Name: 1 F O (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学习从成年大鼠脑组织中分离富含F1FO ATP合酶复合物的亚线粒体囊泡，并通过膜片钳技术记录其通道活性。该方法为研究神经元线粒体能量代谢机制提供了可靠的实验手段。

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1. 脑线粒体分离（改编自 Brown M.R. 等人9）
<ol>
 <li>采用机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方法处死大鼠。</li>
 <li>通过断头法切除动物头部，切开皮肤并暴露颅骨。</li>
 <li>使用剪刀或咬骨钳小心切开颅骨，取出脑组织。</li>
 <li>将不含小脑的脑组织在分离缓冲液（见表1）中充分剪碎，并转移至5 ml玻璃/聚四氟乙烯匀浆器中（见设备清单）。</li>
 <li>轻轻匀浆组织10次（避免产生气泡），时间约为5分钟。</li>
 <li>在台式离心机中，4 °C条件下以1,500 × g离心10分钟。</li>
 <li>保留上清液（含线粒体和突触体），弃去沉淀（核成分和细胞碎片）。将上清液在台式离心机中，4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟。</li>
 <li>弃去上清液，将沉淀用500 μl分离缓冲液重悬。使用细胞破碎装置（见设备清单）破坏突触体，施加1,200 psi压力持续10分钟，随后迅速减压。</li>
 <li>将混合物铺在Ficoll梯度液上（见表2），放入SW-50.1转子，在超速离心机中4 °C条件下以126,500 × g离心20分钟。沉淀为纯化的线粒体，Ficoll不同密度之间的条带为未破坏的突触体。</li>
 <li>将沉淀用分离缓冲液在台式离心机中4 °C条件下以16,000 × g离心10分钟进行洗涤。</li>
</ol>
2. 线粒体亚微囊泡（SMV）的分离（改编自 Chan et al.10）
<ol>
 <li>将线粒体重新悬浮于 200 μl 分离缓冲液中，加入等体积的 1% 皂苷（digitonin），冰上静置 15 分钟。</li>
 <li>加入更多分离缓冲液，在台式离心机中于 4 °C 以 16,000 × g 离心 10 分钟。重复此步骤两次。</li>
 <li>将沉淀重新悬浮于 200 μl 分离缓冲液中，加入 2 μl 10% Lubrol PX (C12E9)。混匀后冰上静置 15 分钟。</li>
 <li>将混合物铺在分离缓冲液上，放入 SW-50.1 转子，在 4 °C 以 182,000 × g 离心 1 小时。</li>
 <li>将最终沉淀在分离缓冲液中于 4 °C 以 16,000 × g 在台式离心机中离心 10 分钟，进行洗涤。</li>
</ol>
3. 电生理记录
<ol>
 <li>典型的电生理实验装置包括一个放大器、一台配备 Digidata 1440A 模数转换器接口和 pClamp10.0 软件的 PC 计算机、操纵器、显微镜、隔振台以及法拉第笼。</li>
 <li>将硼硅酸盐玻璃毛细管插入 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪（型号 P-87）中。优化移液器拉制程序，以制备电阻在 80 至 100 MΩ 之间的移液器。</li>
 <li>将 SMV 置于生理细胞内溶液中（ATP 在记录过程中适当时间点添加）（表 3）。膜片钳移液器内填充相同溶液（不含 ATP）。在室温下对 SMV 形成吉欧姆封接进行记录。使用尼康或蔡司倒置显微镜通过相差显微镜观察囊泡。</li>
 <li>膜电位维持在 -100 mV 至 +100 mV 范围内的不同电压，持续时间为 10 秒。使用放大器电路将记录信号在 5 kHz 下进行滤波。成功的记录应实现杂散电噪声或非特异性噪声水平低于 1 pA。</li>
 <li>使用 Clampfit 10.0 软件分析数据，例如确定单通道事件的频率和幅度。通过绘制电流-电压关系曲线来确定电压依赖性。</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方法能够在不区分细胞表型的情况下，从全脑组织中分离出纯净的线粒体（步骤1结束时）以及亚线粒体囊泡（SMVs，步骤2之后）。如图1及我们先前的研究（Alavian KN et al.8）所示，通过本方法纯化的SMVs基本不含其他亚细胞器的污染，并且在冷冻前保持其结构和功能的完整性。冻融后的分离线粒体或SMVs可用于电生理记录和生物化学检测，但不适用于呼吸功能研究。
此外，该方法也可用于通过相同步骤从肝脏中分离线粒体。由于线粒体和小膜泡（SMVs）在接种至电生理记录室时容易形成聚集体，因此在加样时需特别注意，过度聚集或过度稀释均可能降低封接形成的概率。此外，在开始分离前应注意若干技术细节。必须使用洁净的工具并将其保持在冰上。所有操作均应在冰上进行，所有离心机应预冷至 4 °C。正确制备 Ficoll 梯度对实验成功至关重要。实现两种浓度 Ficoll 之间完美的分层可提高亚细胞组分的纯度。
该技术的一个局限性在于最终获得的蛋白质量可能较少，例如，若需...

