39;agarose et forme une surface lisse. Laisser la solution refroidir à température ambiante puis fermez le couvercle. Ne pas fermer immédiatement les couvercles, car elle permettrait de condensation de l&#39;eau sur les couvercles. </li><li> Préparation des boîtes de Petri 2M fructose: Dissoudre 2,5 g d&#39;agarose dans 100 ml ddH O 2 (là encore, l&#39;utilisation de la concentration de 1% de gélose est possible, mais il peut permettre d&#39;alimenter 3 e stade larvaire de creuser dans le substrat). Chauffer la solution dans un four micro-ondes jusqu&#39;à ce qu&#39;il commence à bouillir. Soigneusement agiter la solution et le remettre dans le microondes jusqu&#39;à ce que tous agarose est dissous. Ajouter avec précaution 35 g de fructose dans la solution chaude, lentement agiter le mélange jusqu&#39;à ce que le sucre soit dissous afin d&#39;éviter un retard d&#39;ébullition. Verser le fructose-agarose chaud solution dans des boîtes de Pétri telle que le fond est complètement recouverte et la solution de fructose-agarose forme une surface lisse. Laisser la solution refroidir à température ambiante puis fermez le couvercle. Ne pas fermer immédiatement les couvercles, car elle permettrait de condensation de l&#39;eau sur les couvercles. </li><li> Préparation du 1-octanol conteneurs odeurs (OCT): Remplir 10 ul de pur PTOM dans un récipient fait sur commande d&#39;odeur téflon et le fermer avec un couvercle qui a plusieurs petits trous pour permettre l&#39;évaporation de l&#39;odeur. Une description détaillée des conteneurs est donnée dans Gerber et Stocker 2007. Préparer trois récipients d&#39;odeurs pour octobre Conteneurs odeur permettre l&#39;évaporation des produits chimiques introduits, mais il faut éviter que les larves de pouvoir les contacter directement. Ainsi, les expériences ici décrites de façon spécifiqueaborder l&#39;apprentissage olfactif chez les larves sans perturber les effets secondaires gustatives. </li><li> Préparation des conteneurs amyle odeurs (AM): Diluer AM 1:50 dans l&#39;huile de paraffine. Remplir 10 ul de la dilution dans un récipient fabriqué sur mesure odeur téflon et le fermer avec un couvercle qui a plusieurs petits trous pour permettre l&#39;évaporation de l&#39;odeur. Préparer trois récipients d&#39;odeurs pour AM. La dilution est important pour des raisons pratiques, à savoir éviter une forte préférence pour l&#39;un sur l&#39;autre odeur qui peut masquer un changement d&#39;apprentissage en fonction de la préférence relative entre les deux odeurs. L&#39;attrait égal pour les deux odeurs peuvent avoir besoin d&#39;être confirmée par le laboratoire avant l&#39;expérience en appliquant le test décrit ci-après (2.5) avec des animaux naïfs. L&#39;valeurs présentées ici sont basées sur plusieurs publications du laboratoire Gerber qui ont récemment été reproduites par notre laboratoire 9,15,16. </li><li> L&#39;étiquetage des boîtes de Pétri: Avant les expériences comportementales tous les boîtes de Petri doivent être codés. Cela signifie quefructose contenant des boîtes de Petri doivent être marquées par exemple par un &quot;X&quot; ou un &quot;A&quot; et d&#39;agarose seulement des boîtes de Pétri avec un «Y» ou un «B». Ce code doit être révélé à l&#39;expérimentateur que lorsque toutes les données ont été enregistrées. En effectuant des expériences «à l&#39;aveugle», il n&#39;est donc pas possible que les attentes de l&#39;expérimentateur peuvent affecter la performance des larves. Pour faciliter la compréhension de la vaste lectorat dans ce qui suit, nous ne parlerons que les odeurs comme stimuli conditionnés (CS1 ou CS2) qui sont soit récompensés lorsqu&#39;ils sont présentés sur un plat de Pétri fructose (+) ou non récompensés lorsqu&#39;ils sont présentés sur une seule agarose boîte de Pétri (-). </li></ol> 2. Formation Récompense de sucre et d&#39;essai <ol><li> Recueillir 30 d&#39;alimentation 3 e stade larvaire d&#39;un flacon de nourriture. Les transférer dans un premier plat de Pétri contenant quelques gouttes de l&#39;eau du robinet et soigneusement les déplacer vers l&#39;avant et vers l&#39;arrière avec une brosse. De les transférer vers un second plat de Pétri qui contient également quelques gouttes d&#39;eau du robinet water pour vérifier qu&#39;aucune pâte alimentaire reste sur le tégument de la larve, sinon les larves