Name: Tinción de anticuerpos en C. Elegans Uso de Freeze-Cracking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprende la técnica de freeze-cracking para tinción de anticuerpos en C. elegans, minimizando el tratamiento químico y mejorando la localización de proteínas en nematodos semíntegros mediante microscopía de fluorescencia.

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El financiamiento fue proporcionado por la NSF CCLI # 0633618 y la Universidad de Ohio. Algunas cepas fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis. El estudiante de posgrado Reetobrata Basu aparece en el video.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Duerr, J. S. Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.

El protocolo de congelación de craqueo es uno de varios métodos para la tinción de anticuerpos en C. elegans. Proporciona una manera relativamente fácil de manchar los gusanos, pero requiere de reactivos específicos y práctica para obtener resultados óptimos. Los pasos críticos (descritos en la Figura 1) son: 1) la preparación de diapositivas (consulte los pasos 1 y 2) la compresión manual de los nematodos (consulte los pasos 2 y 3) de fijación rápida (ver paso 3). En primer lugar, para maximiz...

Para determinar la localización celular y subcelular de las proteínas, los científicos han denominado tradicionalmente tejidos con anticuerpos seleccionados para reconocer específicamente las proteínas particulares 1. En algunos organismos modelo como C. elegans, tinción de anticuerpos a menudo ha sido sustituido por técnicas genéticas moleculares, que dan resultados más rápidamente. Estos incluyen los organismos de transformación con constructos que consisten en fusiones de genes entre el promotor y las regiones codificantes del gen de interés y la proteína fluorescente verde. Sin embargo, las técnicas moleculares están sujetas a una serie de artefactos, incluyendo problemas con conocer la verdadera promotor y cambios en la expresión de los constructos en el número de copias alto (las técnicas habituales en C. elegans) 2,3. Por lo tanto, la tinción con anticuerpos sigue siendo un objetivo para muchos científicos que estudian la función de proteínas in vivo. La tinción con anticuerpos tejidos puede ser difícil, ya que untibodies sólo podrán reconocer su antígeno en una determinada conformación 1. Por ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer sólo antígeno desnaturalizado o intactos fija de una manera particular y pueden no reconocer el antígeno in situ. El problema de la tinción de anticuerpos en los nematodos se ve agravada por el hecho de que la cutícula del nematodo forma una barrera relativamente impermeable, bloqueando el acceso de los anticuerpos a los tejidos. Hay varios métodos diferentes utilizados para la tinción de anticuerpos en C. elegans (revisado en nuestros trabajos anteriores 4). Para la tinción intactas &quot;gusanos, &#39;se desarrollaron métodos para congelar y descongelar en un fijador relativamente duro (formaldehído o glutaraldehído), los ciclos de congelación-descongelación ayudan a romper la cutícula para permitir una rápida penetración del fijador 5. Después de la fijación, la cutícula se permeabilizaron para permitir la penetración del anticuerpo; métodos incluyen el tratamiento con agentes, colagenasa, o tanto la reducción de 5-7. Estos treatments conservan la morfología, pero a menudo reducen o destruyen el reconocimiento de anticuerpos. Los métodos alternativos incluyen la disección 8 para permitir la penetración de anticuerpos. &quot;Freeze-cracking&quot; es una forma de obtener acceso al interior del gusano semi-intacta para permitir la tinción de anticuerpos 9-10. Freeze-craqueo se puede realizar con una variedad de condiciones de fijación, evitando tratamientos de colagenasa y de reducción. Los nematodos se colocan entre dos adhesivos diapositivas, congeladas, y luego las diapositivas se separan, dejando la mayor parte del nematodo en el portaobjetos inferior y gran parte de la cutícula en la diapositiva superior. La corredera inferior se puede colocar en fijador y toda la diapositiva con nematodos adheridas se transfiere a través del procedimiento de tinción de anticuerpos. El método no presentan dos dificultades principales. En primer lugar, es difícil aplicar la cantidad correcta de presión necesaria para dividir los nematodos sin deformar gravemente ellos. En segundo lugar, muchos de los gusanos no se smarque a cualquiera de diapositivas, y se perderá en el fijador o enjuagues. Sin embargo, con los portaobjetos y la práctica adecuados, el método producirá rápidamente nematodos con morfología razonable que se puede utilizar con una amplia variedad de fijadores y anticuerpos. El método se puede variar ligeramente, dependiendo de la meta del experimentador. Si se desea tinción de los nematodos individuales (por ejemplo, para determinar si un único transformante ha alterado la tinción de anticuerpos), a continuación, se desliza con la adhesión máxima (pero mayor tinción de fondo) se puede utilizar, tales como diapositivas preparadas en el laboratorio con polilisina adicional (ver más abajo). Para formaldehído o glutaraldehído fijación, toboganes más altos de adhesión (diapositivas polylysine preparadas en el laboratorio) deben ser usados, ya que los nematodos se adhieren más mal a la polilisina después de estas fijaciones. Si los nematodos de tipo salvaje se fijaron con metanol y / o acetona, y luego se desliza con una menor adherencia y la tinción de fondo más baja se debe utilizar (comercial o de ldiapositivas aboratory preparados). Si una variedad de anticuerpos y fijadores están siendo utilizados en el laboratorio, una selección de diapositivas se puede preparar con anticipación y se almacena hasta que se necesita. Después de acceso al tejido nematodo se ha adquirido, los procedimientos de tinción de anticuerpos siguen métodos estándar (con incubaciones más largas característicos de los tejidos en lugar de células de 1,11).