<table><tbody><tr><td>带PTFE研杵的Potter-Elvehjem组织研磨器</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>4639 细胞破碎容器</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>SW-50.1 转子 </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-70M 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>皂苷（Digitonin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 型号 P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

f1fo atp酶囊泡制备及线粒体亚微囊泡膜膜片钳记录技术

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

线粒体参与多种重要的细胞功能，包括代谢、存活1、发育以及钙信号传导2。其中两个最重要的线粒体功能是通过氧化磷酸化高效产生三磷酸腺苷（ATP）——即细胞的能量货币，以及介导程序性细胞死亡的信号通路3。
主要负责ATP生成的酶是F1FO-ATP合酶，也称为ATP合酶4-5近年来，线粒体在细胞凋亡和坏死性死亡中的作用受到了广泛关注。在细胞凋亡过程中，BCL-2家族蛋白（如Bax）进入线粒体外膜，发生寡聚化并使外膜通透化，从而将促凋亡因子释放到细胞质中6在经典的坏死性细胞死亡中，例如神经元因缺血或兴奋性毒性所导致的死亡，线粒体基质内钙离子大量且缺乏调控地升高，会促进内膜上一种称为线粒体通透性转换孔（mPTP）的孔道开放。这会导致内膜去极化，并引发渗透压改变，进而促使外膜破裂、促凋亡因子释放以及代谢功能障碍。多种蛋白质，包括 Bcl-xL7 与F1FO ATP合酶相互作用，调节其功能。Bcl-xL直接与F1FO ATP合酶的β亚基相互作用，该相互作用可降低F1FO ATP合酶复合体内的质子漏导通，从而在F1FO ATP酶活性期间增加H+的净转运。8 从而提高线粒体效率。为了研究ATP合酶的活性及其调控机制，我们从啮齿类动物脑组织中分离出含有F1FO ATP酶的亚线粒体囊泡（SMVs）。这些SMVs保留了F1FO ATP酶的结构和功能完整性，如Alavian所示。 等. 本文介绍了一种我们已成功用于从大鼠脑组织中分离突触小泡膜囊泡（SMVs）的方法，并详细阐述了采用膜片钳技术分析SMVs通道活性（离子漏导电性）的实验步骤。

本方案的第一步可分离出纯化的线粒体，如图1中的Western blot结果所示。图2展示了一个来源于脑组织的亚线粒体囊泡（SMV）膜片钳记录示例。采用内面向外膜片构型，我们证明了通道活性可被ATP调节。对照组（CTL）记录（左侧）显示多电导通道活性，平均峰值电导为600 pS，在向浴液中加入1 mM ATP后，电导立即下降。ATP的整体效应是以浓度依赖的方式降低SMV膜片的电导。为了在分离后测定F1FO ATP酶的效率，我们检测了ATP水解所引发的H+离子向SMV内的转运，如图3所示，通过测量被排除在SMV外的H+指示剂ACMA荧光强度的降低来反映该过程。加入ATP后，SMV对ATP敏感的H+离子封存能力增强。该检测方法可用于评估H+离子封存的效率。功能较差的SMV积累H+离子的速度更慢，或达到的峰值更低。例如，Bcl-xL抑制剂和FCCP的加入会减弱H+离子的封存（Alavian et al., 2011）。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td fo:wid...

