Name: 加速1型糖尿病感应在小鼠体内的过继转移致糖尿病的CD4 + T细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 了解通过过继转移致糖尿病性CD4+ T细胞在小鼠体内快速诱导1型糖尿病的方法。该方案可在两周内建立可靠的T1D模型，用于研究糖尿病发病机制和评估治疗干预策略。

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感谢 Robert Bonneau 博士和 Neil Christensen 博士提出的有益建议。	
本工作由宾夕法尼亚州立大学医学院基金资助。

1. 从BDC2.5小鼠脾脏和淋巴结中分离T细胞
<ol>
	<li>使用6周龄的糖尿病前期雌性BDC2.5小鼠作为致糖尿病性CD4+ T细胞的供体。小鼠应通过尿糖检测确认无糖尿病（见下文）。</li>
	<li>采用CO2窒息法处死每只小鼠，并在无菌条件下取出脾脏、腋窝和臂部淋巴结。取出脾脏时，先用70%乙醇浸湿毛发，然后剪开并牵拉皮肤。脾脏将呈现为小鼠左侧的暗红色器官。使用小剪刀在腹膜上做约1英寸的切口，用小镊子轻轻夹住脾脏中央部位。尽可能小心地修剪结缔组织和附着的脂肪，然后取出脾脏。</li>
	<li>将脾脏和淋巴结收集至含有10 ml杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的15 ml锥形管中，并置于冰上。</li>
	<li>使用无菌10 ml注射器活塞末端，将淋巴器官轻轻压过70 μm细胞筛网（每个筛网处理一个脾脏，或每筛网处理4–6个淋巴结），收集至同一个50 ml锥形管中，以制备单细胞悬液。</li>
</ol>
在操作过程中，用 1 ml DMEM 多次冲洗每个滤网，以最大程度回收滤网中的细胞。
<ol start="5">
	<li>将收集的细胞从50 ml锥形管转移至15 ml锥形管中，在室温下以300–400 × g离心7分钟。</li>
	<li>为裂解红细胞，弃去上清液，将细胞重悬于5 ml氯化铵-氯化钾（ACK）缓冲液（pH 7.2）中，并将ACK-细胞悬液在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>向ACK-细胞悬液中加入10 ml DMEM，按上述条件离心。用10 ml DMEM洗涤细胞沉淀一次。</li>
</ol>
2. 从BDC2.5小鼠中分离致糖尿病性CD4+ T细胞的荧光激活细胞分选
<ol>
	<li>用台盼蓝染色排除法，在5 ml FACS染色缓冲液中重悬细胞，并使用相差显微镜和血细胞计数板计数活细胞数量。</li>
	<li>使用FACS缓冲液将细胞悬液体积调整至5 × 107 细胞/ml。移除约 1 × 106 每项染色对照设置细胞（1 个不染色对照，3 个单染色对照）。在 15 ml 离心管中，使用抗 CD4（APC）、抗 TCR Vβ4（FITC）和抗 CD62L（PE）单克隆抗体（mAb）对非活化的转基因 CD4+ T 细胞样本进行染色。按照制造商推荐的单克隆抗体浓度，在 4 °C 避光条件下孵育 20–30 分钟完成细胞染色。</li>
	<li>用FACS缓冲液洗涤样本和单染对照 &gt;3倍染色反应体积。在300–400 × g离心试管，弃上清，用FACS缓冲液重悬细胞（1–2 × 107 细胞/ml用于分选样品，300 μl用于单染对照），置于冰上保存直至下一步操作。</li>
	<li>将细胞样品通过带有35 μm细胞筛网帽的离心管，以去除细胞团块。在细胞分选仪上由经过培训的操作员对CD4+TCR Vβ4+CD62L+细胞进行分选。将分选后的细胞收集至含有3 ml DMEM的15 ml离心管中。分选1.5 × 10⁶个细胞约需2.5–3小时，包括准备时间。8 细胞（来自3只供体小鼠的大致细胞数量）在分选速率为2 x 104 总事件数/秒。预期约为 2.5 × 106 每只小鼠经细胞分选后的非活化转基因CD4+ T细胞</li>
	<li>记录分选结束时分选细胞的绝对数量，于300–400 × g离心7分钟。弃去上清液，重悬细胞（2 × 106 细胞/ml）置于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（Mg2+/Ca2+ 用于过继性T细胞转移（free）</li>
</ol>
3. 来自BDC2.5小鼠的致糖尿病性CD4+ T细胞的过继转移
<ol>
	<li>使用 1 ml 注射器和 18-1½ 号针头，轻柔重悬经 FACS 纯化的 CD4+ T 细胞，并将细胞悬液转移至 1 ml 注射器中。注射前，将 18-1½ 号针头更换为 27½ 号针头。</li>
	<li>将 6–8 周龄的雌性 NOD.SCID 受体小鼠置于加热灯下，直至其出现理毛行为。</li>
	<li>将受体小鼠固定于固定器中，用 70% (v/v) 乙醇擦拭尾部，以消毒注射部位。</li>
	<li>将 1–2 × 106 个 FACS 分选的细胞/只小鼠（溶于不超过 500 μl 的 PBS 中）注射至任一侧尾静脉。</li>
</ol>
不要强行推动针栓。如果针头恰当地位于静脉内，注射时几乎不会遇到阻力。
4. 监测受体小鼠的高血糖和1型糖尿病
<ol>
	<li>在T细胞转移后的第五天开始，根据制造商的说明，每天使用试剂条（Bayer Diastix）监测NOD.SCID受体小鼠尿液中葡萄糖水平是否升高。连续两次尿糖读数&gt;250 mg/dl的小鼠被视为糖尿病小鼠。</li>
</ol>

