Name: 部分原位肝移植大鼠模型的肝动脉重建的外科手术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 47 s
Description: 学习大鼠部分原位肝移植手术技术，包括供肝切取、体外50%肝切除及肝动脉重建等显微外科操作。该方法为移植研究提供可重复的实验模型，并通过血清丙氨酸氨基转移酶水平评估移植肝损伤程度。

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作者感谢Pascal Paschenda和Mareike Schulz提供的技术支持。

1. 基本技术与常见操作步骤
<ol>
	<li>所有操作均在洁净但非无菌条件下进行。</li>
	<li>打开大鼠腹腔后，所有操作均在手术显微镜下以16倍放大倍数进行。例外情况为 离体 肝切除术（在10倍放大下进行），以及以下在25倍放大下进行的操作：胆管和肝动脉支架置入，以及肝动脉、肝下腔静脉（IHVC）和胆管的重建。</li>
	<li>棉签用于轻柔地操作器官、钝性分离组织以及压迫止血。将纱布块（5 × 5 cm）浸入乳酸林格液中，用于牵拉肝脏或肠管，并保持器官湿润。Satinsky钳可用于将覆盖纱布的肠管向大鼠左侧或尾侧牵拉，以扩大肝后下腔静脉（IHVC）周围的手术视野。</li>
	<li>所有结扎均使用6-0丝线进行，但肝脏叶蒂部的结扎除外 离体 肝切除术中使用4-0丝线进行结扎。可利用DeBakey Bulldog钳或其他器械牵拉结扎线，以在结扎点处提供适当张力，便于在距离第一结扎点一定位置处进行第二次结扎，从而准确完成两结扎点之间的离断。</li>
	<li>所有静脉注射均通过阴茎静脉进行。</li>
	<li>在进行肝上腔静脉（SHVC）、门静脉、肝动脉和胆管的重建手术过程中，使用一小块油性黏土固定外周血管钳或蚊式钳的指环，以保持其位置稳定。</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
	<li>选用体重在230至250克之间的雄性Lewis大鼠作为肝移植的供体和受体。在麻醉诱导前，大鼠可自由摄取水和食物。</li>
	<li>门静脉套管 (图1)：在显微镜下使用11号手术刀片切割14号导管制备门静脉套管。套管由主体和延伸部分组成，每部分长度均为2 mm。使用蚊式钳逐步环绕夹紧套管壁，形成环形凹槽，以便线结能够牢固地固定在套管上而不滑脱。</li>
	<li>胆管和肝动脉支架 (图1)：在显微镜下使用手术刀切割24号导管，制备两端斜面，肝动脉支架长度为4 mm，胆管支架长度为5 mm。</li>
</ol>
3. 供体手术
供体大鼠肝脏摘除示意图见图2。该操作过程约需30-35分钟。
<ol>
	<li>使用4%体积分数的异氟烷与100%氧气混合气体（气体流速为4 L/min）进行吸入麻醉以诱导麻醉状态，维持麻醉时使用1.5%体积分数的异氟烷（气体流速为2 L/min）。皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）作为镇痛剂。将大鼠置于加热垫上，并使用磁性固定牵引系统固定其上肢 （图3a）剃除大鼠整个腹部区域的毛发，并使用聚维酮碘溶液对相应皮肤进行消毒。</li>
	<li>沿正中切口并双侧延伸切开腹腔。将一支5 ml注射器置于大鼠背部下方，使下腔静脉前移抬高。用蚊式钳夹住剑突并向头侧牵拉，放置肋下牵开器以暴露手术视野 （图3a）.</li>
	<li>解剖镰状韧带和左侧三角韧带。随后结扎并切断左侧膈静脉。</li>
	<li>用湿纱布将中叶和左外侧叶向上牵开。使用双极电凝镊凝固并切断左外侧叶与尾状叶前部之间的食管旁血管。</li>
	<li>将肠管移出腹腔并置于大鼠左侧，用湿纱布覆盖。用湿纱布将右外侧叶向上牵拉。分离膈下腔静脉（IHVC）与腹膜后组织，结扎右肾上腺静脉，该静脉将在移植肾切除前离断。</li>
	<li>将支架置入胆管 （图3b）:
	<ol class="lalpha">
		<li>在胃十二指肠动脉分叉水平结扎胆管。应尽可能保留胆管周围的软组织，避免将胆管与肝动脉分离，以确保胆管获得充足的动脉血液供应。</li>
		<li>使用直显微剪刀，在结扎点近端的胆管前壁上做一个小切口。左手用直显微镊夹住切口的前壁，右手用弯显微镊将支架插入胆管，并用6-0丝线固定。保留胆管上丝线一端的剪断端长度为4 mm，以便在后续吻合时牵拉固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结扎并切断幽门静脉和脾静脉，游离门静脉。</li>
	<li>结扎并切断胃十二指肠动脉，随后游离肝总动脉（CHA）从胰头至其根部。使用棉签将肝脏向右旋转，解剖肝脏背侧及食管周围的韧带。</li>
	<li>完成肝脏切除的准备工作后，移除牵开器、剑突部位的蚊式止血钳以及大鼠背部下方的5 ml注射器，将肠管还纳至腹腔内。</li>
	<li>通过阴茎静脉注射500 IU肝素钠溶于2 ml生理盐水的溶液。约3分钟后，重新设置5 ml注射器、蚊式钳和牵开器。结扎肝固有动脉（CHA）根部近端。保留CHA结扎线的一端较长，以备后续使用。</li>
	<li>用蚊式钳在右肾静脉附近夹闭肝内下腔静脉后，于脾静脉残端下方用一次性微型血管夹夹闭门静脉。切开门静脉前壁，将一根18号导管插入门静脉。</li>
	<li>灌注肝脏 原位 用60 ml冷的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）溶液在20 cm H₂O的静水压力下灌注2O. 随即剪开膈肌并横断胸腔段下腔静脉，切开肝下下腔静脉（IHVC）前壁，使灌注液从肝脏中流出冲洗干净 （图3c）.</li>