pourront faire l&#39;expérience de l&#39;odeur de nourriture pendant l&#39;expérience. Ce serait probablement obscurcir le processus d&#39;apprentissage et leur performance dans la situation de test. </li><li> Formation: Former les larves aux odeurs associés avec une queue de sucre appétitive le régime suivant est appliqué. Mettez un récipient odeur PTOM sur le côté gauche et droit d&#39;un &quot;X&quot; marqué - ainsi, récompense contenant du fructose (+) boîte de Pétri («aveugle» expérience, pour plus de détails voir paragraphe 1.6). Mettez le groupe de 30 larves se nourrissent 3 e stade larvaire sur le milieu de la boîte de Pétri, fermez le couvercle et attendez 5 min, tandis que les animaux sont exposés à octobre Assurez-vous que les larves ne sont pas piégés à l&#39;intérieur de la goutte d&#39;eau et peut surmonter la tension superficielle de celui-ci. Par ce que les larves peuvent se déplacer librement sur la boîte de Pétri et l&#39;expérience de stimuli olfactifs et / ou gustatif. </li><li> Formation: Retirer les larves de la boîte de Pétri avec un pinceau imbibé et de transférer lem sur un deuxième plat de Pétri qui est marqué avec un &quot;Y&quot; - donc, l&#39;agarose seulement (-) boîte de Pétri contenant - et a une odeur AM conteneur situé sur le côté gauche et à droite. Fermez le couvercle et attendez 5 min, tandis que les animaux sont exposés à AM. </li><li> Formation: Répétez 2.2) et 2.3) deux fois, de sorte que tous les 30 cycles expérience larves formation de trois: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). Dans cette expérience représente CS1 CS2 PTOM et codes pour AM. </li><li> Test: un endroit AM et d&#39;une odeur contenant les PTOM sur les sites opposées d&#39;un plat d&#39;agarose seule Petri. Transférez les animaux dressés au milieu du plat de Pétri de test. Fermez le couvercle et attendre 5 min. Par la suite compter le nombre de larves sur le côté gauche, le côté centre et à droite de la boîte de Petri de test. </li><li> Répétez les étapes 2.1) à 2,5) avec un second groupe de 30 larves se nourrissent 3 e stade larvaire, mais inverser les rôles expérimentales de AM et PTOM tels que les animaux reçoivent la formation suivante: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). Dans cette expérience représente CS1 CS2 PTOM et codes pour AM. </li><li> Arrangements possibles pour la formation. Ci-dessus, nous présentons une formation qui existe de trois essais de formation de deux OCT / (+) - Radio AM / (-) ou dans le groupe de réciprocité aussi trois essais de formation de AM / (+) - OCT / (-). Cependant, pour éviter les effets de séquence à charge lors de la formation, il est important de varier l&#39;ordre des stimuli répétitions suivantes de l&#39;expérience complète. En faisant varier la commande CS1 ou CS2 et également la présentation de récompense dans la première plaque ou la seconde présentés, quatre séquences différentes pour les essais d&#39;entraînement sont possibles: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Premier groupe </td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td><td> Réciproque groupe </td><td> CS2 / (+) - CS1 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (+) - CS2 / (-) </td><td></td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td></tr></tbody></table> Pour prévenir les effets systématiques des stimuli de l&#39;environnement expérimental, il faut effectuer le test dans la moitié des cas, que l&#39;OCT est présentée sur la gauche et vers la droite AM. Dans l&#39;autre moitié des cas AM doivent être présentées sur la gauche et les PTOM sur la droite. 3. Les tests pour les tâches pertinentes sensori-moteur Facultés La conception des expériences décrites ci-dessus permet d&#39;analyser les odeurs de sucre dans l&#39;apprentissage de type sauvage alimentation 3 e stade larvaire sur ses propres. Cependant, dans la vie quotidienne des chercheurs de laboratoire utilisent généralement deux ou plusieurs groupes expérimentaux de larves de comparer, si l&#39;apprentissage olfactif dépend d&#39;un pairgène particulier, un ensemble spécifique de neurones, un stock mutant, un régime alimentaire spécial, différentes conditions d&#39;élevage, les produits chimiques toxiques ajoutés au cours du développement, etc Ainsi, dans tous les cas où deux ou plusieurs groupes expérimentaux de