本文介绍了一种从大鼠脑组织中分离富含F1FO ATP合酶复合体的亚线粒体囊泡的方法。这些囊泡可用于通过膜片钳记录技术研究F1FO ATP酶复合体的活性及其调控机制。

F1FO ATP酶囊泡制备及线粒体亚微囊泡膜膜片钳记录技术

线粒体参与多种重要的细胞功能，包括代谢、存活1、发育以及钙信号传导2。其中两个最……

本实验的总体目标是从大鼠脑组织中分离出F1 F零APAs囊泡，以进行膜片钳记录。该过程首先从大鼠体内取出脑组织并进行匀浆处理；第二步是通过施加压力破坏突触区域。接下来，将突触体层析到离心管梯度上。最后一步是与毛地黄毒素和L共同孵育，以获得用于膜片钳记录的终末囊泡。线粒体的一个重要功能是通过氧化磷酸化产生ATP。负责 TP 生成的酶是位于线粒体内膜上的 ATP 合酶。为了深入研究 ATP 合酶的功能，我们分离出一种特殊的亚线粒体囊泡，称为 SMVs。这些囊泡中的 ATP 合酶呈内外翻转的构型。然后我们使用膜片钳电极记录这些线粒体膜电位（SMVs），并测定其膜的通透性。这可以反映线粒体产生TP的效率。今天演示该实验步骤的是耶鲁大学我实验室的博士后研究员 Sylvia ti。在此操作中，通过断头法获取大鼠头部后，切开皮肤以暴露颅骨，然后用剪刀或颅骨剪小心地切开颅骨。随后取出脑组织，剔除小脑后将脑组织切碎并进行分离，加入缓冲液，再将其轻柔转移至5毫升玻璃特氟龙匀浆器中，匀浆10次，总时间约5分钟。之后，在台式离心机中以1,500 × g于4°C离心10分钟。保留含有线粒体和突触体的上清液，弃去沉淀。然后在台式离心机中以16,000 × g、4°C离心10分钟。接着弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL分离缓冲液中，使用细胞破碎装置施加1,200 PSI压力处理10分钟以破坏突触体，随后迅速减压，将破碎后的突触组分分层加样至含有两种不同浓度Ficoll的离心管中，形成两层。接下来将试管放入SW 50.1转子中，在4°C条件下以126,500 × g离心20分钟。在超速离心机中，沉淀部分为纯化的线粒体，而不同密度的菲亚尔（fial）之间的层为未破裂的突触体。随后，将沉淀在分离缓冲液中以16,000 × g、4°C条件下在台式离心机中离心10分钟进行洗涤。然后，将线粒体重悬于200微升分离缓冲液中，并加入等体积的1%十二烷基麦芽糖苷（digitonin）。置于冰上15分钟。接着，加入更多裂解缓冲液，在4°C条件下以16,000 × g离心10分钟。重复此步骤两次，然后将沉淀重悬于200 µL裂解缓冲液中，加入2 µL 10% Lu bra, PX，混匀后置于冰上15分钟。随后，将混合物与分离缓冲液依次加入离心管中。将离心管置于 SSW 50.1 转子中，在 4°C 条件下以 182,000 ×g 离心 1 小时。离心 1 小时后。将最终的样品在隔离缓冲液中于4摄氏度下以16,000 × g离心10分钟进行洗涤。典型的电生理装置包括一个放大器、一台配备DigiData 1,440和模拟-数字转换器接口的PC计算机、P-Clamp 10.0软件、显微镜、隔振台以及法拉第笼。首先，使用火焰抛光的微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制出一根移液管。移液管的最佳电阻应在80至100兆

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<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subATP酶微囊的制备和表演膜片钳记录的Submitochondrial泡膜技术

本实验旨在介绍如何对非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞进行膜片钳记录，内容包括卵黄膜的去除、吉欧姆级封接（gigaseal）的形成，以及可选地将膜片转换为外翻式构型（outside-out...