<ol><li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+of+a+non-obese%2C+diabetic+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
<li>Delovitch, T. L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+mouse+as+a+model+of+autoimmune+diabetes%3A+immune+dysregulation+gets+the+NOD%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD.</a> Immunity. 7, 727-738 (1997).</li>
<li>Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+autoimmune+diabetes+mellitus+with+splenocytes+from+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice.</a> Diabetes. 35, 855-860 (1986).</li>
<li>Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+transfer+of+autoimmune+diabetes+from+diabetic+NOD+mice+to+healthy+neonates.+Requirement+for+both+L3T4%2B+and+Lyt-2%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells.</a> J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).</li>
<li>Haskins, K., McDuffie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+diabetes+in+young+NOD+mice+with+a+CD4%2B+islet-specific+T+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone.</a> Science. 249, 1433-1436 (1990).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice.+Relative+contributions+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy-1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors.</a> Diabetes. 42, 44-55 (1993).</li>
<li>Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+autoimmune+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse.</a> Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).</li>
<li>Serreze, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8%2B+cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li>
<li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+maintenance%2C+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines%2Fclones+from+the+nonobese+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li>
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<li>Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+when+T+cell+costimulatory+receptor+CTLA-4+must+be+engaged+to+dampen+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
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<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4%2B+Foxp3%2B+cells+in+BDC2.5NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li>
<li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+scid+mouse%3A+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li>
</ol>

所有小鼠均饲养于宾夕法尼亚州立大学医学院的特定病原体-free（SPF）设施中，饲养条件遵循宾夕法尼亚州立大学机构动物护理与使用委员会的指南。	
作者声明不存在任何竞争性经济利益。