larves sont testés qu&#39;on a à faire un ensemble d&#39;expériences de contrôle obligatoires afin de tester si les différents groupes de larves montrent appropriées sensori-motrices acuité. Cela devient obligatoire phénotypes potentiels ne sont pas nécessairement en raison de capacités réduites ou abolies aux odeurs associés avec le sucre. Au contraire, les éventuels défauts d&#39;apprentissage pourrait être basée sur les défauts à n&#39;importe quelle étape du circuit sensori-motrice dans le traitement des odeurs et / ou de sucre. Ou en d&#39;autres termes, si une larve mutante n&#39;est pas en mesure de sucre sens, il ne peut pas établir une mémoire de sucre. Mais cela ne permet pas de conclure que la larve ne peut pas apprendre. En détail les expériences de contrôle suivantes doivent être effectuées pour tester la bonne PTOM, AM et le traitement des larves de fructose transgénique. 1. Test de naïf octobre préférence Recueillir 30 d&#39;alimentation 3 e stade larvaire d&#39;un flacon de nourriture. Lavez-les soigneusement à l&#39;eau du robinet comme décrit en 2.1. Placez un récipient odeur unique PTOM sur un côté d&#39;un plat de Pétri agarose, ajouter les larves sur le milieu de la boîte de Pétri, fermez le couvercle et attendez 5 min, tels que les larves peuvent ramper sur la boîte de Pétri et les orienter vers les PTOM source de l&#39;odeur. Par la suite compter le nombre de larves sur le côté gauche, au milieu et sur le côté droit de la boîte de Petri de test. 2. Test de préférence naïve AM Recueillir 30 d&#39;alimentation 3 e stade larvaire d&#39;un flacon de nourriture. Lavez-les soigneusement à l&#39;eau du robinet comme décrit en 2.1. Placez un récipient odeur unique AM sur un côté d&#39;un plat de Pétri agarose, ajouter les larves sur le milieu de la boîte de Pétri, fermez le couvercle et attendez 5 min, tels que les larves peuvent ramper sur la boîte de Pétri et les orienter vers l&#39;AM source de l&#39;odeur. Par la suite compter le nombre de larvae sur le côté gauche, au milieu et sur le côté droit de la boîte de Petri de test. 3. Test de préférence sucre naïve Recueillir 30 d&#39;alimentation 3 e stade larvaire d&#39;un flacon de nourriture. Lavez-les soigneusement à l&#39;eau du robinet comme décrit en 2.1. Préparer des boîtes de Pétri contenant 2,5% d&#39;agarose dans une moitié et un fructose 2M-agarose mélange dans l&#39;autre moitié. Ajouter les larves sur la boîte de Pétri, fermez le couvercle et attendez 5 min, tels que les larves peuvent ramper sur la boîte de Pétri et les orienter vers le côté contenant du fructose. Par la suite compter le nombre de larves sur le côté gauche, au milieu et sur le côté droit de la boîte de Petri de test. Préparation des boîtes de Petri moitié-moitié: Préparer normales des plaques d&#39;agarose comme décrit ci-dessus à la section 1.2. Lorsque les boîtes de Pétri remplies d&#39;agarose sont refroidies, coupez soigneusement le agarose sur l&#39;axe vertical avec un scalpel. Enlever une moitié de l&#39;agarose à partir de la boîte de Pétri. Add une chaude fructose solution d&#39;agarose (pour la préparation voir 1.3) à la moitié vide de la boîte de Pétri. Veillez à ce que les deux moitiés de match et ne forment pas un bord défini - cela influe sur le comportement de choix des larves et rend une analyse comportementale plutôt difficile. 4. Sham formation Malgré un examen si l&#39;alimentation transgénique 3 e stade larvaire sont capables de distinguer au niveau du type sauvage entre les PTOM et l&#39;air (3,1), AM et de l&#39;air (3,2) et le sucre et pur agarose (3,3), une série supplémentaire d&#39;expériences de test a récemment été introduit (pour une discussion voir Gerber et Stocker, 2007). La justification de ces expériences est la suivante. Au cours de la formation des larves subissent manipulation massive et successive odeur et le sucre stimulation. Ainsi, il est bien possible que le phénotype observé apprentissage est trompeur (bien que l&#39;odeur naïve et tests de perception de sucre sont à un niveau de type sauvage!). En effet, il est possible que les animaux transgéniques differ de larves de type sauvage en ce qui concerne la résistance au stress, la motivation, la fatigue, l&#39;adaptation sensorielle, apprentissage contextuel, et les changements dans la satiété. Ainsi, Michels et al. (2005) ont