	<li>用一次性微型血管夹在肝脏下方夹闭肝下腔静脉。在肝脏与右肾静脉之间中点稍下方处解剖切断肝下腔静脉，于脾静脉残端下方切断门静脉，同时离断膈肌、肝脏背部残余的韧带、右肾上腺静脉，并在其根部离断肝总动脉。将切除的肝脏置于盛有冷HTK溶液的金属杯中，金属杯放置于装满碎冰的塑料盒内。</li>
</ol>
4. 离体 移植物制备
肝脏移植物的所有操作均在盛有冰冻HTK溶液的金属杯中进行。ex vivo 移植物制备过程约需30分钟。
<ol>
	<li>门静脉袖状吻合的步骤（图4）： 
	使用DeBakey血管夹夹闭门静脉主干，将血管夹置于杯状结构上方的桥接位置（图4a, b）。将门静脉穿过袖状物，并在12点钟位置连同袖状物的延伸部分一起再次夹闭门静脉（图4c）。将门静脉壁外翻覆盖于袖状物上，使脾静脉残端位于袖状物外侧的7点钟位置（图4d），并用6-0丝线固定门静脉（图4e）。</li>
	<li>肝动脉支架置入步骤（图5）： 
	用镊子夹住膈肌两侧边缘以固定肝脏，并用DeBakey血管夹夹住已结扎的线头，将肝固有动脉（CHA）拉直（图5a）。使用直显微剪刀在CHA前壁做一小切口。左手用直显微镊夹住切口前壁，右手用弯显微镊将支架置入CHA中。支架预先用肝素钠溶液（100 IU/ml）冲洗处理（图5b-d）。用6-0丝线固定支架，并保留其中一端剪断后的线头长度为4 mm。通过动脉导管用5 ml冷HTK溶液冲洗肝脏。</li>
	<li>50%肝切除术步骤（图6）：
	<ol class="lalpha">
		<li>用蚊式钳夹住尾状叶后部以固定其位置。结扎其蒂部后，使用4-0丝线结扎并切除该叶（图7a）。以相同方式切除尾状叶前部。</li>
		<li>将塑料盒旋转90度。夹住膈肌右侧边缘及中叶左侧部分。在中叶双侧部分交界上缘处做一小切口，结扎后切除左侧部分（图7b）。结扎左外侧叶的蒂部后将其切除。使用双极电凝镊仔细烧灼切除后的肝创面。最终肝脏质量减少约50%15（图7c, d）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下腔静脉（SHVC）成形术步骤（图8）： 
	用蚊式钳夹住膈肌两侧边缘以固定肝脏位置（图8a）。切除对应部位的膈肌，修整SHVC前壁。在两侧角部从外向内各缝置两根7-0聚丙烯缝线，作为后续吻合时的固定缝线（图8b）。随后修整SHVC后壁。</li>
	<li>将肝移植物置于冷水中，以4 °C的HTK溶液保存。</li>
</ol>
5. 受体手术
受体大鼠移植植入示意图见图9。受体手术耗时60-70分钟，其中包括无肝期10-11分钟和下腔静脉阻断时间约23-24分钟。
<ol>
	<li>除腹部切口采用正中切口且无双侧延长外，其余操作均与供体手术步骤（3.1 至 3.4）相同（图 10a）。</li>
	<li>用湿纱布覆盖十二指肠右侧及全部肠道，以暴露肝下腔静脉（IHVC）周围的手术视野。将左外侧叶和中叶推入左侧膈下间隙，并用湿纱布向上牵拉右外侧叶。分离 IHVC 周围的后腹膜组织。结扎并切断右肾上腺静脉（图 10b）。使用湿纱布和棉签将肝脏向左侧旋转，解剖肝脏背侧的韧带。</li>
	<li>将右外侧叶恢复至解剖位置。用湿纱布覆盖并向上牵拉中叶和左外侧叶。在尾状叶分支下方切断胆管。应尽可能保留胆管周围的软组织。保留一段用于胆管结扎的线头，长度为 4 mm。</li>
	<li>在距肝总动脉（CHA）分支 3 mm 处结扎并切断胃十二指肠动脉和肝固有动脉。随后，在 CHA 末端形成动脉 Y 形结构。保留一段用于肝固有动脉结扎的线头，长度为 4 mm。用棉签将肝脏向右侧旋转，并从左侧解剖肝脏背侧的韧带。</li>
	<li>静脉注射 2 ml 乳酸林格液后，使用金属微血管夹在右肾静脉上方夹闭 IHVC。从大鼠左侧使用蚊式钳在肝门处夹闭门静脉分叉水平。从右侧使用外周血管夹连同膈肌一起夹闭肝上腔静脉（SHVC），并将血管夹的指环固定于油性黏土块中。</li>
	<li>在无肝期（门静脉交叉阻断期间）将异氟烷麻醉浓度降低至 0.4 vol%。通过以下层面解剖切除受体自身肝脏：SHVC 在 SHVC 与肝脏交界处；门静脉在蚊式钳钳口稍上方；IHVC 在肝脏与右肾静脉中点稍下方（图 10c）。将移植肝正位植入。</li>
	<li>采用连续缝合法进行 SHVC 吻合（图 11）：
	<ol class="lalpha">
		<li>缝合过程中，左手持弯头显微镊用于夹持血管壁或持针。首先，使用带 7-0 聚丙烯缝线从移植物右侧角的受体 SHVC 内侧穿至外侧，放置固定缝线，随后打结（也可在全部缝合完成后统一打结）。接着，以相同方式在左侧角放置第二根固定缝线，作为连续缝合的起始针。为扩大吻合口，使用 DeBakey 血管夹在两侧角轻轻向头外侧牵引并固定缝线（图 11a, b）。</li>
		<li>从左侧角开始，将缝线由移植物侧血管壁外侧紧贴线结处穿入内侧，以内腔缝合法用 7 至 8 针从左侧向右侧缝合 SHVC 后壁（图 11c）。前几针应仔细操作，确保内腔对合良好。在右侧角处，将 7-0 聚丙烯缝线从移植物侧血管穿至外侧。</li>
		<li>接着，从外侧由右向左缝合前壁，约 10 针（图 11d）。在完成前壁缝合前，用乳酸林格液冲洗管腔以排除气泡。最后一针应尽可能靠近左侧角的固定缝线，并与之打结固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用套管技术重建门静脉（图 12）：
	<ol class="lalpha">