通过将来自糖尿病NOD小鼠或携带致糖尿病T细胞克隆来源的T细胞受体（TCR）转基因小鼠的全脾细胞或T细胞亚群过继转移至受体小鼠，可诱导产生1型糖尿病（T1D），但效率存在差异。本文报道了一种可重复的方法：将经FACS纯化的BDC2.5转基因CD4+ T细胞中的CD62L+细胞转移至NOD.SCID小鼠，可在两周内以100%的发生率诱导受体小鼠产生T1D。
此处所述BDC2.5 T细胞转移模型的特定优势包括：与自发性糖尿病需数月时间相比，1型糖尿病（T1D）的诱导时间极短，且相较于致糖尿病性T细胞亚群或T细胞克隆介导的糖尿病转移通常所需的数周时间，该模型效率更高。此外，由于BDC2.5 T细胞具有高度均一性，仅需少量纯化的BDC2.5转基因T细胞即可高效且稳定地实现T1D转移。与其他某些T细胞转移方法不同， 体外 在我们的方案中，转导型BDC2.5 T细胞在转移前无需激活。我们这种单特异性T细胞转移方法的另一个优势在于，相较于使用异质性T细胞群体转移糖尿病的其他方案，可更特异性地研究干预胰岛抗原特异性T细胞向靶器官归巢的新型治疗策略。
<p class=...

NOD小鼠可自发产生自身免疫性糖尿病，已被广泛用作人类1型糖尿病（T1D）的动物模型1,21型糖尿病在NOD小鼠中的发病机制特征表现为，从3-4周龄开始，树突状细胞和巨噬细胞浸润胰岛，随后T细胞和B细胞也相继浸润。这一非破坏性胰岛周围炎阶段导致胰岛素生成性胰腺β细胞缓慢而进行性地被破坏，最终在4-6月龄时发展为明显的糖尿病。3脾细胞转移4,5，CD4+6,7 或 CD8+8,9 已发现，来自糖尿病NOD小鼠的T细胞可在免疫缺陷的NOD小鼠中介导糖尿病的发生，表明胰岛反应性T细胞在1型糖尿病（T1D）发病机制中起核心作用。在这些研究中，受体小鼠的糖尿病发展过程较缓慢，通常需数周时间，具体取决于实验条件。类似地，已有报道显示，通过耗时且成本较高的培养方法获得的多种致糖尿病T细胞克隆，在转移至受体小鼠后数周内也可介导糖尿病的发生。7,10随着表达源自CD4或CD8限制性致糖尿病T细胞克隆的TCR转基因小鼠的出现，多家实验室随后证实，此类小鼠的脾脏T细胞能够将糖尿病转移至受体动物11-13具体而言，BDC2.5 NOD 小鼠是转染了 BDC2.5 TCR 基因的转基因小鼠，该 TCR 特异性识别胰腺β细胞中的嗜铬粒蛋白 A（chromogranin A）14-16转移 体外-激活或未激活的来自明显糖尿病或糖尿病前期BDC2.5小鼠的全脾细胞或分选脾细胞，以不同的效率将糖尿病转移至新生或免疫缺陷型NOD小鼠11,17-19.
我们描述了一种简单的方法，利用来自糖尿病前期BDC2.5小鼠的纯化转基因CD4+ T细胞，以高效率和高一致性在受体小鼠中诱导1型糖尿病（T1D）。通过荧光激活细胞分选（FACS）从这些小鼠中分离出大量初始状态、针对胰岛抗原的CD4+ T细胞，这些细胞为CD4+CD62L+且表达转基因T细胞受体Vβ4链。将纯化的转基因T细胞在未活化的状态下转移至NOD.SCID小鼠体内，后者缺乏功能性T细胞和B细胞，且无胰岛炎和糖尿病表现20。在T细胞转移后两周内，受体小鼠迅速发展为T1D，通过监测尿液中葡萄糖浓度升高来判断疾病的发生。
与其他转移具有异质性特异性的致糖尿病T细胞的方法相比，我们的方案使用经FACS分选的CD4+ T细胞，这些细胞几乎 exclusively 表达致糖尿病的BDC2.5 TCR。由于其高度均一性，仅需转移少量T细胞（约1×106 个细胞/小鼠），即可在2周内以100%发病率快速诱导1型糖尿病（T1D）。本方案的另一优势在于，与某些其他方法不同，无需对受体小鼠进行辐照处理。该方法的一个潜在局限性在于，无法研究CD4和CD8 T细胞亚群，或特异性CD8 T细胞在糖尿病发生中的作用。
本方案将有助于研究由初始的单特异性CD4+ T细胞介导的1型糖尿病快速发病机制，以及干预胰岛抗原特异性Th细胞向靶器官归巢的治疗策略。

