Name: Genetische Manipulatie in Δku80 Stammen voor Functionele genomische analyse van Toxoplasma gondii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Leer gerichte genvervanging in Toxoplasma gondii met behulp van Δku80-stammen en homologe recombinatie. Deze methode maakt efficiënte genedeleties en functionele genomische analyses mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH naar DJB (AI041930, AI073142, AI075931 en AI091461).

<ol><li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li>
<li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li>
<li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5%27-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li>
<li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+the+model+apicomplexan%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li>
<li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToxoDB%3A+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+research%22%5BJournal%5D)">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma%3A+the+next+100+years%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li>
<li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).</li>
<li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3%2C+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li>
<li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li>
<li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li>
<li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Pathog%22%5BJournal%5D)">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007(2011).</li>
<li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li>
<li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+tagging%2C+cloning%2C+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii%3A+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li>
<li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li>
<li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li>
<li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+%27intracellular%27+buffer+increases+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li>
<li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+%28TgAMA1%29+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Hier bieden we een protocol voor een efficiënte gen-targeting in Δ Ku80 parasietenstammen om de doeltreffende inning van genetisch gemanipuleerde nageslacht dat gerichte gendeleties, gen vervangingen en / of gelabeld genen bezitten stellen. De sequentiële uitvoering van deze werkwijzen een betrouwbare benadering voor de isolatie van mutanten parasiet die een of meer gerichte genetische manipulaties 1-3 bevatten. Terwijl de generatie van een gerichte deletie afhankelijk van meerdere factoren, het gebruik van de Δ Ku80 stam met de voorgestelde strategie en protocol verhoogt de efficiëntie en het gemak van het maken exact gedefinieerde mutante stammen van T. gondii voor functionele genomische studies. Het genoom van T. gondii tijdens aseksuele stadia wordt haploïde. Dus een overweging te maken bij het ​​plannen van een gen te verwijderen is dat het gen niet essentieel in vitro moeten zijn. Niettemin, de efficiëntie van targeting gen knockouts in Δ Ku80 stammen is extreem hoog, en dit maakt de isolatie van mutante stammen met een ernstig verminderde replicatie tarieven. Wanneer een gerichte gen essentieel, parasieten vaak langer repliceren tijdens de selectie. Een andere belangrijke factor bij gerichte genetische manipulatie perfecte homologie ten minste 620 bp van het genomische gerichte flank moet detecteerbare gerichte integratie te verkrijgen 2. Langere homologiegebieden geven hogere efficiënties van targeting en targeting DNA flanken van ongeveer 1000 bp is een betrouwbare en efficiënte benadering 1-4. Daarom is het belangrijk dat genomic richten flanken worden gegenereerd uit dezelfde stam van T. gondii (RH, Pru) als de spanning die wordt genetisch gemanipuleerd. Onvoldoende homologie kunnen vaak leiden tot de gerichte integratie van een genomische gerichte flank, maar niet de andere. Onvolledige integratie of het uitblijven van een knock-out ma verkrijgeny ook te wijten zijn aan episomal doorzettingsvermogen. Onmiddellijk na transfectie alle targeting moleculen niet-geïntegreerde episomen, en soms richtmoleculen kunnen aanhouden als episomen vele generaties. Met behulp van doel-DNA flanken van ~ 1 Kbp en blijven parasieten voorafgaand aan re-subkloning rijdt onder selectie vaak lost problemen in verband met episomal doorzettingsvermogen. Zodra een knock-out wordt gevalideerd en de HXGPRT marker wordt verwijderd, kan de gene targeting strategie worden herhaald op een tweede Indiase overheid om meerdere gendeleties genereren in een enkele parasiet stam 1-3. Het genereren van deleties, vervangingen of gelabeld genen kunnen ook worden bereikt door verschillende selecteerbare merkers (bleomycine, CAT, pyrimethamine resistente DHFR, etc.). Hoewel de CAT selecteerbare merker momenteel aanwezig is in het type II Δ Ku80 Pru genoom 1 is, kan deze markering worden verwijderd met behulp van de HXGPRT </em&gt; selectie hier beschreven protocol. In onze handen, HXGPRT selectie is de veiligste en meest efficiënte marker met het hoogste rendement richten wanneer een losse gerichte insertie voldoende robuust selectie van MPA + X medium. HXGPRT mede het enige nog nuttige benadering voor gerichte deletie van een selecteerbare merker (figuur 3) met 6-thioxanthine (6TX) selectie 2,3. Dit protocol voorziet dus de enige huidige aanpak voor het ontwikkelen van bepaalde mutantstammen met diverse gerichte genetische manipulaties. Dit protocol biedt een waardevolle en efficiënte methode voor gerichte genetische manipulatie in Δ Ku80 stammen van Toxoplasma gondii en is van toepassing op de analyse van een enkel gen, een familie van genen, of genoom-brede functionele genomische studies. Vóór de beschikbaarheid van Δ Ku80 stammen 1,2, deze benaderingen niet sterk is wegens de ineiciëntie van deze methoden. Bijgevolg is dit protocol is breed toepasbaar voor gerichte genetische manipulatie van Toxoplasma gondii en is toegankelijk voor alle onderzoekers geïnteresseerd zijn in het aanpakken van een reeks vragen op parasiet biologie, gastheer respons, en functionele genomica.

