Name: Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in Drosophila Le larve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara l'apprendimento associativo olfattivo appetitivo nelle larve di Drosophila utilizzando fruttosio come ricompensa gustativa. Questo metodo permette di studiare i meccanismi neurali della memoria e dell'apprendimento.

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Vogliamo in particolare ringraziare i membri del laboratorio di Gerber per le istruzioni tecniche per la loro impostazione sperimentale e commenti sul manoscritto. Ringraziamo anche Lyubov Pankevych per la cura della mosca e la manutenzione del parco selvaggio Cantoni tipo. Questo lavoro è supportato dalla concessione DFG TH1584/1-1, la concessione SNF 31003A_132812 / 1 e la Zukunftskolleg dell&#39;Università di Costanza (tutti a AST).

1. Preparazione <ol><li> Drosophila wild-type larve vengono sollevate a 25 ° C e 60% ​​-80% di umidità in un ciclo di 14/10 chiaro / scuro. Per controllare l&#39;età esatta delle larve sempre 20 femmine sono messi con 10 maschi in un flaconcino (6 cm di altezza e 2,5 cm di diametro) che include circa 6 ml di cibo mosca standard. Le mosche possono deporre le uova per 12 ore e sono trasferiti in un nuovo flaconcino il secondo giorno. 5-6 giorni dopo la deposizione delle uova larve raggiungere l&#39;alimentazione 3 ° fase instar se sollevato a 25 ° C e può essere utilizzata per l&#39;esperimento comportamentale. Tuttavia, si deve assicurare prendere solo larve che sono ancora in cibo non e le larve dal lato del flaconcino. Queste larve hanno già raggiunto il &quot;vagabondaggio 3 ° fase instar&quot; - poco prima impupamento - e il loro impiego complica l&#39;interpretazione dei risultati. </li><li> Preparazione del 2,5% agarosio capsule di Petri (altri laboratori utilizzare anche le concentrazioni di agar all&#39;1% per tutto l&#39;esperimento, comeconcentrazioni sempre più basse possono consentire l&#39;alimentazione 3 ° larve instar a scavare nel substrato): Sciogliere 2,5 g di agarosio in 100 ml di DDH 2 O. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire. Agitare con cura la soluzione e rimetterlo nel forno a microonde fino a quando tutti agarosio è sciolto. Versare la soluzione calda di agarosio in piastre Petri tali che il fondo delle piastre di Petri è completamente coperto e la soluzione di agarosio forma una superficie liscia. Lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e chiudere i coperchi. Non immediatamente chiudere i coperchi, perché consentirebbe per la condensazione di acqua ai coperchi. </li><li> Preparazione di 2M fruttosio piastre di Petri: sciogliere 2,5 g di agarosio in 100 ml di DDH 2 O (ancora una volta, l&#39;uso della concentrazione di agar 1% è possibile, ma può autorizzare l&#39;alimentazione 3 ° larve instar a scavare nel substrato). Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire. Agitare con cura la soluzione e rimetterlo nella microonda finché tutto agarosio è sciolto. Aggiungere con cautela 35 g di fruttosio nella soluzione calda, lentamente agitare la miscela fino a quando lo zucchero è sciolto per evitare ritardo ebollizione. Versare il fruttosio hot-agarosio soluzione in piastre Petri tali che il fondo è completamente coperto e il fruttosio-agarosio soluzione forma una superficie liscia. Lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e chiudere i coperchi. Non immediatamente chiudere i coperchi, perché consentirebbe per la condensazione di acqua ai coperchi. </li><li> Preparazione di 1-ottanolo (OCT) contenitori odore: riempire 10 ml di puro ottobre in un contenitore su misura odore teflon e chiudere con un coperchio che ha diversi piccoli fori per consentire l&#39;evaporazione dell&#39;odore. Una descrizione dettagliata dei contenitori viene dato in Gerber e Stocker 2007. Preparare tre contenitori odore di ottobre Contenitori odore consentire l&#39;evaporazione delle sostanze chimiche inseriti, ma evitare che le larve possono contattare direttamente loro. Pertanto, gli esperimenti qui descritti specificamenteaffrontare l&#39;apprendimento olfattivo nelle larve senza perturbare effetti collaterali gustative. </li><li> Preparazione di Amilacetato (AM) contenitori odore: Diluire AM 1:50 in olio di paraffina. Riempire 10 ml di diluizione in un contenitore personalizzato fatto odore Teflon e chiudere con un coperchio che ha diversi piccoli fori per consentire l&#39;evaporazione dell&#39;odore. Preparare tre contenitori odore per AM. La diluizione è importante per ragioni pratiche, ossia