<table><tbody><tr><td>BDC 2.5 TCR 转基因 NOD 小鼠（NOD.Cg-Tg(Tcr&amp;alpha;BDC 2.5，Tcr&amp;#946;BDC 2.5</td><td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>NOD.SCID 小鼠 (NOD.CB17-&lt;em&gt;Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Bayer Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术镊</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌小型剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌大号剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m细胞滤筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m 细胞滤筛帽管</td><td>BD生物科学</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵-氯化钾（ACK）缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.15 M NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl, 1 mM KHCO₃&lt;sub&gt;3, &lt;/sub&gt;0.1 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA，pH 7.2，溶于 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>BD FACSFlow™ 鞘液</td><td>BD 生物科学</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS 染色缓冲液</td><td></td><td></td><td>PBS、0.2 mM EDTA、0.5% BSA/FCS，滤膜除菌</td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CD4（APC）单克隆抗体</td><td>Biolegend</td><td>1005616</td><td>克隆 RM4-5</td></tr><tr><td>抗TCR V&amp;#946;4（FITC）单克隆抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>553365</td><td>克隆 KT4</td></tr><tr><td>抗CD62L（PE）单克隆抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>553151</td><td>克隆 MEL-14</td></tr><tr><td>细胞分选仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; BD FACSAria III</td></tr><tr><td>加热灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>18-1&amp;frac12; 规格针头（无菌）</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&amp;frac12; 规格针头（无菌）</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

通过过继性转移致糖尿病性cd4+ t细胞在小鼠中加速诱导1型糖尿病

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠在出生12周后会自发发展为自身免疫性糖尿病，是目前研究最广泛的人类1型糖尿病（T1D）动物模型。通过对经照射的受体小鼠进行细胞转移研究，已证实T细胞在该模型T1D发病机制中起关键作用。本文介绍一种简便的方法，通过将来自糖尿病前期、表达胰岛特异性T细胞受体（TCR）BDC2.5转基因NOD小鼠的纯化初级CD4+ T细胞过继转移至NOD.SCID受体小鼠，可快速诱导T1D。该技术的主要优势在于：分离和过继转移致糖尿病T细胞可在同一天内完成，无需对受体小鼠进行照射，且在T细胞转移后2周内即可诱发高发病率的T1D。因此，与依赖来自糖尿病NOD小鼠的异质性T细胞群体或克隆的方法相比，本方法可更快速地开展T1D发病机制及治疗干预的研究。

我们的结果表明，分离出了表达CD62L的转基因BDC2.5细胞，而CD62L对T细胞归巢至次级淋巴器官（如胰腺淋巴结）至关重要。我们的研究结果进一步证明，这种单特异性T细胞群体能够快速且高效地将1型糖尿病（T1D）转移至NOD.SCID受体小鼠。
从BDC2.5小鼠中分离致糖尿病性CD4+ T细胞的过程如图2所示。每只供体小鼠在细胞分选前可获得约5 × 107个来自脾脏和淋巴结的混合细胞。根据所示的设门策略，经流式细胞分选后，每只BDC2.5供体小鼠可获得约2.5 × 106个初始型转基因CD4+ T细胞（CD4+TCR Vβ4+ CD62L+）。
与预期一致，从BDC2.5供体小鼠转移少量CD4+TCR Vβ4+CD62L+细胞（约1 × 106 个细胞/只小鼠）可在11天内使全部NOD.SCID受体小鼠发生1型糖尿病（T1D，发病率为100%），依据为尿糖水平升高（图3）。相比之下，转移异质...