Toxoplasma gondii is een obligate intracellulaire protozoaire voorkomende parasiet die vaak en chronisch infecteert een breed scala aan dieren en mensen 5. Er wordt geschat dat meer dan 1 miljard mensen zijn en chronisch besmet met deze ziekteverwekker. Naast het belang van ziekte veroorzaakt door T. gondii infectie, de toenemende beschikbaarheid van experimentele instrumenten, krachtige genomics middelen 6, het gemak van in vitro groei en uitstekende muismodellen T. gemaakt gondii een toonaangevende modelsysteem voor de bredere studie van intracellulaire eukaryote pathogenen en andere belangrijke apicomplexa parasieten die verwoestende ziekten zoals malaria (Plasmodium sp.) en Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7 veroorzaken. Een belangrijke beperking van Toxoplasma gondii als modelorganisme is de inefficiënte herstel van nageslacht dat carry gerichte genetische manipulaties. Deze problematischem gene targeting door een lage frequentie van homologe recombinatie opzichte van het hoge frequentie van homologe recombinatie in wild-type stammen van T. gondii zelfs wanneer uitgebreide DNA homologie wordt in DNA doelmoleculen gebruikt in genetische studies 2. We hebben onlangs genetisch blokkeerde de belangrijkste route van homologe recombinatie in type I en type II stammen van Toxoplasma gondii door verwijderen van het gen dat voor het eiwit Ku80 1,2. De resulterende type I en type II Δ Ku80 stammen vertonen normale groeisnelheid, grootte en de werking zowel in vitro als in vivo tijdens tachyzoite en bradyzoite Stadium vitro en in vivo, maar deze stammen vertonen in wezen een 100% frequentie van homologe recombinatie en dit fenotype verhoogt de kans op snel isoleren gewenste nakomelingen van gerichte genetische manipulaties van enkele honderden tot enkele thoUSand-voudige 1,2,4. Recente community-breed gebruik van type I en type II Δ Ku80 stammen is aanzienlijk opgevoerd tot het tempo, het ras, evenals de mate van succes van doelgerichte genetische benaderingen in T. gondii 1-4,8-13. Hier een uitgebreid protocol voor gerichte gendeletie, genvervanging, en gen-tagging in Δ Ku80 stammen van T. beschrijven we gondii. We laten zien hoe het ontwerpen en betrouwbaar richten genetische manipulaties om specifieke genen of genetische loci in Δ Ku80 stammen van Toxoplasma gondii.

<table><tbody><tr><td>Overlap Primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td></tr><tr><td>Validation Primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>100 nmole DNA Oligo</td></tr><tr><td>Yeast Strain #90845</td><td>ATCC</td><td></td><td>Designation FY834</td></tr><tr><td>Shuttle Vector pRS416</td><td>ATCC</td><td>87521</td><td></td></tr><tr><td>DH10B E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>12033-015</td><td>SOC bouillon in kit met E. coli</td></tr><tr><td>Resuspensiebuffer</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Glasperken</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-BG05</td><td>0,5 mm zuurgewassen</td></tr><tr><td>Qiacube geautomatiseerde robotwerkstation</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporatiecuvet</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>2 mm-opening</td></tr><tr><td>BTX600 electroporator</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>25 cm2 Canted halsplugafdichtingsfles</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Canted halsplugafdichtingsfles</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cellen</td><td>ATCC</td><td>SCRC1041</td><td></td></tr><tr><td>Swin-lok Filterhouder</td><td>Whatman</td><td>420200</td><td>25-mm-diameter</td></tr><tr><td>Membraan</td><td>Whatman</td><td>110612</td><td>Nucleopore Track-etched Membraan 3 mm poriëngrootte, 25-mm-diameter</td></tr><tr><td>Mycofenolaatzuur (MPA)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xanthine (X)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well weefselkweekbakje</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well weefselkweekbakje</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle Media</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>12-611F</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Gibco</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimyoticum (Anti-Anti)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Spinkolom</td><td>Primm Labs</td><td>PAE-100</td><td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-thioxanthine</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefsel DNA Minikit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td></tr><tr><td>Weefselkweek vries-/herstelmedia</td><td>Gibco</td><td>126-48-010</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>minus calcium, minus magnesium</td></tr></tbody></table>

genetische manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; stammen voor functionele genomische analyse van<em&gt; toxoplasma gondii</em