		<li>用湿纱布向上牵拉中叶和左外侧叶。从右侧使用一次性微血管夹夹闭受体门静脉与幽门静脉汇合处。将夹闭门静脉的蚊式钳固定于黏土中，并将钳尖朝向肝门方向牵拉（图 12a, b）。</li>
		<li>在蚊式钳钳口稍下方切开门静脉前壁。用乳酸林格液冲洗受体门静脉及套管内腔。左手持直头显微镊夹住切口前壁，右手持弯头显微镊夹住套管延伸部分。将套管深插入受体门静脉内，并用一圈 6-0 丝线固定（图 12c-f）。</li>
		<li>松开门静脉和 SHVC 的血管夹，恢复肝脏灌注。从大鼠尾部移除 5 ml 注射器，并将异氟烷浓度提高至 0.8 vol%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用支架技术重建肝动脉16（图 13）：
	<ol class="lalpha">
		<li>首先，从左侧用蚊式钳夹住受体肝固有动脉的缝线，并将其向肝门方向牵拉，然后从右侧靠近胰腺处夹闭受体肝总动脉（CHA）（图 13a）。</li>
		<li>使用直头显微镊在受体 CHA 末端 Y 形分叉处做一小切口，形成漏斗状开口。用弯头显微镊夹住移植物 CHA 内的支架。用肝素钠溶液（100 IU/ml）冲洗两端管腔后，将支架滑入受体 CHA，并用 6-0 丝线固定。将此线的一端与受体 CHA 上的线结及移植物 CHA 上保留的 4 mm 线头打结，使两段 CHA 靠近，同时降低吻合口张力（图 13b）。随后松开血管夹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用连续缝合法进行 IHVC 吻合（图 14）： 
	操作方式与 SHVC 吻合同法，但需使用更多针数并减小进针间距（图 14a-d）。最后一针可不打结，或使用生长因子打结，以避免因结扎过紧导致吻合口狭窄。开放血流后，将麻醉浓度提高至 1.0 vol%。若发现吻合口有狭窄迹象，可通过牵拉双侧固定缝线或轻柔扩大前壁以扩张吻合口。</li>
	<li>静脉注射 0.5 ml 8.4% 碳酸氢钠溶液与 1.0 ml 乳酸林格液。</li>
	<li>使用少量 Tachosil 片段覆盖切除的肝脏表面，以防止出血和胆汁渗漏。</li>
	<li>采用支架技术重建胆管：
	<ol class="lalpha">
		<li>从左侧用蚊式钳夹住受体胆管的缝线。将蚊式钳固定于黏土中，并将其钳尖朝向肝门方向牵拉。</li>
		<li>在适当位置做一小切口，确保重建后的胆管长度适中。将移植物胆管内的支架小心插入受体胆管，注意避免扭曲，并用 6-0 丝线固定。将此线与受体胆管上的线结及移植物胆管上保留的 4 mm 线头打结，使两段胆管靠近，同时降低吻合口张力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成所有重建操作后，静脉注射 1 ml 5% 葡萄糖溶液（图 15）。</li>
	<li>确认止血充分后，使用连续 4-0 Vicryl 缝线分两层缝合腹壁切口。</li>
</ol>
6. 术后治疗与随访
手术后立即给予受体大鼠皮下注射头孢呋辛钠（16 mg/kg）和布托啡诺（0.1 mg/kg），溶于共1.5 ml的生理盐水溶液中。将大鼠置于配备加温空气（30–35 °C）和供氧装置的特殊重症监护笼中，使其恢复60分钟。术后3天内每12小时皮下注射一次布托啡诺（0.1 mg/kg）作为镇痛剂。之后将大鼠转移至普通笼具，并自由饮水和进食。

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</ol>

我们声明不存在利益冲突。根据实验动物科学协会联合会（FELASA）的指南，大鼠在无特定病原体条件下饲养。所有实验均依照德国联邦动物保护法律以及《实验动物护理与使用指南》（美国国立卫生研究院出版物第86-23号，1985年修订版）进行。

1973年，Lee 等首次报道了大鼠OLT模型9，该模型通过手工缝合方法重建包括肝动脉在内的所有血管，并采用体外门体分流术。该模型技术复杂，操作困难。随后，同一研究团队于1975年开发了另一种无需重建肝动脉且不使用体外分流的模型10。1979年，Kamada 等进一步引入了套管吻合技术，用于无需肝动脉重建的模型11。经过这些改进，大鼠OLT手术得以简化，受体手术的无肝期缩短，该模型现已被广泛接受并作为标准的实验模型使用。
然而，自那以后，关于大鼠OLT中肝动脉化的意义一直存在较大争议8，因为尽管动脉化操作具有较高技术难度，但并未影响移植后的存活率。已有大量研究报道了采用不同重建技术进行肝动脉化的实验8，例如主动脉节段-主动脉吻合术3,9,17、套管吻合技术18,19,20、套叠式技术5、支架技术13,16以及套筒吻合技术12,21-23。尽管目前大鼠OLT技术仍未实现标准化，但鉴于其生理上的优越性，动脉化模型正日益受到青睐8,12,13,14。在上述技术中，Lehmann et al.16于2005年报道了一种操作简便且快速的支架技术。该研究取得了优异的结果：在再灌注后8小时、24小时以及6个月时，重建的肝动脉均未观察到闭塞现象。因此，我们采用了该技术进行肝动脉化。
我们采用手工缝合的方法重建SHVC和IHVC。该方法可为吻合部位提供最佳的生理条件，从而降低血栓形成的发生率8，同时也是对外科医生进行显微外科模拟与训练的最佳方式。此外，即使血管残端较短，该吻合方法仍可实施。在IHVC吻合方面，与套管法吻合技术相比，该方法无需在移植物侧保留较长的IHVC。因此，当供体肾静脉被解剖以延长移植物侧IHVC时，该方法适用于需要较长IHVC的小体积移植物移植，例如由右外侧叶和尾状叶组成、肝内下腔静脉较短且无SHVC的30%体积移植物2。