evitare una forte preferenza per uno sopra l&#39;altro odore che può mascherare un apprendimento dipendente dalla variazione nella preferenza relativa tra i due odori. L&#39;attrazione uguale per entrambi gli odori possono devono essere confermati in laboratorio prima che l&#39;esperimento applicando il test in seguito descritto (2.5) con gli animali naïve. Il valori qui presentati si basano su varie pubblicazioni del laboratorio di Gerber che sono stati recentemente riprodotti dal nostro laboratorio 9,15,16. </li><li> Etichettatura delle piastre di Petri: prima gli esperimenti comportamentali tutte le piastre di Petri devono essere codificati. Ciò significa chefruttosio contenente piastre di Petri devono essere contrassegnati, ad esempio con una &quot;X&quot; oppure un &quot;A&quot; e agarosio solo piastre di Petri con una &quot;Y&quot; o &quot;B&quot;. Questo codice deve essere rivelato al sperimentatore solo dopo che tutti i dati siano stati registrati. Eseguendo gli esperimenti &quot;cieco&quot; non è dunque possibile che le aspettative del sperimentatore può influire sulle prestazioni delle larve. Per facilitare la comprensione per i lettori ampio seguito si parla solo gli odori come stimoli condizionati (CS1 e CS2), che siano ricompensati quando viene presentato su un piatto Petri fruttosio (+) o non-premiata quando ha presentato su un solo agarosio Petri (-). </li></ol> 2. Zucchero Training Ricompensa e Test <ol><li> Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Trasferirli ad un primo piatto Petri contenente alcune gocce di acqua di rubinetto e con cura muoversi avanti e indietro con un pennello. Trasferimento ad un secondo piatto di Petri che contiene anche alcune gocce di rubinetto water per controllare che non pasta alimentare rimane sul bodywall delle larve, altrimenti le larve sarebbe in grado di provare l&#39;odore cibo durante l&#39;esperimento. Ciò probabilmente oscurare il processo di apprendimento e le loro prestazioni in situazione di test. </li><li> Formazione: Formare larve di odori associati con una stecca di zucchero appetitivo il seguente regime viene applicato. Posizionare un contenitore odore ottobre sul lato sinistro e destro di una &quot;X&quot; segnato - in tal modo, ricompensa contenente fruttosio (+) Petri (esperimento &quot;cieca&quot;, per i dettagli vedere 1.6). Posizionare il gruppo di alimentazione 30 3 rd larve instar sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere 5 min, mentre gli animali sono esposti a ottobre Assicurarsi che le larve non sono intrappolati all&#39;interno della goccia d&#39;acqua e può superare la tensione superficiale di esso. Con che le larve possono muoversi liberamente sulla piastra di Petri e sperimentare stimoli olfattivi e / o gustativa. </li><li> Formazione: Rimuovere le larve dalla piastra di Petri con un pennello inumidito e trasferire ilm su un secondo piatto Petri che è etichettato con una &quot;Y&quot; - quindi, solo agarosio (-) contenente piastra Petri - e ha un contenitore AM odore situato sul lato sinistro e destro. Chiudere il coperchio e attendere 5 min, mentre gli animali sono esposti a AM. </li><li> Formazione: Ripeti 2.2) e 2.3) per due volte, in modo tale che tutte le larve di 30 Esperienza tre cicli di formazione: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). In questo esperimento rappresenta ottobre CS1 e CS2 codici per AM. </li><li> Test: Un posto AM e un contenitore odore ottobre sui siti opposti di un agarosio sola piastra di Petri. Trasferire gli animali addestrati al centro del piatto di prova Petri. Chiudere il coperchio ed attendere 5 min. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, il lato destro e centrale del piatto di prova Petri. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.1) a 2.5) con un secondo gruppo di 30 di alimentazione 3 ° larve instar ma scambiare i ruoli sperimentali di AM e PTOM, in modo tale che gli animali ricevano la formazione seguente: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). In questo esperimento rappresenta ottobre CS1 e CS2 codici per AM. </li><li> Modalità possibili per la formazione. Sopra vi presentiamo una formazione che esiste di tre studi di formazione di entrambi OCT / (+) - AM / (-) o nel gruppo di reciproca anche tre prove di formazione di AM / (+) - Ottobre / (-). Tuttavia, per evitare effetti sequenza dipendente durante la formazione è importante variare la sequenza degli stimoli in ripetizioni seguenti dell&#39;esperimento completo. Variando l&#39;ordine CS1 o CS2 e anche la presentazione ricompensa