introduit des contrôles qui testent si un mutant donné est capable de (1) détecter AM par rapport à un conteneur vide odeur si vous traitez les larves exactement comme lors de la formation, sauf que vous omettez la récompense et simplement exposer à la fois les odeurs; (2) détecter octobre après le même régime; (3) détecter AM par rapport à un conteneur vide odeur, si vous traitez les larves d&#39;une manière semblable à la formation, sauf que vous omettez les odeurs et simplement exposer à la récompense, et (4 ) détecter octobre après le même schéma. Pour une discussion détaillée et de plus amples détails sur les méthodes s&#39;il vous plaît voir Michels et al (2005) et de Gerber et Stocker (2007). 4. Analyse des données pour l&#39;apprentissage Récompense sucre <ol><li> À évaluer les données de protocole de l&#39;apprentissage sucre récompense calculer un indice de préférence octobre (PREF octobre) pour chacun des deux réciment des groupes formés: Pour le premier groupe qui a reçu OCT / (+) - Radio AM / (-) de formation: PREF OCT (OCT + / AM-) = (nombre de larves sur le côté OCT - Nombre de larves sur le côté AM) / # de toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale Pour le second groupe qui a reçu AM / (+) - OCT / (-) de formation: PREF AM (AM + / OCT-) = (nombre de larves sur la bande AM côté - Nombre de larves sur le côté OCT) / # de toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale </li></ol><ol start="2"><li> Calculer un indice de performance (PI) pour les valeurs PREF deux de 4,1). Le PI représente l&#39;apprentissage associatif en annulant les effets perturbateurs de l&#39;odeur et de l&#39;exposition punition, passage du temps et la manipulation: PI = (PREF OCT (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / PTOM)) / 2 Ainsi IP peut varier entre -1 et 1. Des valeurs significativement négatifs représentent aversif d&#39;apprentissage, tandis que les valeurs positives significatives décrire l&#39;apprentissage appétitive. Une expérience complète comprend habituellement de 10 ou plus inhibiteurs de protéase. Les données sont visualisées comme boîte de parcelles including toutes les valeurs d&#39;un groupe expérimental donné. 50% des valeurs se trouvant à l&#39;intérieur de la boîte, l&#39;indice de performance médiane est indiquée en trait gras à l&#39;intérieur de la boîte à moustaches. </li></ol> 5. Analyse des données pertinentes pour la tâche-sensori-moteur Facultés <ol><li> Pour évaluer les données lors du test de bon traitement de l&#39;odeur octobre calculer un indice d&#39;odeur octobre préférence comme suit: Odeur PREF OCT = (nombre de larves sur le côté OCT - Nombre de larves de l&#39;autre côté) / # de toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale </li><li> Pour évaluer les données lors du test de bonne perception des odeurs AM calculer un indice AM préférence odeur comme suit: Odeur PREF AM = (nombre de larves sur la bande AM côté - Nombre de larves de l&#39;autre côté) / # de toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale </li><li> Pour évaluer les données lors du test de perception du fructose bonne calculer un indice de préférence le fructose comme suit: PREF fructose = (nombre de larves sur le côté fructose - Nombre de larves de l&#39;autre côté) / # De toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale </li><li> Détails sur le simulacre de formation sont donnés dans Michels et al. 2005. </li></ol>

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<li>Michels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+site+and+molecular+mode+of+synapsin+action+in+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning.</a> Learn Mem. 18, 332-344 (2011).</li>
<li>Saumweber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+synaptic+plasticity+are+impaired+upon+lack+of+the+synaptic+protein+SAP47%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47.</a> J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186, 735-755 (2010).</li>
<li>Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+TRP+channels+are+required+for+warm+and+cool+avoidance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