关于大鼠肝切除术的技术，迄今为止已有多种方法被报道；其中主要的两种技术是经典的结扎法和血管导向技术24。我们采用经典的结扎法进行50%肝切除15，但手术在手术显微镜下进行，以使操作更加精细，并避免对剩余肝叶及结构造成损伤。
我们描述了模型中受体大鼠的代表性结果：大鼠在为期7天的观察期内存活，未出现明显并发症。通过选择不同的设置，该模型可针对不同的实验目的进行修改，例如延长冷保存时间、延长热缺血时间（包括心脏死亡后捐献）、使用较小的肝脏移植物，或来自肝损伤或肝脏疾病实验模型的移植物。
根据我们的经验，在整个手术过程中有三个关键因素可能影响移植后的存活率，而存活率是评估大鼠OLT结果的最可靠参数：失血量；手术时间，尤其是门静脉和下腔静脉（IHVC）的阻断时间；以及每条血管重建的充分性，因为血管重建不当可能导致狭窄、血栓形成或出血。在该模型的培训阶段，大多数手术失败很可能与上述因素有关。在本视频文章中，我们逐步介绍了带有肝动脉重建的大鼠部分OLT模型的手术操作流程。尽管大鼠OLT模型较为复杂，且需要高超的显微外科技术，但本文提供了大量实用信息，可为该模型的学习与培训提供良好指导。高效掌握该模型对于缩短学习周期、减少训练所需的实验动物数量和成本，以及后续在实验中获得可靠结果尤为重要。这也符合Russell和Burch于1959年提出的动物实验“3R”原则（替代、减少和优化）25。

<table><tbody><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica</td><td>M651</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>Schott</td><td>KL1500LCD</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>NOBA Verbandmittel</td><td>974202</td><td></td></tr><tr><td>纱布垫（5×5 cm）</td><td>Fuhrmann</td><td>10002</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Mundipharma</td><td>6108022.00.01</td><td></td></tr><tr><td>油性黏土</td><td>Debika corporation</td><td>090148</td><td></td></tr><tr><td>TachoSil</td><td>Takeda Pharmaceuticals International GmbH</td><td>EU/1/04/277/001-004</td><td>用于切除肝脏表面的处理</td></tr><tr><td>11号手术刀片</td><td>Pfm medical</td><td>200130011</td><td>用于套管和支架的制备</td></tr><tr><td>14号导管</td><td>B. Braun</td><td>4268210S</td><td>门静脉套管</td></tr><tr><td>18号导管</td><td>B. Braun</td><td>4268130S</td><td>经门静脉灌注</td></tr><tr><td>24号导管</td><td>B. Braun</td><td>4269071S</td><td>胆管和肝动脉支架</td></tr><tr><td>4-0 丝线缝合线</td><td>Resorba</td><td>H3F</td><td>肝脏切除</td></tr><tr><td>6-0 丝线缝合线</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td></td></tr><tr><td>7-0 Prolene（聚丙烯）缝合线</td><td>Ethicon</td><td>8701H</td><td>供体下腔静脉和受体下腔静脉吻合</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>V304H</td><td>腹部关闭</td></tr><tr><td>5 ml 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS+T05ES1</td><td>背部垫枕</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Thermo</td><td>190 x 260 mm</td><td></td></tr><tr><td>磁性固定牵开系统</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>18200-01&lt;br/&gt; 18200-02&lt;br/&gt; 18200-03&lt;br/&gt; 18200-12</td><td></td></tr><tr><td>冷水浴装置</td><td>Huber</td><td>740.000X</td><td>移植物保存</td></tr><tr><td>双极电凝镊</td><td>S&amp;#246;ring</td><td>MBC-200</td><td></td></tr><tr><td>蚊式止血钳</td><td>BONIMED</td><td>451-476-03</td><td>使用两把</td></tr><tr><td>Adson 