nella prima piastra o secondo presentato, quattro sequenze diverse per i processi di formazione sono possibili: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Primo gruppo </td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td><td> Reciproco gruppo </td><td> CS2 / (+) - CS1 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (+) - CS2 / (-) </td><td></td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td></tr></tbody></table> Per evitare effetti sistematici di stimoli nell&#39;ambiente circostante sperimentale, si dovrebbe effettuare la prova in una metà dei casi che ottobre viene presentato sulla sinistra e sulla destra AM. Nell&#39;altra metà dei casi AM devono essere presentati sulla sinistra e sulla destra ottobre. 3. I test per attività rilevanti per senso-motorie Facoltà La progettazione di esperimenti sopra descritti consente l&#39;analisi di odori zucchero apprendimento nel tipo selvatico alimentazione 3 ° larve instar da solo. Tuttavia, nella vita quotidiana ricercatori laboratorio solito usano due o più differenti gruppi sperimentali di larve di confrontare, se l&#39;apprendimento olfattivo dipende da una pargene colare, un insieme specifico di neuroni, uno stock mutante, una dieta speciale, diverse condizioni di allevamento, prodotti chimici tossici aggiunto durante lo sviluppo, ecc Così, in tutti i casi in cui due o più gruppi sperimentali di larve vengono testati si deve fare una serie di esperimenti di controllo obbligatorie per verificare, se i diversi gruppi di larve mostrano proprie senso-motorie acuità. Questo diventa obbligatorio come fenotipi potenziali non sono necessariamente a causa di capacità ridotta o abolita per gli odori associati con lo zucchero. Piuttosto, i potenziali difetti di apprendimento potrebbe essere basato su difetti in ogni fase del circuito senso-motorio nella lavorazione di odori e / o zucchero. O in altre parole, se una larva mutante non è in grado di zucchero senso, non è possibile stabilire una memoria zucchero. Ma questo non consente di concludere che la larva non può imparare. In particolare i seguenti esperimenti di controllo devono essere fatte per testare il corretto PTOM, AM e la trasformazione di fruttosio di larve transgeniche. 1. Test per ingenuo ottobre preferiscarenza Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Mettere un contenitore odore ottobre su un lato di un piatto Petri agarosio, aggiungere le larve sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso l&#39;ottobre odore sorgente. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri. 2. Test per ingenuo preferenza AM Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Mettere un odore AM contenitore su un lato di un piatto Petri agarosio, aggiungere le larve sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso l&#39;AM odore sorgente. Successivamente contare il numero di larvae sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri. 3. Test per la preferenza zucchero ingenuo Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Preparare piatti Petri contenenti 2,5% agarosio in una metà e una 2M fruttosio-agarosio miscela nell&#39;altra metà. Aggiungere le larve sul piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso il lato contenente fruttosio. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri. Preparazione di mezzo mezzo piastre di Petri: Preparare normali piastre di agarosio come descritto in precedenza nella sezione 1.2. Quando i pieni agarosio piastre Petri sono raffreddati, tagliare l&#39;agarosio lungo l&#39;asse verticale con un bisturi. Rimuovere una metà del agarosio dalla piastra Petri. Ladd un hot-fruttosio agarosio soluzione (per la preparazione cfr 1,3) al mezzo vuoto della piastra Petri. Fare attenzione che entrambe le metà partita e non formano un bordo definito - questo influisce sul comportamento larvale scelta e rende l&#39;analisi del comportamento piuttosto difficile. 