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Gerichte genetische manipulatie met behulp van homologe recombinatie is de methode van keuze voor functionele genomische analyse van een gedetailleerde weergave van gen-functie en fenotype (s) te verkrijgen. De ontwikkeling van mutante stammen met gerichte gendeleties gerichte mutaties, aangevuld genfunctie en / of gelabeld genen biedt krachtige strategieën om genfunctie te pakken, met name als deze genetische manipulaties efficiënt kunnen worden gericht op het gen locus plaats middels integratie gemedieerd door dubbel cross over homologe recombinatie. Vanwege de zeer hoge homologe recombinatie, functionele genomische analyse van Toxoplasma gondii is eerder beperkt door de afwezigheid van efficiënte werkwijzen voor het richten gendeleties en gen vervangingen specifieke genetische loci. Onlangs hebben we schafte de belangrijkste route van homologe recombinatie in type I en type II stammen van T. gondii door het schrappen van het gen encoding de Ku80 eiwit 1,2. De Δku80 stammen zich normaliter in tachyzoite (acute) en bradyzoite (chronische) Stadium vitro en in vivo vertonen en in wezen een 100% frequentie van homologe recombinatie. De Δ Ku80 stammen maken functionele genomische studies haalbaar op de enkel gen, alsmede op het genoom schaal 1-4. Hier rapporteren we methoden voor het gebruik van type I en type II Δku80Δhxgprt stammen te gentargeting benaderingen in T. vooruit gondii. We schetsen efficiënte methoden voor het genereren van gendeleties, gen vervangingen, en gelabeld genen door gerichte insertie of deletie van het hypoxanthine-xanthine-guanine fosforibosyltransferase (HXGPRT) selecteerbare merker. De beschreven gerichte mutagenese protocol kan worden gebruikt in een verscheidenheid van manieren Δku80 stammen functionele analyse van de parasiet genoom bevorderen en enkele stammen die dragen ontwikkelenmeerdere gerichte genetische manipulaties. De toepassing van deze genetische methode en volgende fenotypische testen onthullen fundamentele en unieke aspecten van de biologie van T. gondii en aanverwante belangrijke humane pathogenen die malaria (Plasmodium sp.) en cryptosporidiosis (Cryptosporidium) veroorzaken.