微型镊</td><td>Dimeda</td><td>10.176.12</td><td></td></tr><tr><td>弯头微型镊</td><td>AESCULAP</td><td>FD281R</td><td></td></tr><tr><td>直头微型镊</td><td>Bonimed</td><td>451-476-03</td><td></td></tr><tr><td>弯头微型剪刀</td><td>Medicon</td><td>05.15.83</td><td></td></tr><tr><td>直头微型剪刀</td><td>AESCULAP</td><td>FD12</td><td>精细切口</td></tr><tr><td>普通剪刀</td><td>AESCULAP</td><td>BC211W</td><td></td></tr><tr><td>微型持针器</td><td>AESCULAP</td><td>FD241R</td><td>血管重建</td></tr><tr><td>Mayor-Hegar 持针器</td><td>Mizuho Ikakogyo</td><td>06-798-00</td><td>腹部关闭</td></tr><tr><td>DeBakey 蛙形钳（直型）</td><td>ULRICH</td><td>CV3054</td><td></td></tr><tr><td>DeBakey 蛙形钳（弯型）</td><td>CODMAN</td><td>37-1062</td><td></td></tr><tr><td>Satinsky 钳</td><td>Mizuhoika</td><td>09-230-24</td><td></td></tr><tr><td>外周血管钳</td><td>Teleflex Medical</td><td>353494</td><td>受体肝下腔静脉</td></tr><tr><td>微型血管钳（一次性）</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>TKM-1-60 g</td><td>门静脉、供体肝内下腔静脉和受体肝动脉</td></tr><tr><td>微型血管钳（金属）</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>18052-01</td><td>受体肝内下腔静脉</td></tr><tr><td>乳酸林格液</td><td>Fresenius Kabi</td><td>6150917.00.00</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液</td><td>DeltaSelect</td><td>1299.99.99</td><td></td></tr><tr><td>HTK 溶液</td><td>Dr. Franz K&amp;#246;hler Chemie GmbH</td><td>31268.00.00</td><td>保存液</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td>灌注前 500 IU</td></tr><tr><td>8.4% 碳酸氢钠</td><td>Fresenius Kabi</td><td>4399.97.99</td><td>再灌注后 0.5 ml</td></tr><tr><td>5% 葡萄糖溶液</td><td>B. Braun</td><td>6714567.06.00</td><td>再灌注后 1.0 ml</td></tr><tr><td>头孢呋辛钠</td><td>Fresenius Kabi</td><td>38985.01.00</td><td>抗生素，16 mg/kg</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>镇痛药，0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>重症监护笼</td><td>Brinsea Products Ltd.</td><td>Vetario S10</td><td>术后护理</td></tr></tbody></table>

部分原位肝移植伴肝动脉重建的大鼠手术操作

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

在大鼠中采用全肝或部分肝脏移植物进行原位肝移植（OLT）是移植研究中不可或缺的实验模型，可用于移植物保存和缺血-再灌注损伤1,2、免疫应答3,4、血流动力学5,6以及小体积综合征7等方面的研究。大鼠OLT是实验外科中最困难的动物模型之一，需要高超的显微外科技术，且学习过程耗时较长。因此，该模型的应用受到一定限制。由于使用此类复杂动物模型的实验结果的可靠性和可重复性至关重要，参与大鼠OLT的外科研究人员必须接受标准化且精细的手术操作培训。
尽管已报道了多种大鼠OLT技术及其改良方法 8 自从李氏首次描述该模型以来 等 9 1973年，肝动脉重建的消除 10 以及由Kamada引入的套管吻合技术 等 11 在Kamada的模型中，这是一项重大进步，因为它们极大地简化了重建过程。 等，肝动脉重建也被取消。由于大鼠在肝移植后即使没有肝动脉血流仍可存活，因此关于肝动脉重建的价值一直存在较大争议。然而，带肝动脉重建的模型在生理上的优越性正日益得到认可，尤其是在保护胆管系统方面。 8,12 肝脏完整性 8,13,14.