4. Sham formazione Nonostante il test se l&#39;alimentazione transgenica 3 ° instar larve sono in grado di distinguere con un livello di selvaggia tra ottobre e aria (3.1), AM e aria (3.2) e lo zucchero e puro agarosio (3.3), un ulteriore set di esperimenti di prova è stato recentemente introdotto (per la discussione cfr. Gerber e Stocker, 2007). Il razionale di questi esperimenti è il seguente. Durante la formazione larve subiscono manipolazione massiccia e odore successive e zucchero stimolazione. Così, è ben possibile che il fenotipo osservato apprendimento è fuorviante (anche se l&#39;odore ingenuo e prove percezione zucchero sono con un livello selvaggio!). Infatti, è possibile che gli animali transgenici differ da larve wild type rispetto alla resistenza allo stress, la motivazione, la fatica, adattamento sensoriale, l&#39;apprendimento contestuale, e cambiamenti di sazietà. Così, Michels et al. (2005) ha introdotto controlli che verificare se un mutante dato è in grado di rilevare (1) AM rispetto a un contenitore vuoto odore se si trattano le larve esattamente come durante l&#39;allenamento, tranne che si omette il premio e solo esporre sia odori, (2) rilevare ottobre dopo che il regime stesso, (3) rilevano AM contro un contenitore vuoto odore, se si trattano le larve in una formazione simile modo a meno che si omette gli odori e semplicemente esporre la ricompensa, e (4 ) rilevano ottobre dopo lo stesso dosaggio. Per una discussione completa e ulteriori dettagli sui metodi di vedere Michels et al (2005) e Gerber e Stocker (2007). 4. Analisi dei dati per l&#39;apprendimento di zucchero Ricompensa <ol><li> Per valutare i dati del protocollo di apprendimento zucchero ricompensa calcolare un indice di preferenza OCT (PREF OCT) per ciascuno dei due reciprocitàgruppi automaticamente formati: Per il primo gruppo che ha ricevuto OCT / (+) - AM / (-) formazione: PREF OCT (OCT + / AM-) = (# di larve sul lato OTT - # di larve sul lato AM) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale Per il secondo gruppo che ha ricevuto AM / (+) - Ottobre / (-) formazione: PREF AM (AM + / OCT-) = (# di larve sul lato AM - # di larve sul lato ottobre) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale </li></ol><ol start="2"><li> Calcolare un indice di prestazione (PI) per i due valori PREF da 4.1). Il PI rappresenta apprendimento associativo da annullando effetti perturbatori di odore e di esposizione punizione, passare del tempo e la gestione: PI = (PREF ottobre (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / PTOM)) / 2 Così PI può variare da -1 a 1. Valori significativamente negativi rappresentano avversione di apprendimento, mentre valori significativamente positivi descrivere l&#39;apprendimento appetitiva. Un esperimento completo comprende di solito di 10 o più inibitori della proteasi. I dati sono visualizzati come sap casella di trameg tutti i valori di un determinato gruppo sperimentale. 50% dei valori essendo situato all&#39;interno della scatola, l&#39;indice di prestazioni mediana è indicata come una linea in grassetto nella particella casella. </li></ol> 5. Analisi dei dati per l&#39;attività rilevanti senso-motorie Facoltà <ol><li> Per valutare i dati durante il test per il corretto trattamento degli odori ottobre calcolo di un indice odore ottobre preferenze come segue: Odore PREF ottobre = (# di larve sul lato OTT - # di larve sul lato opposto) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale </li><li> Per valutare i dati durante il test per una corretta percezione degli odori AM calcolare un indice di odore AM preferenze come segue: Odore PREF AM = (# di larve sul lato AM - # di larve sul lato opposto) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale </li><li> Per valutare i dati durante il test per la percezione fruttosio corretto calcolare un indice di preferenza fruttosio come segue: PREF fruttosio = (# di larve lato fruttosio - # di larve dall&#39;altra) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale </li><li> Dettagli per la formazione farsa sono in Michels et al. 2005. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<html> La configurazione descritta in larve di Drosophila permette lo studio di apprendimento associativo olfattivo all&#39;interno di un cervello relativamente elementare. L&#39;approccio è semplice, economico, facile da stabilire in un laboratorio e non richiede attrezzature ad alta tecnologia 9. Vi presentiamo una versione dell&#39;esperimento, per studiare appetitiva apprendimento associativo rafforzato dalla ricompensa fruttosio 11. La configurazione descritta si basa su una serie di s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Numero CAS </td></tr><tr><td> Fruttosio </td><td> Sigma </td><td> 47740 </td><td> 57-48-7 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71350 </td><td> 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td> 9012-36-6 </td></tr><tr><td> 1-ottanolo </td><td> Sigma </td><td> 12012 </td><td> 111-87-5 </td></tr><tr><td> Amilacetato </td><td> Sigma </td><td> 46022 </td><td> 628-63-7 </td></tr><tr><td> Olio di paraffina </td><td> Sigma </td><td> 18512 </td><td> 8012-95-1 </td></tr></tbody></table>

appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; drosophila</em&gt; le larve

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Nel seguito sono descritti i dettagli metodologici appetitiva apprendimento associativo olfattivo nelle larve Drosophila. La configurazione, in combinazione con interferenza genetica, fornisce una maniglia per analizzare i fondamenti neuronali e molecolari di apprendimento specificamente associativo in un cervello semplice larvale. I microrganismi possono utilizzare l&#39;esperienza passata per regolare il comportamento presente. Tale acquisizione del potenziale comportamentale può essere definito come l&#39;apprendimento, e le basi fisiche di questi potenziali come tracce di memoria 1-4. I neuroscienziati cercare di capire come questi processi sono organizzati in termini di cambiamenti molecolari e neuronali nel cervello, utilizzando una varietà di metodi in organismi modello che vanno dagli insetti ai vertebrati 5,6. Per tali sforzi, è utile usare sistemi di modelli che sono semplici e accessibili sperimentalmente. La larva Drosophila è rivelato soddisfare queste richieste basate sula disponibilità di solidi saggi comportamentali, l&#39;esistenza di una varietà di tecniche transgeniche e l&#39;organizzazione elementare del sistema nervoso che comprende solo circa 10.000 neuroni (anche se con qualche concessione: limitazioni cognitive, poche opzioni comportamentali, e la ricchezza di esperienza discutibile) 7-10 . Larve di Drosophila possono formare associazioni tra odori e appetitiva rinforzo gustativa come lo zucchero 11-14. In un saggio standard, stabilita nel laboratorio di Gerber B., gli animali ricevono due odore formazione reciproca: Un primo gruppo di larve è esposto ad un odore Un insieme ad un rinforzo gustativo (ricompensa zucchero) e viene successivamente esposto ad un odore B senza armatura 9. Nel frattempo, un secondo gruppo di larve riceve una formazione reciproca, mentre vivendo un odore senza armatura e, successivamente, di essere esposti a B odore con rinforzo (premio zucchero). In seguito entrambi i gruppi sono testa per la loro preferenza tra i due odori. Preferenze relativamente più elevati per l&#39;odore premiato riflettere apprendimento associativo - presentato come un indice di prestazione (PI). La conclusione in merito alla natura associativa dell&#39;indice di prestazione è convincente, perché a parte la contingenza tra odori e sostanze sapide, altri parametri, come ad esempio l&#39;odore e l&#39;esposizione ricompensa, passare del tempo e la gestione non differiscono tra i due gruppi di 9.