我们提供了一种可重复的方法，通过过继转移针对胰岛抗原的特异性初级 CD4+ T 细胞，在两周内诱导小鼠产生 1 型糖尿病（T1D）。

通过过继性转移致糖尿病性CD4+ T细胞在小鼠中加速诱导1型糖尿病

非肥胖糖尿病（NOD）小鼠在出生12周后会自发地发生自身免疫性糖尿病，是目前研究最为广泛的糖尿病动物模型之一。

本实验的总体目标是通过将转基因小鼠的致糖尿病T细胞转移至缺乏内源性T细胞和B细胞的小鼠体内，快速诱导小鼠产生1型糖尿病。首先，从小鼠供体中分离脾脏和淋巴结，并纯化CD4阳性T细胞。随后，将纯化的供体T细胞过继性转移至非肥胖型糖尿病严重联合免疫缺陷受体小鼠体内。然后监测受体小鼠的1型糖尿病发生情况。最终，该方案可用于研究糖尿病的发病机制，并可用于探究治疗干预措施。与其他方法相比，将BDC 2.5 CD4阳性T细胞转移至非辐射预处理受体小鼠这一技术的主要优势在于能够快速且可重复地诱导1型糖尿病的发生。对于致糖尿病性 CD4 阳性 T 细胞的供体，使用经尿液葡萄糖检测确认无糖尿病的 6 周龄雌性糖尿病易感 BDC2.5 小鼠。摘除脾脏和淋巴结时，先用 70% 乙醇浸湿毛发，然后剪开皮肤并将其向后剥离，直至前肢肌肉暴露。在前肢基部附近，每侧应可见两个淋巴结。用小镊子小心夹住每个淋巴节点，修剪周围结缔组织以将其移除。接下来，使用小剪刀在腹膜上做一个一英寸长的切口。现在轻轻抓住脾脏的中部，仔细修剪掉结缔组织及附着的脂肪。然后将脾脏、脂肪组织以及淋巴结置于冰上含有10毫升DMEM的容器中。用无菌10毫升注射器活塞末端轻轻将淋巴器官组织通过70微米细胞滤筛，以获得单细胞悬液。用一毫升 DMEM 多次冲洗每个滤器，以最大程度回收细胞。然后将收集的细胞转移至一个 15 毫升的锥形管中，在室温下以 400 ×g 离心 7 分钟。随后在细胞沉淀中加入 3 毫升 CK 缓冲液并重悬细胞。室温孵育5分钟。为裂解红细胞，加入12毫升DMEM，通过离心沉淀细胞。用10毫升DMEM洗涤细胞沉淀一次。接下来，将细胞悬浮于5 mL染色缓冲液中，使用相差显微镜和血细胞计数器对活细胞数量进行计数。每种染色对照取约1 × 10⁶个细胞。同时，使用小鼠单克隆抗体对细胞进行染色，以分选未活化的转基因CD4阳性T细胞。将所有样品置于 4°C 避光孵育 30 分钟。随后用三倍染色体积的 fax 缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于 fax 缓冲液中，分选样品的细胞浓度为每毫升 1×10⁷ 至 2×10⁷ 个细胞，单染对照为 300 µL。接下来，将细胞样品通过带有 35 µm 细胞滤网帽的离心管过滤。为去除细胞团块，需在经过培训的操作人员协助下，使用细胞分选仪对样品进行处理。整个过程（包括仪器准备时间）预计需要约三小时，以分选大约1.5×10⁸个总数的转基因初始CD4阳性T细胞。每只小鼠可获得约2.5×10⁶个细胞，分选速率为每秒约2×10⁴个事件，适用于BD Fox Aria等仪器。将分选后的细胞收集至3 mL DMEM中。记录分选细胞的绝对数量，并以400 × g离心七分钟。将细胞沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液中，用于过继性T细胞转移。使用1 mL注射器和18号针头，轻柔地重悬经fax纯化的CD4阳性T细胞。用1毫升注射器吸取细胞悬液，然后安装27½号针头备用。固定接受移植的小鼠，用70%乙醇擦拭其尾部以消毒注射部位。随后将每只小鼠接种1×10⁶个纯化的CD4阳性T细胞，注射至尾部侧静脉之一。进行尾静脉注射时，切勿用力推动针栓。如果针头确实在静脉内，注射时几乎不会遇到阻力。在T细胞转移后的第五天开始，每天监测受体小鼠是否出现1型糖尿病症状。根据试剂制造商的说明，使用试剂条检测尿液中的葡萄糖含量。请注意，若小鼠连续两次尿液葡萄糖读数超过每分升250毫克，则视为糖尿病。在典型实验中，每只BDC 2.5供体小鼠在细胞分选后可获得约2.5 × 10⁶个未受刺激的转基因CD4阳性T细胞；在过继转移致糖尿病的CD4阳性T细胞后，需监测小鼠的尿液葡萄糖浓度。少量来自BDC 2.5供体小鼠的细胞过继转移可在第11天使所有非免疫排斥受体小鼠全部诱发1型糖尿病。操作得当的情况下，该技术从器官 harvesting 到T细胞转移可在约8小时内完成。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