本文中，我们介绍了采用50%部分移植物进行肝动脉重建的大鼠OLT模型的详细手术步骤 离体 肝切除术。各血管及胆管的重建采用以下方法：肝上和肝下下腔静脉使用7-0聚丙烯连续缝合；门静脉采用套管技术；肝动脉和胆管采用支架技术。

所有受体大鼠（n = 20）在门静脉再灌注后1、3、24和168小时（7天）计划安乐死采血前均存活，且无明显并发症（每个时间点n = 5）。通过27号针头直接穿刺下腔静脉（IHVC）采集血液样本。样本在5,340 × g离心10分钟后获取血清，并检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平，该指标反映移植后肝细胞损伤程度。血清ALT水平随时间变化的趋势见图16。ALT水平在24小时达到峰值（均值±标准差：212.6 ± 67.9 IU/L），随后在168小时下降至正常范围（33.6 ± 6.8 IU/L）。
<img alt="支架比较图表；门静脉、肝动脉、胆管模型及比例尺；血管医疗器械分析。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 由14号导管制成的门静脉（PV）袖套，以及由24号导管制成的肝动脉（HA）和胆管（BD）支架。
<img alt="肝脏血管解剖图：SHVC、IHVC、HA、BD、PV通路；循环研究。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4376/4376fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 大鼠供体肝脏摘除示意图。BD，胆管；HA，肝动脉；IHVC，肝下腔静脉；PV，门静脉；SHVC，肝上腔静脉。
<img alt="手术小鼠模型，标注有注射器、胆管（BD）和门静脉（PV）；肝脏研究装置。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 供体手术操作。a. 将大鼠置于加热垫上，并使用磁性固定器牵开系统。通过腹正中切口并双侧延伸打开腹腔。b. 将支架插入胆管。c. 通过门静脉灌注肝脏。缩写词解释见图2。
<img alt="使用手术器械进行器官解剖的装置；显示组织细节的特写，用于解剖学研究。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
 图 4. 门静脉套管的连接。a,b. 夹住门静脉主干的DeBakey Bulldog钳置于金属杯上方。该金属杯安装在装有碎冰的塑料盒中。c. 将门静脉穿过套管。d. 将门静脉壁外翻覆盖在套管上，脾静脉残端位于套管外侧的7点钟位置，套管延伸部分位于12点钟位置。e. 使用一圈6-0丝线将门静脉固定在套管上。黑色箭头指示脾静脉残端的位置。
<img alt="胚胎显微手术过程，分步示意图展示精确的组织操作技术。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 肝动脉内支架的离体（ex vivo）置入。a. 通过夹住膈肌两侧边缘固定肝脏，并利用结扎肝动脉的缝线将其拉直。b. 用直显微镊夹住肝动脉小切口的前壁。c, d. 将支架置入肝动脉，并用6-0丝线固定。
<img alt="带有标记叶段的肺部分割示意图：RML、LML、LLL、SRL、ACL、PCL、IRL。" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4376/4376fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. ex vivo 50% 肝切除术示意图。 灰色部分表示被切除的肝叶。ACL，前尾状叶；PCL，后尾状叶；LLL，左外侧叶；LML，中叶左部；RML，中叶右部；SRL，右外侧上叶；IRL，右外侧下叶。
<img alt="肝脏切除过程：手术步骤示意图；四幅图示显示切除前后情况。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
 图 7. ex vivo 50% 肝脏切除。a. 结扎尾状叶后部蒂部。 b. 结扎中叶左部分的蒂部。 c. 50% 肝切除前的肝脏。 d. 50% 肝切除后的肝脏。
<img alt="显示肝脏结构的解剖实验；带手术器械的示意图，说明实验设置。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
 图8. 肝上腔静脉的离体成形术。 a. 用蚊式钳夹住膈肌两侧边缘以固定肝脏。b. 在两个角部用7-0聚丙烯缝线放置固定缝线。
<img alt="显示手术教育用肝血管解剖结构（SHVC、IHVC、PV、HA 和 BD）的示意图。" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4376/4376fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 9"> 
 图 9. 受体大鼠移植肝植入示意图。 采用 7-0 连续缝合线对肝上和肝下腔静脉（SHVC 和 IHVC）进行重建，门静脉（PV）采用套管技术，肝动脉（HA）和胆管（BD）则采用支架技术进行重建。
<img alt="大鼠解剖装置带注射器；手术背景下详细静脉标注，IHVC、SHVC、PV。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图10"> 
图10. 受体手术至切除原位肝脏。a. 通过正中切口打开腹腔。b. 结扎右肾上腺静脉。c. 切除原位肝脏。缩写释义见图2。
<img alt="眼部手术技术的外科手术示意图，显示了逐步操作及所用工具。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图11"> 