<html> La configuration décrite dans les larves de drosophile permet d&#39;enquêter sur l&#39;apprentissage olfactif associatif au sein d&#39;un cerveau comparable élémentaire. L&#39;approche est simple, pas cher, facile à mettre en place dans un laboratoire et ne nécessite pas de matériel de haute technologie 9. Nous présentons une version de l&#39;expérience, d&#39;étudier appétitive apprentissage associatif renforcé par la récompense fructose 11. La configuration décrite est basée sur un...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Numéro CAS </td></tr><tr><td> Fructose </td><td> Sigma </td><td> 47740 </td><td> 57-48-7 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71350 </td><td> 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td> 9012-36-6 </td></tr><tr><td> 1-octanol </td><td> Sigma </td><td> 12012 </td><td> 111-87-5 </td></tr><tr><td> Amyle </td><td> Sigma </td><td> 46022 </td><td> 628-63-7 </td></tr><tr><td> Pétrole </td><td> Sigma </td><td> 18512 </td><td> 8012-95-1 </td></tr></tbody></table>

appétitive apprentissage olfactif associatif en<em&gt; drosophila</em&gt; les larves

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Dans ce qui suit, nous décrivons les détails méthodologiques de l&#39;apprentissage olfactif associatif appétit chez les larves de drosophile. L&#39;installation, en association avec d&#39;interférence génétique, fournit une poignée d&#39;analyser les bases neuronales et moléculaire de l&#39;apprentissage associatif spécifiquement à une réflexion simple larvaire. Les organismes peuvent utiliser l&#39;expérience passée pour ajuster le comportement présent. Une telle acquisition du potentiel de comportement peut être définie comme l&#39;apprentissage et les bases physiques de ces potentiels que les traces mnésiques 1-4. Les neuroscientifiques essayer de comprendre comment ces processus sont organisés en fonction des changements moléculaires et neuronale dans le cerveau en utilisant une variété de méthodes dans des organismes modèles, allant des insectes aux vertébrés 5,6. Pour ces efforts, il est utile d&#39;utiliser des systèmes modèles simples et accessibles expérimentalement. La larve Drosophila s&#39;est avéré répondre à ces exigences fondées surla disponibilité de solides analyses comportementales, l&#39;existence d&#39;une variété de techniques transgéniques et l&#39;organisation élémentaire du système nerveux comprenant seulement environ 10.000 neurones (quoique avec quelques concessions: limitations cognitives, comportementales, peu d&#39;options et de la richesse de l&#39;expérience douteuse) 7-10 . Larves de drosophile peuvent créer des associations entre les odeurs et appétitive renforcement gustative comme le sucre 11-14. Dans un essai standard, mis en place dans le laboratoire de B. Gerber, les animaux reçoivent une formation de deux odeurs réciproque: Un premier groupe de larves est exposé à une odeur A avec un renforçateur gustative (récompense sucre) et est ensuite exposé à une odeur B sans armature 9. Pendant ce temps un deuxième groupe de larves reçoit une formation réciproque tout en éprouvant une odeur sans armature et étant ensuite exposée à odeurs B avec renforcement (récompense sucre). Dans ce qui suit les deux groupes sont tested pour leur préférence entre les deux odeurs. Préférences relativement plus élevés pour l&#39;odeur récompensés reflètent l&#39;apprentissage associatif - présenté comme un indice de performance (PI). La conclusion quant à la nature associative de l&#39;indice de performance est convaincante, car en dehors de la contingence entre les odeurs et sapides, d&#39;autres paramètres, tels que l&#39;odeur et l&#39;exposition de récompense, le passage du temps et de manipulation ne diffèrent pas entre les deux groupes 9.

La figure 1A montre une vue d&#39;ensemble des procédures expérimentales pour des larves apprentissage associatif olfactif. En couplant une des deux odeurs présentées avec une récompense larves sucre acquérir le comportement potentiel d&#39;exprimer une réponse intéressante à l&#39;odeur récompensés par rapport à l&#39;odeur récompense. Deux groupes de larves sont toujours formés soit par l&#39;appariement du renfort de l&#39;odeur ou du PTOM AM. L&#39;indice de performance (PI) mesure la fonction assoc...

Larves de drosophile sont capables de s&#39;associer avec des stimuli odeur récompense gustative. Nous décrivons ici un paradigme simple de comportement qui permet l&#39;analyse de l&#39;apprentissage olfactif associatif appétitive.