加速1型糖尿病感应在小鼠体内的过继转移致糖尿病的CD4 + T细胞

本方案旨在小鼠肾包膜下清晰、简便地移植胰岛或细胞。细胞在最终用于移植的导管中被浓缩成团。该技术操作简便，可减少对细胞和小鼠造成的应激损伤。...

将胰岛移植到糖尿病小鼠的肾包膜下

我们描述了通过使用辅助依赖型腺病毒载体（HDAd）将Neurogenin3（Ngn3）和Betacellulin（Btc）基因转移至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠体内，从而诱导肝脏中新生胰岛的形成，并实现高血糖的逆转。本方法利用了辅助依赖型腺病毒载体在体内高效转导以及外源基因持久表达的优势。...

通过辅助依赖型腺病毒载体介导的基因转移在糖尿病小鼠肝脏中形成新胰岛

本视频展示了一种基于成像的方法，用于可视化将表达荧光素酶的β细胞移植到非肥胖型糖尿病免疫缺陷小鼠体内。通过引入糖尿病小鼠的脾细胞，可导致β细胞进行性破坏，加入底物后发光信号逐渐减弱，可直观确认该过程。...

在经糖尿病型脾细胞攻击的免疫缺陷小鼠中成像转基因β细胞

本文介绍了一种通过将同基因型CD4+CD45RBhigh...

通过将效应性CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。...

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

我们描述了一种在BALB/c小鼠中建立的体内免疫、可转化的肝炎模型，可用于研究药物诱导的自身免疫性肝炎的发病机制，包括该疾病中观察到的性别差异。我们将阐述如何利用该模型通过体内和体外实验技术实现可重复的分析。...

在BALB/c小鼠中诱导药物诱导型自身免疫性肝炎以研究其致病机制

本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8...

用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

本方案描述了一种针对肠道微生物群抗原特异性T细胞的过继转移结肠炎模型。从CBir1 TCR转基因小鼠中分离CD4+...

通过将CBir1 TCR转基因CD4+ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导肠道炎症

本方案描述了一种简单且微创的方法，用于在非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷小鼠体内移植并成像NIT-1细胞，这些小鼠经来自自发性糖尿病NOD小鼠的纯化脾细胞攻击后建立疾病模型。...

生物发光监测小鼠过继转移自身免疫性糖尿病模型中的移植物存活

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

了解通过过继转移致糖尿病性CD4+ T细胞在小鼠体内快速诱导1型糖尿病的方法。该方案可在两周内建立可靠的T1D模型，用于研究糖尿病发病机制和评估治疗干预策略。

通过过继性转移致糖尿病性CD4+ T细胞在小鼠中加速诱导1型糖尿病

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