La figura 1A mostra una panoramica delle procedure sperimentali per l&#39;apprendimento olfattivo larvale associativo. Accoppiando uno dei due odori presentati con un premio larve zucchero acquisire il potenziale comportamento di esprimere una risposta attraente verso l&#39;odore ricompensati rispetto al unrewarded odore. Due gruppi di larve sono sempre formati da una associazione il rinforzo con l&#39;odore PTOM o AM. L&#39;indice di prestazioni (PI) misura la funzione associativa come la differenza di...

Larve di Drosophila sono in grado di associare stimoli odore con la ricompensa gustativa. Qui descriviamo un semplice paradigma comportamentale che permette l&#39;analisi di appetitivo apprendimento associativo olfattivo.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Di seguito descriviamo i dettagli metodologici dell'apprendimento olfattivo associativo appetitivo nelle larve di Drosophila. L'apparato, in combinazione con...

Lo scopo di questa procedura è analizzare le funzioni cerebrali superiori. In un modello semplice, la larva DFA mediante appetito, apprendimento olfattivo associativo. Questo viene ottenuto raccogliendo innanzitutto 30 larve del terzo stadio alimentate da un contenitore di cibo.Successivamente, i larvi vengono addestrati per cinque minuti in una piastra di Petri con fruttosio come ricompensa e un contenitore di odore su ciascun lato contenente un ottanolo come stimolo olfattivo. Quindi viene effettuata una seconda fase di addestramento della durata di cinque minuti su una piastra senza ricompensa di fruttosio e con contenitori di odore su ciascun lato contenenti acetato di amile. Dopo tre ripetizioni delle due fasi di addestramento, i larvi vengono esposti a contenitori di odore posti su lati opposti per un test della durata di cinque minuti senza ricompensa.In definitiva, la preferenza odorosa relativa di un ottanolo rispetto all'acetato di amile indica che le larve di drosophila possono formare un'associazione tra stimoli olfattivi e ricompensa zuccherina, e questo può essere utilizzato per studiare l'apprendimento associativo in un sistema geneticamente malleabile. Questo metodo, in combinazione con l'interferenza genetica della funzione neuronale, può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'apprendimento e della memoria, come quali sono i neuroni che segnalano la ricompensa, o quali sono i neuroni necessari o sufficienti per l'acquisizione o il recupero di un ricordo ripetitivo? A dimostrare la procedura sarà anti a postop.Uno studente dottorando del mio laboratorio prima prepara delle piastre di Petri con aros al 2,5% senza fruttosio. Per preparare le piastre con fruttosio, aggiungere il fruttosio all'aros disciolto e quindi versare il composto nella piastra. Successivamente, etichettare ciascuna di queste piastre con un simbolo diverso che renda cieco l'esperimentatore.La piastra contenente il fruttosio è la ricompensa condizionata, mentre la piastra semplice è l'assenza di ricompensa. Per gli stimoli condizionati, preparare un totale di tre contenitori personalizzati in teflon per odori, ciascuno con 10 microlitri di uno ottole puro. I coperchi presentano dei piccoli fori che permettono l'evaporazione dell'odore.In secondo luogo, preparare altri tre contenitori per odore con 10 microlitri di acetato di amile diluito uno a 50 in olio di paraffina. Questa diluizione è attraente quanto i 10 microlitri di uno ottile puro; iniziare raccogliendo 30 esemplari, alimentandoli, senza farli vagare. Terzo, prelevarli da un flacone di cibo.Questo protocollo può essere eseguito in qualsiasi momento della giornata. È indipendente dai ritmi circadiani. Trasferire la lava in una piastra di Petri contenente alcune gocce di acqua del rubinetto e spostarla delicatamente avanti e indietro con un pennello.Quindi trasferire la lava in una seconda piastra di Petri che contiene anche alcune gocce di acqua di rubinetto. Esaminare le larve per verificare la presenza di pasta alimentare sulle pareti del corpo. Posizionare ora la piastra di Petri nell'apparato sperimentale per addestrare le larve ad associare odori a una specifica coda di zucchero.Posizionare un contenitore di odore sul lato sinistro e su quello destro di uno dei due tipi di piastra utilizzati per gli stimoli. Qui si usa un odore ottanoico, ma la scelta è arbitraria poiché l'esperimentatore è cieco rispetto alla ricompensa. Successivamente, posizionare il gruppo di larve al centro della piastra.Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti mentre gli animali sono esposti agli stimoli. Assicurarsi che le larve riescano a superare la tensione superficiale della goccia d'acqua in modo da non rimanere intrappolate e possano esplorare liberamente. Posizionare un nuovo contenitore di acetato di Amal su una piastra di Petri pulita.Dopo cinque minuti, utilizzare un pennello umido per trasferire le larve su un piatto di tipo opposto con stimoli opposti posizionati sui lati sinistro e destro. L'odore qui è acetato di amile. Una volta trasferite le larve, chiudere il coperchio e lasciare che gli animali esplorino per cinque minuti.Quando questo tempo è trascorso, il primo ciclo di addestramento è completato. Eseguire altri due cicli di addestramento nello stesso modo del primo, trasferendo gli animali con un pennello umido ed esponendoli a ciascuna combinazione di stimoli e ricompense per un totale di tre volte.Per il test sperimentale, posizionare contenitori di odore freschi, uno per ogni stimolo, su lati opposti di una piastra di Petri in agar non rivestita. Trasferire gli animali addestrati al centro della piastra. Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti.Dopo cinque minuti, utilizzare un modello posizionato sotto la piastra che definisca chiaramente tre zone della piastra: sinistra, destra e centrale; contare il numero di larve in ciascuna zona. La zona centrale rappresenta un punteggio di mancata preferenza e rende l'analisi più rigorosa e meno soggetta a bias. Infine, per completare l'esperimento, selezionare 30 nuove larve di terzo stadio in fase di alimentazione e ripetere la procedura di addestramento e prova con la combinazione opposta di ricompensa e stimoli.Continuare a utilizzare gli stessi contenitori per gli odori. Sono necessari diversi test di controllo per determinare se gli animali transgenici presentano un normale processamento degli odori in risposta agli stimoli premianti. Il test per la preferenza odorosa nei soggetti naïve inizia con la raccolta e il lavaggio di 30 larve, come effettuato per la fase di addestramento e di prova.Successivamente, posizionare i larvi su una piastra di Petri Agro Rose con un solo vial di stimolo su un lato. Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti. In seguito, utilizzando il modello, contare il numero di larvi sul lato vicino, al centro e sul lato opposto della piastra rispetto allo stimolo.Eseguire questo test per ogni stimolo utilizzato nell'esperimento per verificare la preferenza innata per lo zucchero. Preparare delle piastre di Petri dimezzate tagliando a metà l'agar di una piastra circolare e riempiendo lo spazio vuoto con agar fuso dell'altro tipo. Prestare attenzione affinché le due metà siano uguali in volume e non formino un bordo ben definito.Questo potrebbe richiedere pratica con la piastra divisa a metà preparata e a temperatura ambiente, posizionando 30 larve naive al centro della piastra, precedentemente pulite dall'alimento. Mettere un terzo di stella marina tra le larve al centro della piastra. Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti.Successivamente, utilizzando il modello, contare il numero di larve su ciascun lato e contare quelle al centro. La procedura descritta è stata utilizzata per addestrare e testare la lava trenchgenica. Utilizzando gli stimoli di esempio, i dati sono stati registrati come numero di larve in diverse regioni delle piastre di Petri.Dopo cinque minuti fuori da questa preferenza di dati, sono stati calcolati gli indici e gli indici di prestazione sono stati ricavati da gruppi addestrati in modo reciproco. Poiché le larve testate erano transgeniche, è stata offerta anche una scelta tra un contenitore odoroso pieno e aria, oltre a una scelta tra aromi puri e aromi più zucchero. Un'analisi degli indici calcolati mediante diagramma a scatola (box plot) ha rivelato che gli animali erano in grado di imparare a distinguere un odore acetato di ottile dall'acetato di metile utilizzando aromi a base di fruttosio come rinforzo appetitivo.Gli animali hanno riconosciuto entrambi gli stimoli come attrattori e hanno mostrato una preferenza innata per l'aroma di fruttosio rispetto all'aero. Questo paradigma sperimentale è stato utilizzato con successo con una vasta gamma di stimoli olfattivi e visivi, nonché con una grande varietà di stimoli premianti e avversivi. Questo paradigma, combinato con le numerose potenti manipolazioni genetiche disponibili in Drosophila, è particolarmente utile per analizzare reti neurali; ad esempio, manipolando geneticamente specifici insiemi di neuroni, definiti dai pattern di espressione di Gal4, è possibile valutare i ruoli funzionali di tali neuroni nell'apprendimento dell'appetito.Seguendo questa procedura, insieme all'interferenza genetica della funzione neuronale, è possibile analizzare le reti neurali del cervello larvale coinvolte nell'apprendimento e nella memoria. A causa della semplicità del cervello larvale, questo può essere ottenuto fino al livello della singola cellula.