Een gedetailleerde template voorzien voor het construeren van een targeting plasmide een gen te verwijderen, met de plaatsing van restrictie-enzymplaatsen en het genereren van de primers die vergemakkelijken genetische richten en validatie van gen targeting, en plasmide constructie voor de daaropvolgende verwijdering van HXGPRT in een single-stap-proces (figuren 1A-C, Figuur 2A, figuur 3A). Een algemeen schema is weergegeven voor het maken van een gerichte gen deletie (figuur 2A), de primerparen gebruikt voor het verwijderen van een knockout valideren, worden bijvoorbeeld type I ROP18 (figuur 2B), en de representatieve resultaten van de PCR validatie (Figuur 2C). Deze vertegenwoordiger resultaat wordt het bereik van de resultaten die zijn te verkrijgen op genetische loci die relatief moeilijk doel te illustreren. Een succesvol gerichte gen deletie resulteert in de afwezigheid van het gen inlangstelling PCR product (PCR 1), de aanwezigheid van de 3&#39;genomische targeting flank (PCR2), en de aanwezigheid van de selecteerbare merker HXGPRT goed geïntegreerd tussen de 5 &#39;en 3&#39; genomic gericht flanken de deletie define (PCR3 en pCR4) . Klonen 3, 4, 5, 6, 8, 9 en 11 worden gevalideerd gericht genschrappingen (knockouts) indien HXGPRT vervangt het GOI (figuur 2C). Een kloon die een gen deletie niet bevat kan worden weergegeven door verschillende bandenpatronen. Meestal zal een kloon zonder gendeletie de ouderstam (ouderlijk patroon) spiegel met banden waargenomen voor PCR1 en PCR2, maar niet PCR3 of pCR4 gezien op klonen 1 en 2 (figuur 2C). Deze &quot;ouderlijke patroon&quot; komt voort uit een paar mogelijke mechanismen. Af en toe, MPA bestand geselecteerd parasieten dragen nonintegrated aanhoudende episomen van de pΔGOI targeting plasmide, en merken we op dat de aanhoudende selectie dwingt vaak deze episomente integreren. We zien ook zeldzame achtergrond van type I Δ Ku80 stam door onbedoelde integratie van de pΔGOI targeting plasmide dat een cDNA expressie HXGPRT via DHFR 5 &#39;en 3&#39; promoter elementen, in hetzij de DHFR locus of in de gedeeltelijk verwijderde HXGPRT bevat locus 14. Hoewel deze zeldzame gebeurtenis is een gerichte integratie, het niet de beoogde integratie en dient als een belangrijk punt om te onthouden in het ontwerpen van een gen vervangingsstrategie. DNA-homologie van meer dan 120 bp uitgevoerd op uw pΔGOI targeting plasmide kan zorgen voor een alternatieve locatie voor de recombinatie in Δ Ku80 stammen 2 die terug kon geven een ongewenste achtergrond. In het type II Pru Δ Ku80 stam deze achtergrond wordt verminderd of onbestaand vergeleken met type I omdat HXGPRT selecteerbare marker is gebaseerd op type I-sequenties die nucleotide polymorfismen in vergelijking met type II DNA datvermindert dit zeldzame achtergrond in experimenten met het type II Pru Δ Ku80 stam 1. Als een gen locus is van essentieel belang (kunnen niet worden verwijderd), of heeft een extreem lage gentargeting frequentie op de locus of als aanhoudende [nonintegrated] episomen zijn niet gemakkelijk geëlimineerd via groei en selectie, zal deze ouderlijke patroon het patroon waargenomen in MPA domineren resistente klonen. Alternatief wordt de richtende DNA molecule soms waargenomen wordt geïntegreerd op alleen de 5 &#39;of 3&#39; genomic gericht flank en een band wordt waargenomen voor zowel PCR3 of pCR4 (maar niet beide) met PCR1 en PCR2 gezien voor kloon 10 (5 &#39;integratie) en kloon 7 (3&#39; integratie) (figuur 2C). Deze patronen suggereren het zeldzame optreden van een kruis over integratie van het doel richtend plasmide op de locus die HXGPRT integreert maar doelgerichte integratie wordt het gen van belang niet verwijderen. Dit patroon (lanen 7 &amp; 10 in figuur 2C) emphasizes de noodzaak PCR gegevens aan te gaan of gerichte integratie plaatsvond in plaats van een enkele homologe oversteken en een tweede homologe integratie van het doel richtend molecuul. Zelden zien we een genetische mix vertegenwoordigd door kloon 12 (figuur 2C) dat zowel een ouderlijke patroon en een gerichte verwijdering patroon vertegenwoordigt. Dit patroon ontstaat waarschijnlijk bij gelegenheid van twee genotypen parasiet die zich op dezelfde locatie in een kloneringsvector goed zijn. Een algemeen schema voor het verwijderen van HXGPRT van Δ ku80Δgoi :: HXGPRT aan HXGPRT van de stam verwijderd wordt (Figuur 3A). Het primerpaar gebruikt voor de verwijdering