 图11. 肝上腔静脉的吻合。a, b. 肝上腔静脉的外周血管钳固定在一团油性黏土中。两个角部的固定缝线以轻柔的上外侧牵引维持，以扩大吻合口。c. 后排连续腔内缝合正在进行中。d. 前排连续缝合正在进行中。
<img alt="显示使用动物模型进行心血管干预及血管缝合的外科手术示意图。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig12.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 12"> 
图 12. 门静脉重建。a, b. 用蚊式钳夹住门静脉，并将其固定于油性黏土中，向肝门方向牵拉。c-f. 将套管插入门静脉。
<img alt="显示肝动脉支架置入的手术示意图：标注了解剖结构的 PHA、CHA、GDA。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig13.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图13"> 
 图13. 肝动脉重建。a, b. 将支架置入受体的肝总动脉（CHA），位置位于肝固有动脉（PHA）与胃十二指肠动脉（GDA）的分叉处。
<img alt="肝移植手术步骤，肝动脉、门静脉、下腔静脉吻合，手术示意图。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig14.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图14"> 
 图14. 下腔静脉吻合。a. 两侧角固定缝线。 b. 后壁连续缝合。 c. 前壁连续缝合。 d. 下腔静脉再灌注。缩写说明见 图2。
<img alt="带标注结构的肝脏外科解剖图：BD、HA、PV、IHVC；用于医学研究的示意图。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig15.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图15"> 
 图15. 所有重建手术步骤均已完成。缩写含义见图2。
<img alt="丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平图，门静脉再灌注后，时间与酶活性的关系。" src="/files/ftp_upload/4376/4376fig16.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图16"> 
 图16. 术后血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平随时间变化的过程（n = 20；每个时间点 n = 5）。数据以均值±标准差表示。ALT水平在24小时达到峰值（212.6 ± 67.9 IU/L），随后在168小时下降至正常范围（33.6 ± 6.8 IU/L）。

大鼠原位肝移植是生物医学研究中不可或缺的实验模型。本文介绍了我们采用50%部分移植物并进行肝动脉重建的大鼠原位肝移植手术操作步骤。

在大鼠中采用全肝或部分肝脏移植物进行原位肝移植（OLT）是移植研究不可或缺的实验模型，例如……

本实验的总体目标是在大鼠中进行部分原位肝移植，建立一种可重复的移植研究实验模型。该过程首先从供体大鼠中取出肝脏，第二步是对肝脏移植物进行离体准备，包括实施50%的肝切除。接下来，切除受体大鼠的原位肝脏。最后一步是将部分肝脏移植物植入受体大鼠体内。最终，通过检测血清丙氨酸氨基转移酶水平来评估移植后肝移植物的肝细胞损伤情况。通常，初次接触该操作的人员会因整个过程的复杂性而面临困难，该过程需要高超的显微外科技术。开始操作前，通过夹捏足趾确认动物已完全麻醉后，将麻醉后的供体大鼠置于加热垫上，并使用磁性固定牵开系统固定其前肢。剃除大鼠整个腹部区域的毛发，并用聚维酮碘溶液对相应皮肤进行消毒。沿正中线切开腹腔，并向两侧延伸。将一个5 mL注射器置于大鼠背部下方，使肝上腔静脉腹侧抬高，用蚊式钳夹住并向上牵拉，然后使用肋下牵开器暴露手术视野。由于术中需要频繁调整牵开器和5 mL注射器，因此切口周围不使用手术巾。在手术显微镜16倍放大下操作，呈“8”字形解剖镰状韧带和左侧三角韧带，结扎并切断左侧膈静脉，用湿纱布将肝中叶和左外侧叶向上牵拉。 使用双极电凝镊凝固并切断左侧叶与前协调叶之间的食管旁血管。将肠管移至腹腔外并置于大鼠左侧，用湿纱布覆盖。用湿纱布擦拭，并用湿纱布垫向上牵拉右侧叶。从后腹膜组织中分离肝下腔静脉，并结扎右肾上腺静脉；在移植器官切除前，将在此处切断右肾上腺静脉以向胆管插入支架。首先在胃十二指肠动脉分叉水平处结扎胆管。在结扎点近端的胆管前壁做一小切口，然后用左手持直显微镊夹住切口的前壁，右手持弯曲显微镊将支架插入胆管内。用6-0丝线固定支架。将线的一端在胆管处保留四毫米长度，以便在后续吻合时持线。通过结扎并切断门静脉与肠系膜上静脉及脾静脉的连接，游离门静脉；结扎并切断胃十二指肠动脉。然后从胰头至其根部游离肝总动脉。用棉签将肝脏向右旋转，并在准备操作结束时，解剖肝脏后方及食管周围的韧带。进行肝脏切除时，移除牵开器、用于剑突的蚊式止血钳以及置于大鼠背部下方的5毫升注射器。将肠管还纳至腹腔。通过阴茎静脉注射500 IU肝素钠溶于2毫升生理盐水中的溶液。约三分钟后，重新准备5毫升注射器、蚊式钳和牵开器，结扎肝总动脉起始部近端。将线的一端结扎，用于肝总动脉。在夹闭肝下腔静脉后较长时间进行操作。用蚊式钳夹靠近右肾静脉处。用一次性微型血管夹夹闭脾静脉残端下方的门静脉。切开门静脉前壁，插入18号导管至门静脉内。