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In questo articolo il video, si descrive un metodo nuovo che consente la costruzione di gradienti di odorizzante con geometrie stabili e controllabili. Abbiamo brevemente illustrare come questi gradienti possono essere usati per lo screening dei difetti olfattivi (anosmia totale e parziale) e di studiare le caratteristiche più sottili del comportamento chemiotassi.

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Descriviamo qui un metodo di configurazione comportamentale e di analisi dei dati per analizzare le risposte olfattive di un massimo di 100 mosche dell'aceto (Drosophila melanogaster). Questo sistema può essere utilizzato con stimoli olfattivi singoli o multipli e può essere adattato per l'attivazione optogenetica o il silenziamento di sottogruppi neuronali.

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Il gusto è un importante processo sensoriale che facilita l'attrazione verso sostanze benefiche e l'evitamento di sostanze tossiche.  Questo protocollo descrive un semplice saggio di ingestione per determinare la preferenza gustativa della Drosophila per un dato composto chimico.

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Questo protocollo descrive un apprendimento e memoria di Drosophila chiamato condizionamento di corteggiamento. Questo saggio classico si basa su una riduzione del comportamento maschile di corteggiamento dopo il rifiuto sessuale da parte di una femmina prematurata non ricettiva. Questa forma naturale di plasticità comportamentale può essere usata per testare l'apprendimento, la memoria a breve termine e la memoria a lungo termine.

Condizionamento del corteggiamento di Drosophila come misura dell&#39;apprendimento e della memoria

Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

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Questo lavoro descrive un semplice paradigma comportamentale che consente l'analisi dell'apprendimento associativo avversivo nei moscerini della frutta adulti. Il metodo si basa sulla soppressione del comportamento innato della geotaxi negativa a causa dell'associazione formata tra uno specifico contesto ambientale e una scossa elettrica.

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Un ostacolo significativo allo studio dell'attività cellulare durante i processi cognitivi come l'apprendimento e la memoria è l'uso di anestetici per la preparazione dell'imaging in vivo . L'anestesia compromette la memoria a breve termine e la cognizione in più modelli, tra cui la Drosophila. Questo studio presenta un metodo unico per preparare la Drosophila adulta per l'imaging in vivo senza anestesia.

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Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in

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