在非洲爪蟾卵母细胞中表达的离子通道的膜片钳记录

使用膜片钳技术记录BK通道的离子电流。通过向非洲爪蟾卵母细胞Xenopus...

膜片钳与灌流技术在研究离子通道表达中的应用 非洲爪蟾 卵母细胞

本方案描述了一种称为全细胞膜片钳电生理的技术，该方法用于研究斑马鱼胚胎中 Mauthner...

全细胞膜片钳电生理学：一种研究神经元电学特性的方法

我们描述了一种通过在Xenopus卵母细胞中异源表达K+逆向转运P型ATP酶，并利用原子吸收分光光度法测定单个细胞对Rb+或Li+的摄取，从而定量该酶活性的方法。该方法是一种灵敏且安全的替代方案，可用于替代放射性同位素通量实验，有助于开展复杂的动力学研究。...

测量 Na,K-ATPase 和 H,K-ATPase 介导的阳离子转运 非洲爪蟾 通过原子吸收分光光度法检测卵母细胞：放射性同位素测定的替代方法

我们开发了一种完整的大脑-脊髓制备方法，可通过膜片钳记录技术从斑马鱼胚胎的Mauthner神经元及其他网状脊髓细胞中记录和监测电活动。因此，我们能够在发育中的胚胎内，对关键神经元的兴奋性和抑制性突触电流、电压门控通道活性以及动作电位进行记录。...

斑马鱼胚胎Mauthner细胞的膜片钳记录

展示了两种脱水-再水化方法——电形成法和凝胶辅助溶胀法，将跨膜蛋白KvAP重组到巨大单层囊泡（GUVs）中的过程。在这两种方法中，含有该蛋白的小区单层囊泡融合形成GUVs，随后可通过荧光显微镜和膜片钳电生理技术进行研究。...

将跨膜蛋白——电压门控离子通道KvAP——重组入巨大单层囊泡，用于显微镜与膜片钳研究

本文详细介绍了利用膜片钳技术测量线粒体内膜H+泄漏的主要步骤，这是一种研究线粒体产热能力的新方法。...

利用膜片钳技术研究线粒体产热能力

尽管近年来取得了进展，许多酵母线粒体蛋白的功能仍然完全未知。本方案提供了一种简单且可靠的方法来确定蛋白质的线粒体亚结构定位，这对于阐明其分子功能至关重要。...

酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 中线粒体亚结构蛋白定位的评估

该方法利用线粒体通透性转换孔对低电导质子漏的贡献，测定新生脆性X综合征小鼠心肌细胞线粒体辅酶Q含量升高情况下孔道开放的电压阈值，并与野生型对照小鼠进行比较。...

辅酶Q过量条件下线粒体通透性转换孔开放概率的评估

线粒体接触位点是与线粒体内膜和外膜蛋白相互作用的蛋白质复合物。这些位点对于线粒体膜之间的通讯至关重要，从而也介导了细胞质与线粒体基质之间的交流。本文描述了一种用于鉴定可能属于此类特定蛋白质的候选分子的方法。...

一种改进的线粒体接触位点分离方法

本方案详细介绍了一种利用手动内体-溶酶体膜片钳系统直接测量细胞内囊泡中离子通道活性的方法。我们阐述了该方法的具体步骤，包括扩大内体-溶酶体并手动分离这些囊泡。此方法可确保研究人员能够准确地重复并应用该实验流程。...

单个内吞溶酶体囊泡分析的膜片钳技术

学习从成年大鼠脑组织中分离富含F1FO ATP合酶复合物的亚线粒体囊泡，并通过膜片钳技术记录其通道活性。该方法为研究神经元线粒体能量代谢机制提供了可靠的实验手段。

F₁F_O ATP酶囊泡制备及线粒体亚微囊泡膜膜片钳记录技术

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