原位灌注60毫升冷组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐溶液至肝脏。在20厘米水柱的静水压力下，水立即切开膈膜、胸腔内下腔静脉以及肝下下腔静脉的前壁，使灌注液得以从肝脏中冲洗出来。用微血管夹在肝脏下方紧贴其下夹闭肝下下腔静脉。通过解剖肝下下腔静脉将肝脏切除。门静脉、膈肌、残留的韧带、右肾上腺静脉和肝总动脉。将切除的肝脏置于塑料盒内的金属杯中，塑料盒内装满碎冰，金属杯中盛有低温HTK溶液。在装有冰冻HTK溶液的金属杯中进行肝脏移植操作：将套管连接至门静脉时，用DeBakey血管夹夹住门静脉主干，并将该血管夹置于跨越金属杯的桥接位置。将门静脉穿过套管，并在12点钟位置用夹子再次夹住肝静脉及套管的延伸部分，将门静脉壁翻转至套管外，使脾静脉残端位于套管外侧的7点钟位置，并用6-0丝线固定门静脉，以便将支架插入肝动脉。用镊子夹住膈肌两侧边缘以固定肝脏，并用直型显微剪刀配合DeBakey血管夹夹住结扎线，将肝总动脉拉直。用左手在肝总动脉前壁做一小切口。用直显微镊夹住切口的前壁，右手将支架插入肝总动脉。使用弯显微镊，用6-0丝线固定支架，并保留线的一端剪断后的长度为4毫米。通过动脉导管用5毫升冷HTK溶液冲洗肝脏，用于50%肝切除术。首先用蚊式钳夹住后部坐标叶以固定其位置，然后用4-0丝线结扎其蒂部，并切除该叶。以相同方式去除前冠状叶。接着，将塑料盒旋转90度。夹住膈肌的右侧边缘和中叶的左侧部分。在左右内侧叶交界处的上缘做一小切口，结扎后切除左侧部分。使用4-0丝线结扎肝蒂后，切除左外侧叶，并用双极电凝钳仔细烧灼切除后的肝断面。此时肝脏体积已减少约50%，以便进行肝上腔静脉的成形术。首先，用蚊式钳夹住膈肌两侧边缘，固定肝脏位置。然后剪除对应部位的膈肌，修整肝上腔静脉的前壁。从外部向内部在两侧角部各放置一根7-0聚丙烯缝线，作为后续吻合用的固定缝线。随后，修剪肝上腔静脉的后壁。将肝脏移植物置于4°C的HTK溶液中，并在冷水浴中保存。以与供体手术类似的方式准备受体，经腹壁正中切口打开腹腔。将湿润的纱布垫置于十二指肠右侧及整个肠管上。为暴露肝下腔静脉的手术视野，将左外侧叶和方叶推入左侧膈下腔，并用湿润纱布垫将右外侧叶向上牵拉。用湿纱布和棉签分离下腔静脉与腹膜后组织韧带，并结扎切断右肾上腺静脉。将肝脏向左侧旋转，解剖肝脏背部周围的韧带。在胆囊管分支下方切断胆管。将线的一端保留结扎，用于结扎四毫米长的胆管，于距胃十二指肠动脉与肝固有动脉分支部位三毫米处结扎并切断胃十二指肠动脉和肝固有动脉，以在肝总动脉末端形成较宽的动脉结构。用金属微血管夹在右肾静脉上方夹闭肝下腔静脉，并用蚊式钳在肝脏门部水平夹闭门静脉分叉处。用外周血管夹夹闭肝上腔静脉及其周围的膈肌，并将该血管夹固定于一团油性黏土中。将异氟烷麻醉浓度降低至0.4体积百分比。通过解剖肝上腔静脉与肝脏交界处，切除受体原有的肝脏。门静脉位于蚊式钳钳口上方，肝下下腔静脉位于肝脏与右肾静脉之间中点稍下方。将肝脏移植物正位植入。血管重建是该手术过程中最困难且最重要的部分。必须非常仔细但迅速地进行，采用连续缝合方式吻合肝上腔静脉。使用附带的7-0聚丙烯缝线，从受体肝上腔静脉内部穿至外部，在移植物的右角处放置第一根固定缝线，然后以相同方式打结。在左角处放置第二根固定缝线。这将是连续缝合的起始缝线。为了扩大吻合口，使用DeBakey bulldog血管夹在两侧角轻轻向外上方牵引，固定并保持缝线张力。接下来，从左侧角开始，将缝线从移植物侧外壁穿入内壁，穿刺点靠近线结外侧，然后从腔内进行下腔静脉后壁缝合，采用7到8针连续缝合至右侧角。仔细缝合前几针，确保移植物侧血管内腔与受体侧血管内腔在右角处准确对合。将7-0聚丙烯缝线从移植物侧血管壁由内向外穿出。从外侧自右向左缝合前排缝合线，共约10针。用乳酸林格液冲洗管腔内部。为排除气泡，将最后一针缝合位置靠近固定缝线处，然后将两者打结。在门静脉重建过程中，使用微血管夹夹闭门静脉，并将蚊式钳固定于黏土中。随后，在蚊式钳钳口下方切开门静脉前壁。用乳酸林格液冲洗受体门静脉及套管内部。将套管插入门静脉，并用环形六零丝线固定。最后，恢复肝脏血流灌注。从大鼠背部取下5 mL注射器，并将异氟烷浓度增加至0.8体积百分比，以通过支架技术重建肝动脉。首先，用蚊式钳夹住正确肝动脉的缝线，并将其固定在黏土中。然后夹闭受体的肝总动脉。在肝总动脉末端Y形结构的分叉处做一个小切口，形成一个漏斗状开口。用弯头显微镊夹住置于移植物肝总动脉内的支架。将支架滑入受体肝总动脉，并用6-0丝线结扎固定，将该丝线的一端与移植物肝总动脉上的4毫米线段绑在一起，从而使两条肝总动脉相互靠近，降低吻合部位的张力。随后，以与吻合肝上腔静脉相同的方式，采用连续缝合技术吻合肝下腔静脉，但需使用更多针数且每针进针更精细。开放血管夹后，将麻醉浓度增加至1.0体积百分比，以进行胆管重建。用蚊式钳夹住受体胆管的缝线，并将其固定于黏土中。在适当位置的胆管上做一个小切口，以确保重建后的胆管长度适中。插入支架，并用6-0丝线固定。将此线与移植物胆管上的线结扎固定。现在，所有重建手术步骤均已完成。使用4-0连续Vicryl缝线逐层缝合腹部切口。手术结束后，立即通过皮下注射方式，给予受体大鼠球蛋白钠和布托啡诺，溶于总共1.5毫升的生理盐水溶液中进行治疗。将大鼠置于配备暖风和氧气供应的特殊重症监护笼中恢复60分钟，然后再将其移回普通笼子。所有受体大鼠均存活至计划实施安乐死的时间点，分别在门静脉再灌注后1、3、24和168小时采集血液样本。血清样本检测丙氨酸氨基转移酶水平，以评估移植后肝移植物肝细胞损伤的程度。如该图所示，LT 水平在 24 小时达到峰值，随后下降至 168 小时的正常范围内。观看本视频后，您应充分掌握如何在大鼠中实施部分肝叶肝移植，作为移植研究中可重复的实验模型。

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