Appétitive apprentissage olfactif associatif en<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

Nous décrivons ci-après les détails méthodologiques de l'apprentissage olfactif associatif appétitif chez les larves de Drosophila. Le dispositif, associé à ...

L'objectif de cette procédure est d'analyser les fonctions cérébrales supérieures. Dans un modèle simple, la larve DFA par l'intermédiaire de l'appétit, l'apprentissage olfactif associatif. Ceci est réalisé en premier lieu en collectant 30 larves de troisième stade alimentées à partir d'un flacon de milieu nutritif.Ensuite, les larves sont entraînées pendant cinq minutes dans une boîte de Pétri avec du fructose comme récompense et un récipient à odeur de chaque côté contenant un octanol comme stimulus olfactif. Puis une deuxième phase d'entraînement de cinq minutes est réalisée sur une boîte sans récompense de fructose et avec des récipients à odeur de chaque côté contenant de l'acétate d'amyle. Après trois répétitions des deux phases d'entraînement, les larves sont exposées à des récipients à odeur placés de part et d'autre pendant un test de cinq minutes sans récompense.En fin de compte, la préférence olfactive relative d'un octal par rapport à l'acétate d'Amal indique que les larves de drosophile peuvent établir une association entre des stimuli olfactifs et une récompense sucrée, ce qui peut être utilisé pour étudier l'apprentissage associatif dans un système génétiquement modulable. Cette méthode, combinée à une interférence génétique de la fonction neuronale, peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'apprentissage et de la mémoire, telles que : quelles sont les neurones qui signalent la récompense, ou quelles sont les neurones nécessaires ou suffisants pour l'acquisition ou la récupération d'une mémoire répétitive ? La procédure sera démontrée par anti a postop.Un étudiant au doctorat de mon laboratoire commence d'abord par préparer des boîtes de Petri contenant 2,5 % d'aros sans fructose. Pour préparer les boîtes contenant de la fructose, ajouter la fructose aux aros dissous, puis verser le mélange dans la boîte. Ensuite, étiqueter chacune de ces boîtes avec un symbole différent, afin d'aveugler l'expérimentateur.Le plat contenant le fructose constitue la récompense conditionnante, tandis que le plat ordinaire représente l'absence de récompense. Pour les stimuli conditionnés, préparez au total trois récipients d'odeur en téflon personnalisés contenant chacun 10 microlitres d'octanol pur. Les couvercles possèdent de petits trous permettant l'évaporation de l'odeur.Deuxièmement, préparez trois autres récipients à odeur contenant chacun 10 microlitres d'acétate d'amyle dilué au un cinquante dans de l'huile de paraffine. Cette dilution est aussi attractive que les 10 microlitres d'acétate d'amyle pur. Commencez par collecter 30 mouches, les nourrir, sans qu'elles errent. Troisièmement, retirez-les d'un flacon de nourriture.Ce protocole peut être réalisé à tout moment de la journée. Il est indépendant des rythmes circadiens. Transférez la lave dans une boîte de Pétri contenant quelques gouttes d’eau du robinet et déplacez-la doucement vers l’avant et vers l’arrière à l’aide d’un pinceau.Ensuite, transférez les larves dans une deuxième boîte de Pétri qui contient également quelques gouttes d'eau du robinet. Examinez les larves pour détecter la présence de pâte alimentaire sur leurs parois corporelles. Placez maintenant la boîte de Pétri dans le dispositif expérimental afin d'entraîner les larves à associer des odeurs à une source spécifique de sucre.Placez un récipient à odeur sur le côté gauche et sur le côté droit de l'un des deux types de boîte utilisés pour les stimuli. Voici un exemple octal, mais le choix est arbitraire puisque l'expérimentateur est aveugle quant à la récompense. Ensuite, déposez le groupe de larves de thi au centre de la boîte.Fermez le couvercle et attendez cinq minutes pendant que les animaux sont exposés aux stimuli. Assurez-vous que les larves peuvent surmonter la tension superficielle de la goutte d'eau afin qu'elles ne soient pas piégées et puissent explorer librement. Placez un nouveau récipient contenant de l'acétate d'Amal sur une boîte de Pétri propre.Après cinq minutes, utilisez un pinceau humide pour transférer la lave vers le type de boîte opposé, avec les stimuli opposés situés sur ses côtés gauche et droit. Ici, l'odeur est l'acétate d'amyle. Une fois les larves