van HXGPRT valideren van Ku80 Δ Δ gra2 :: HXGPRT (figuur 3B) amplificeert een unieke ~ 1,2 kb band in PCR5 gezien in klonen 4, 7, 9, 11 en 12 (figuur 3C). Als HXGPRT niet uit de locus, een ~ 3.4 Kbp band wordt waargenomen (klonen 1, 2, 3, 6, 8, 10, en de ouderlijke controle). Verschillende mechanismen handelen om de verwijdering van HXGPRT (6TX selectie) uitdagender en minder efficiënt dan de integratie van HXGPRT (MPA + X keuze) te maken. MPA selectie is gewoon efficiënter dan 6TX selectie 14,16. Bovendien zijn hogere HXGPRT expressie nodig voor 6TX selectie dan MPA selecties 16,24. Derhalve kunnen mutaties die HXGPRT enzymactiviteit of epigenetische mutaties of veranderingen die het expressieniveau van HXGPRT te verminderen bij locus een gen kan verminderen mogelijk de efficiëntie van 6TX selectie schaffen. Zelfs met deze uitdagingen van 6TX selectie, het slagingspercentage van 6TX selectie in Δ Ku80 stammen groter is dan 90% op de eerste poging 1-3. Een algemeen schema voor directe C-terminale tagging van proteïne-coderende genen (Figuur 4). Dezeregeling maakt gebruik van directe integratie via dubbele cross-over homologe recombinatie van HXGPRT 3 &#39;van de tag-gen en telt ook validatie strategieën, vergelijkbaar met die hierboven beschreven. Wanneer een gen wordt vermoed dat ze een essentieel gen kan worden geverifieerd met behulp van een tweede transfectie met een onafhankelijk geïsoleerd gericht DNA plasmide. Alternatieve werkwijzen, zoals systemen voor gereguleerde genexpressie, zijn beschikbaar voor verdere verifiëren of een gen essentieel 25. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van het ontwerp van een targeting plasmide DNA. Een. Schematische voor het ontwerpen overlappen primers gebruikt voor PCR versterken de 5 &#39;en 3&#39; target flanken met 33 bp overlapt voor de pRS416 shuttle vector en HXGPRT minigen cassette. Primers afgebeeld in het schema zijngebruikt voor het genereren van de 5 &#39;en 3&#39; target flanken van pΔROP18 10. B. Algemene strategie voor het ontwerpen van een DNA-molecuul richten. De ruggengraat van pΔGOI is de pRS416 shuttle vector bevattende uracil (URA) en ampicilline (AMP) selecteerbare merkers. Ingevoegd in pRS416 is ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-doel flank geamplificeerd uit genomisch DNA met overlappingen van de HXGPRT minigen cassette en pRS416 met de primers F1 en R1, a ~ 1 Kbp 3&#39; doelwit DNA flankeren geamplificeerd uit genomisch DNA met overlappingen de HXGPRT minigen cassette en pRS416 met de F2 en R2 primers en HXGPRT minigen cassette. De volgende unieke restrictie-enzym digestie sites worden toegevoegd aan de primers: RE.X (restrictie-enzym X gesneden ter) in de F1 primer het plasmide gesneden aan het 5 &#39;uiteinde van de 5&#39; DNA-doel flank, RE.Y in de R2 primer aan het 3&#39;-uiteinde van het 3&#39;-DNA-doel flank en RE.Z het plasmide te snijden in de R1 en F2 primers voor het uitsnijden van de HXGPRT minigene cassette. C. Primersequenties gebruikt om de targeting construct voor de verwijdering van ROP18 genereren. De vetgedrukte gebieden overeenkomen met T. gondii genomische sequentie en de nonbold&#39;s overeenkomen met de restrictie-enzymplaatsen en sequenties die overlappen met pRS416 en HXGPRT minigen cassette. De HX_F en HX_R primerpaar versterkt het HXGPRT minigen cassette 14. Primers gelezen van 5 &#39;naar 3&#39;. Tabel aangepast van Fentress et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figuur 2. Overzicht van het protocol voor de verwijdering van een gen met behulp HXGPRT. A. Disruption van de Indiase overheid in de Δ ku80Δhxgprt stam door een dubbele crossover homologe recombinatie met een ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA doelwit flank en een ~ 1 Kbp 3&#39; DNA doelwit flank op plasmide pΔGOI. Een PCR-strategie met PCR1, PCR2, PCR3, en pCR4 (niet op schaal) wordt aangetoond dat genotype verificatie mogelijk maakt om klonen te valideren met gerichte integratie van HXGPRT en verwijdering van de Indiase overheid locus. B. Vertegenwoordiger primerparen ontworpen om de verwijdering van ROP18 valideren . ROP18_DF en ROP18_DR versterken PCR1, ROP18_ExF en ROP18_CxR versterken PCR2, ROP18_CxF en DHFR_CxR versterken PCR3 en DHFR_CxF en ROP18_CxR versterken pCR4 (zie figuur 2A). Primers gelezen van 5 &#39;naar 3&#39;. Tabel aangepast van Fentress et al. 10. C. Representatieve resultaten van de validatie