transférées, fermez le couvercle et laissez les animaux explorer pendant cinq minutes.Lorsque ce délai est écoulé, le premier cycle d'entraînement est terminé. Effectuez deux cycles supplémentaires d'entraînement de la même manière que le premier. Transférez les animaux à l’aide d’un pinceau humide et exposez-les à chaque combinaison de stimulus et de récompense trois fois au total.Pour le lieu du test expérimental, placez des récipients frais contenant l'odeur, un pour chaque stimulus, sur des côtés opposés d'une boîte de Pétri en agrose non revêtue. Transférez les animaux entraînés au centre de la boîte. Fermez le couvercle et attendez cinq minutes.Après cinq minutes, utilisez un gabarit placé sous la boîte qui définit clairement trois zones — gauche, droite et centrale — et comptez le nombre de larves dans chaque zone. La zone centrale correspond à un score de non-préférence et rend l'analyse plus restrictive et moins sujette à biais. Enfin, pour terminer l'expérience, sélectionnez 30 nouvelles larves en troisième stade larvaire alimentées et répétez l'entraînement et le test avec la combinaison opposée de récompense et de stimuli.Continuer à utiliser les mêmes récipients à odeur. Plusieurs tests témoins sont nécessaires pour déterminer si les animaux transgéniques présentent un traitement normal des odorants pour les stimuli récompense. Le test de préférence olfactive naïve commence par la collecte et le lavage de 30 larves, comme effectué pour l'entraînement et le test.Ensuite, déposez les larves sur une boîte de Pétri Agro Rose contenant un seul flacon de stimulus d'un côté. Fermez le couvercle et attendez cinq minutes. Puis, à l'aide du gabarit, comptez le nombre de larves situées du côté proche, au milieu et du côté éloigné de la boîte par rapport au stimulus.Réalisez ce test pour chaque stimulus utilisé dans l'expérience afin d'évaluer la préférence innée pour le sucre. Préparez des boîtes de Pétri coupées en deux en retirant la moitié de l'agar d'une boîte ronde et en remplissant l'espace vide avec de l'agar fondu de l'autre type. Veillez attentivement à ce que les deux moitiés aient le même volume et ne forment pas de bordure bien définie.Cela peut nécessiter de la pratique avec la demi-pétri préparée et à température ambiante, placée 30 minutes, nettoyée après l'alimentation. Placer un troisième stade larvaire au centre de la boîte. Fermer le couvercle et attendre cinq minutes.Ensuite, à l'aide du modèle, comptez le nombre de larves de chaque côté ainsi que celles situées au centre. La procédure décrite a été utilisée pour entraîner et tester les larves trenchgéniques. À l'aide des stimuli exemples, les données ont été recueillies sous forme du nombre de larves présentes dans différentes régions des boîtes de Pétri.Après cinq minutes hors de cette préférence de données, les indices ont été calculés et les indices de performance ont été dérivés des groupes entraînés de manière réciproque. Étant donné que les larves testées étaient transgéniques, un choix entre un récipient odorant rempli et de l'air a également été proposé, ainsi qu'un choix entre des arômes purs et des arômes additionnés de sucre. Un examen des indices calculés dans un diagramme en boîte a révélé que les animaux étaient capables d'apprendre à distinguer un octanol de l'acétate de méthyle en utilisant des arômes au fructose comme renforçateur appétitif.Les animaux ont reconnu les deux stimuli comme attractants et ont montré une préférence innée pour les arômes de fructose par rapport à l'aéro. Ce paradigme expérimental a été utilisé avec succès avec une grande variété de stimuli olfactifs et visuels, ainsi qu'avec de nombreux stimuli récompensants et aversifs. Ce paradigme, combiné aux nombreuses manipulations génétiques puissantes disponibles chez Drosophila, est particulièrement utile pour analyser les réseaux neuronaux ; par exemple, en modifiant génétiquement des ensembles spécifiques de neurones définis par des patrons d'expression de Gal4, on peut évaluer les rôles fonctionnels de ces neurones dans l'apprentissage de l'appétit.En suivant cette procédure, associée à une interférence génétique de la fonction neuronale, il est possible d'analyser les réseaux neuronaux du cerveau larvaire impliqués dans l'apprentissage et la mémoire. En raison de la simplicité du cerveau larvaire, cela peut être réalisé jusqu'au niveau de la cellule unique.

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