van een gerichte gendeletie (ROP18) met HXGPRT. Na transfectie van plasmide pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt en selectie in MPA +X, MPA + X resistente klonen werden getest op de verwijdering van ROP18. De ouderlijke stam controle positief is voor PCR 1 (~ 400 bp) en PCR 2 (~ 650 bp) product en negatief voor PCR 3 (~ 1200 bp) en PCR 4 (~ 1300 bp) product. Een gerichte Indiase overheid knockout is positief voor de PCR2, PCR3 en pCR4 producten en is negatief voor de PCR-1 product (zie figuur 2A). Getoond zijn representatief panelen van de resultaten van PCR1 en PCR2 (bovenste paneel), PCR3 (middelste paneel), en pCR4 (onderste paneel). Klonen 3, 4, 5, 6, 8, 9 en 11 vertonen de juiste bandpatroon van PCR 1, PCR2, PCR3 en pCR4 dat een gerichte gen deletie gebeurtenis in de kloon definieert. Klonen 1, 2, 7, 10 en 12 zijn niet gendeleties evenals op andere potentiële representatieve resultaten. (C = ouderlijke controle stam Δ ku80Δhxgprt, M = grootte markers). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figuur 3. Overzicht van het protocol voor het opnieuw richten van het gen van belang HXGPRT verwijderen. A. strategie voor het verwijderen van de HXGPRT selecteerbare marker door een dubbele crossover homologe recombinatie gebeurtenis in de stam Δ ku80Δgoi :: HXGPRT met een ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA doelwit flank en een ~ 1 Kbp 3&#39; DNA doelwit flank op plasmide pΔGOIc. De PCR strategie genotype verificatie afgebeeld met een primerpaar assay voor een PCR product (PCR5) dat de deletie omvat (niet op schaal). B. Een representatieve primerpaar om de verwijdering van de HXGPRT selecteerbare merker valideren van gra2 locus in stam Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF en GRA2_CxR versterken PCR5. Primers<html> gelezen van 5 &#39;naar 3&#39;. C. Representatieve paneel 6TX-resistente klonen die kunnen worden verkregen na transfectie van plasmide pΔGOIc in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT en selectie in 6TX. Clones 4, 7, 9, 11 en 12 vertonen de juiste bandpatroon van PCR5 dat overeenkomt gerichte deletie van het HXGPRT marker (~ 1,2 Kbp product beroemde en 3 &#39;flank met geringe overlap met de 5&#39; flank en buiten de 3&#39; flank). Klonen 1, 2, 3, 6, 8 en 10 (de band licht) geven de verwachte bandpatroon van ongeveer ~ 3,4 Kbp die overeenkomt met de ouderlijke kloon genotype, hoewel deze klonen vertoonde een mate van weerstand tegen 6TX dat toegelaten hun keuze (dit fenotype kan soms spontaan ontstaan ​​door het stilleggen van HXGPRT expressie (zie toelichting in protocol 2.1 (stap 8) en Representatieve resultaten sectie). (C = ouderlijke controle stam Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = grootte markers).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figuur 4. Ontwerp van een targeting DNA molecuul aan de C-terminale uiteinde van een eiwit coderen. De strategie is gebaseerd op het vermogen van de marker HXGPRT ook fungeren als een 3&#39;-stroomafwaartse regulerende regio. De ruggengraat van pΔGOItag is de pRS416 shuttle vector die uracil (URA) en ampicilline (AMP) selecteerbare merkers. Ingevoegd in pRS416 is ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-doel flank geamplificeerd uit genomisch DNA met overlappingen van de HXGPRT minigen cassette en pRS416 met de Fgoi en Rtag primers, een ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-doelmateriaal flank wordt geamplificeerd uit genomisch DNA met overlappingen de HXGPRT minigen cassette en pRS416 met behulp van de F2 en R2primers en HXGPRT minigen cassette. De 5 &#39;DNA-doelmateriaal flank vervangt het terminatiecodon met de tag (HA, Myc, His, enz.) gevolgd door een vervangend terminatiecodon. MPA + X selectie integreert de C-terminale label en een stroomafwaartse HXGPRT en verplaatst de 3 &#39;UTR een positie na HXGPRT marker. De volgende unieke restrictie-enzym digestie sites worden toegevoegd aan de primers: RE.X (restrictie-enzym X gesneden ter) in de primer Fgoi het plasmide gesneden aan het 5 &#39;uiteinde van de 5&#39; DNA-doel flank en RE.Y in de R2 primer de HXGPRT minigen cassette gebruikt voor constructie van plasmiden opnieuw richten de gelabelde locus verwijderen het plasmide aan het 3&#39;-uiteinde van het 3&#39;-DNA-doel flank en RE.Z te snijden in de Rtag en F2 primers accijns HXGPRT de merker die de plaatsing van de 3 &#39;UTR zal herstellen.

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type II<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Om efficiënt genereren van gerichte gendeleties en gen vervangingen voor functionele genomische analyse.

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Het algemene doel van deze procedure is een efficiënte en betrouwbare genvervanging met gebruik van type één en type twee delta twee 80-stammen van Toxoplasmic ndii. Dit wordt bereikt door eerst een targeting-DNA-molecuul te construeren dat de HX GPRT-selecteerbare marker in de voorwaartse oriëntatie fuseert tussen verschillende five prime en three prime gen-targeting DNA-flanken. De tweede stap van de procedure is het transfecteren van het targeting-DNA-molecuul in een type één of type twee toxoplasma DYI-stam.De derde stap is om geduldig te selecteren op dubbele crossover homologe recombinatiegebeurtenissen en individuele klonen te isoleren. De laatste stap is om de aanwezigheid van de gene targeting-gebeurtenis in de geïsoleerde mutantklonen te valideren. Uiteindelijk kunnen de resultaten van deze procedure de functie van parasietgenen aantonen door de analyse van gerichte gene knockouts, genvervangingen en getagde genen via een verscheidenheid aan downstream applicaties.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden die gebruikmaken van wild-type stammen van deze parasiet, is dat de type één en type twee delta twee 80 parasietachtergronden nu een uiterst betrouwbare selectie mogelijk maken van gerichte double crossover homologe recombinatie-gebeurtenissen om nauwkeurig genetisch gedefinieerde stammen te produceren. Deze techniek zal de ontdekking van nieuwe targets voor antitoxine plasma-drugtherapie en de ontwikkeling van veilige en effectieve geattenueerde vaccinstammen aanzienlijk versnellen, vooral in combinatie met de goed doordachte genomische bronnen die online beschikbaar zijn op toxodb.org. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het engineeren van gerichte DNA-moleculen of genetische manipulaties met Toxoplasma Gandhi.Echter, patiëntenpraktijk en het ontwerp van betrouwbare targetmoleculen zullen het succes waarborgen. Begin het protocol door de 5'- en 3'-genomische targetflanken voor het gen van interesse via PCR te amplificeren vanuit genomisch DNA. Amplificeer vervolgens via PCR de HX GPRT selecteerbare marker met de bijbehorende 5'- en 3'-DHFR flanken vanuit de HX GPRT CD NA mini-gen cassette.Gebruik gist-recombinatie of een soortgelijke methode om de 3D NA-moleculen in hun juiste 5' naar 3' oriëntatie te fuseren met plasmide PRS four 16, om zo plasmide p delta GOI te genereren dat de deletie bij het gen van interesse zal targeten. Bereid vervolgens een monster van 100 µL voor dat 15 tot 30 µg gelineariseerd targeting-plasmide bevat voor transfectie in T gia 68 tot 72 uur na het inoculeren van een 25 cm kolf met confluente HFF-cellen. Verifieer de aanwezigheid van vers gelyseerde parasieten door visueel te bevestigen dat 90 tot 95% van de HFF-cellen is gelyseerd; levensvatbare parasieten zijn essentieel voor gene targeting.Agiteer de levensvatbare parasieten in de oplossing door de gesloten kolf krachtig te schudden, zonder vloeistof op de binnenkant van de dop of de hals van de kolf te spatten. Oogst de parasieten uit de kolf en bereid ze voor op transfectie zoals beschreven in het tekstprotocol. Elektroporeer het targeting-plasmide in de delta CO 80 toxoplasma-stam.Overbreng het geëlektroporeerde mengsel naar een kolf van 150 centimeter met confluente HFF-cellen en 30 milliliters infectiemedium. Incubeer de geïnfecteerde cultuur gedurende de nacht bij 37 °C, ongeveer 20 uur na transfectie. Vervang het medium door MPA plus X selectiemedium.Laat de parasieten nu ongeveer acht dagen incuberen bij 37 °C, zonder verstoring. Zodra plaques zichtbaar zijn, schudt u de kolf om extracellulaire parasieten van de monocultuur los te maken, waardoor een parasietoplossing ontstaat. Breng ongeveer 0,5 mL van de parasietoplossing over naar een nieuwe 25 cm kolf met confluente HFF-cellen die vijf mL MPA plus X selectiemedium bevat.Benoem deze cultuur ongeveer drie dagen later als PAs een A. Herhaal de overdracht van een halve milliliter van de parasietenoplossing van de oorspronkelijke fles naar een andere fles met HFF-cellen met hetzelfde selectiemedium. Benoem deze cultuur gedurende de volgende vijf dagen als PAs een B.Controleer passage één A en één B op pfu. Selecteer op basis van een adequaat aantal van meer dan 25 infectiezones ofwel passage één A of passage één B voor subklonering. Zodra de parasieten de HFF-cellen lyseren, wordt de cultuur overgezet naar een nieuwe fles van 25 centimeter met confluente HFF-cellen met selectiemedium. Drie weken na transfectie worden vers aangebrachte parasieten gesubkloneerd door de parasieten te verdunnen tot de juiste concentratie in MPA plus X-medium en de parasietenoplossing gelijkmatig te verdelen over een 96-wellplaat met confluente HFF-cellen.Bereid één tray voor met een concentratie van één parasiet per well en bereid een tweede tray voor met een concentratie van twee parasieten per well. Incubeer beide trays bij 37 °C na de oorspronkelijke transfectiedatum. Subcloneer de parasieten niet vóór dag 20 voor type één parasieten of dag 25 voor type twee parasieten.Zet de 25 centimeter kolf wekelijks over volgens het schema in de onlinetekst tot de knockout-stam is gevalideerd. Evalueer na ongeveer een week de 96-wells platen bij een vergroting van 40 tot 60 x. Selecteer uitsluitend wells die een enkele PFU bevatten, geïdentificeerd als een enkele infectiezone, met een pipet ingesteld op 50 µL.Meng de inhoud van deze wells door de vloeistofstroom over de PFU te richten om de parasieten over de well te verspreiden. Vier tot vijf dagen na het mengen van de geselecteerde wells kiest u een dozijn klonen met gelyste cellen. Draag 12 klonen over van de 96-well tray naar 12 wells van een 24-well tray. Doe dit door met een pipetpunt over de bodem van de well te schrapen en zes µL op te zuigen.Breng de oplossing over naar een well van een 24-well tray met confluente HFF-cellen in één milliliter MPA plus X-selectiemedium. Incubeer de 24-well tray bij 37 °C en monitor op lysis van de HFF-cellen. Passageer de parasieten uit een gelyseerde well in de 24-well tray volgens een wekelijks schema.Gebruik de kras-en-tekenmethode om twee µL van de parasietenoplossing over te brengen naar een nieuwe plaat met MPA en X-selectie. Oogst na passage de parasieten uit het oorspronkelijke 24-wells plaatje en breng deze over naar kleine buisjes voor DNA-verzameling.Gebruik ten slotte PCR om te testen op de deletie van het gen van interesse, om zo de integratie van de 5'- en 3'-doelsequenties te controleren. Controleer daarnaast op de aanwezigheid van de HX GPRT-selecteerbare marker. Dit protocol is bedoeld voor het verwijderen van de HX GPRT-marker uit de gemanipuleerde delta Q 80-stam en wordt beschreven in de onlinetekst.P delta GOYC is gericht op het verwijderen van HX GPRT uit de parasiet door middel van negatieve selectie met gebruik van zes TX-media. Vervolgens wordt PCR gebruikt om het verlies van HX GPRT te bevestigen; een band van 1,2 Kilobase pair geeft aan dat HX GPRT niet uit de locus is verwijderd. Er is een band van 3,4 kilobase pair.Het laatste deel van dit protocol, het C-terminaal labelen van eiwitten, wordt eveneens gedetailleerd beschreven in de onlinetekst. Nadat het beschreven protocol voor een gerichte gen deletie was gevolgd, werd PCR gebruikt om de deletie van een knock-out van type one R 18 te valideren, een locus die over het algemeen moeilijk te targeten is. PCR 1 toont de afwezigheid van het R 18-gen PCR-product.PCR twee toont de aanwezigheid van de 3'-R18 genomische targetflank aan; PCR drie en PCR vier tonen aan dat de selecteerbare marker correct is geïntegreerd tussen de 5'- en 3'-genomische targetflanken, wat de R18-deletie definieert. Om de selecteerbare marker opnieuw te kunnen gebruiken voor volgende deleties in een stam, moet de oorspronkelijke HX GPRT eerst uit de locus worden verwijderd. Volg hiervoor het beschreven protocol.HX GPRT werd verwijderd uit de gedelete GRA twee locus in stam delta twee 80 delta GRA twee HX. G-P-R-T-P-C-R werd gebruikt om het verlies van HX GPRT te bevestigen, wat werd aangetoond door een band van 1,2 KILOBASE. Wanneer H-X-G-P-R-T niet was verwijderd, was er een band van 3,4 kilobase na de initiële stap van gene targeting. Aanvullende methoden voor gene targeting kunnen worden toegepast om meerdere knock-outs te construeren in hetzelfde type één of type twee stam, of om een mutante stam te taggen of te complementeren om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: waar lokaliseert dit eiwit zich in de cel?Of wat is het belangrijkste domein of de activiteit van dit eiwit of deze route die de biologische functie verklaart? Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het vakgebied om de exploratie van parasitaire genfuncties in het model AP-complex en de parasiet Toxoplasma te intensiveren. Gandhi eye.Vergeet niet dat het werken met Toxoplasma gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het volgen van alle BSL-2 richtlijnen, gedurende de gehele procedure in acht moeten worden genomen.

genetic-manipulation-ku80-strains-for-functional-genomic-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Forward Genetische technieken in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

-Gen-targeting mutagenese is nu mogelijk in een breed scala van organismen, waarbij genoom montagetechnieken. Hier tonen we een protocol voor gerichte gen mutagenese met behulp van transcriptie-activator, zoals effector nucleasen (Talens) in Astyanax mexicanus, een soort vis dat oppervlak vis en cavefish omvat.

Genome bewerken in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Met behulp van transcriptie Activator-achtige Effector Nucleases (Talens)

Details worden gepresenteerd over hoe QTL mapping met een genoomkaart op basis van een genoom sequentie kan worden gebruikt om een ​​drug resistentie gen in Toxoplasma gondii te identificeren en hoe dit kan worden gecontroleerd met het CRISPR / Cas9 systeem dat efficiënt een genomisch doel bewerkt, in dit geval de Drug resistentie gen.

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Hier gepresenteerd is een protocol om de remming werkzaamheid van chemische verbindingen te evalueren tegen in vitro intracellulaire groei van Toxoplasma gondii met behulp van een luciferase-gebaseerde groei test. De techniek wordt gebruikt om remmingsspecificiteit te bevestigen door genetische verwijdering van het overeenkomstige doelgen. De remming van LHVS tegen TgCPL protease wordt als voorbeeld geëvalueerd.

Bepaling van de chemische remmer efficiëntie tegen intracellulaire Toxoplasma Gondii Groei met behulp van een Luciferase-Based Growth Assay

Hier presenteren we een protocol om Toxoplasma gondii-stammen snel te identificeren en te genotypen met behulp van draagbare nanopore-sequencing van geselecteerde genetische markers, waardoor schaalbare, gerichte stamidentificatie in laboratoriumonderhouden isolaten mogelijk is met mogelijke toekomstige toepassing in surveillance-omgevingen.

Multi-locus sequencing voor stamtypering van Toxoplasma gondii

Leer gerichte genvervanging in Toxoplasma gondii met behulp van Δku80-stammen en homologe recombinatie. Deze methode maakt efficiënte genedeleties en functionele genomische analyses mogelijk.

Genetische Manipulatie in

Meer video's verkennen