<table><tbody><tr><td>portaobjetos de poli-L-lisina (marca ESCO)</td><td>Fisher</td><td>12-545-78</td><td>Los portaobjetos de la marca Sigma también son adecuados</td></tr> para <tr><td>el hidrobromuro de poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td><fuerte>IMPORTANTE:</fuerte> Marca y alto peso molecular de los portaobjetos de borde esmerilado único crítico de polilisina</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>48312-002</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>azida de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TOXIC, use guantes y mascarilla mientras pesa el polvo para hacer un 10% de caldo. Use guantes cuando pipetee la solución madre</td></tr><tr><td>frasco de tinción coplin</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>Sobre de 5 portaobjetos</td><td>Microscopía Electrónica Science</td><td>71549-01</td><td>Una de las muchas marcas diferentes de portaobjetos pequeño, adecuado para teñir</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><fuerte>IMPORTANTE:</fuerte> Las soluciones regulares de formalina (37% de formaldehído) NO son adecuadas. 1) Disolver el paraformaldehído crisatlano en tampón de fosfato y almacenar en pequeñas alícuotas congeladas. O 2) comprar paraformaldehído de grado de microscopía electrónica en alícuotas. TÓXICO -use guantes; Deseche el exceso de plumón del fregadero con agua.</td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído, 25% en agua</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td><fuerte>IMPORTANTE:</fuerte> comprar glutaraldehído de grado de microscopía electrónica en ampollas; TÓXICO -use guantes; Deseche el exceso de plumón del fregadero con agua.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Fisher ICN820451</td><td></td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>Suero de burro, liofilizado</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-marcaje</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>Esta empresa está recomendada para anticuerpos multi-etiqueta (afinidad depleida) de alta calidad. Seleccione el colorante y el antígeno apropiados (animal utilizado para producir anticuerpos primarios). </td></tr><tr><td>galato de n-propilo</td><td>Fisher</td><td>ICN10274750</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr><tr><td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOXIC. Use guantes y dispense en pequeñas alícuotas y se mueva para minimizar la exposición</td></tr><tr><td>Whatman #1 filtros de 15 cm de diámetro</td><td>Fisher</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip #1 1/2 rectángulo 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td>#1 1/2 de grosor es ópticamente mejor</td></tr><tr><td>Carpeta de portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>Otras marcas son adecuadas</td></tr></tbody></table>

tinción de anticuerpos en<em&gt; c. elegans</em&gt; uso de &quot;freeze-cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Para la tinción de C. elegans con anticuerpos, la cutícula relativamente impermeable deben ser anuladas por métodos químicos o mecánicos. &quot;Freeze-cracking&quot; es un método utilizado para extraer físicamente la cutícula de los nematodos mediante la compresión de nematodos entre dos diapositivas adherentes, la congelación, y tirando de las diapositivas aparte. Freeze-craqueo proporciona una manera simple y rápida para obtener acceso a los tejidos sin tratamiento químico y se puede utilizar con una variedad de fijadores. Sin embargo, conduce a la pérdida de muchas de las muestras y la compresión requerida distorsiona mecánicamente la muestra. Se requiere práctica para maximizar la recuperación de muestras con buena morfología. Freeze-craqueo puede ser optimizado para condiciones específicas de fijación, de recuperación de muestras, o bajo la tinción no específica, pero no para todos los parámetros a la vez. Para los anticuerpos que requieren fijación de condiciones muy duras y toleran los tratamientos químicos necesarios para permeabilizar químicamente la cutícula, treatmenpuede ser preferido t de nematodos intactas en solución. Si el anticuerpo requiere una solución más ligero o si las condiciones óptimas de fijación son desconocidos, congelar-craqueo proporciona una manera muy útil para ensayar rápidamente el anticuerpo y puede proporcionar información específica de localización subcelular y celular para el antígeno de interés.

Cuando los gusanos se comprimen correctamente, agrietados, y ligeramente fijos, prácticamente todo el gusano puede ser accesible para la tinción de anticuerpos (ver Figura 2). La ubicación de los núcleos, como se indica por la tinción DAPI indica qué partes del gusano están intactos Cuando los gusanos se someten a un fijador más duro, tal como formaldehído, la morfología del gusano puede distorsionarse (como se ve por la aparición no natural ondulado de la músculos de las figuras 3A-D)....

&quot;Freeze-craqueo,&quot; un método para exponer los tejidos internos del nematodo C. elegans a anticuerpos para la localización de proteínas, se demuestra.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar la tinción con anticuerpos en C. elegans. Para ello, los nematodos se enjuagan, se distribuyen sobre portaobjetos y se comprimen cuidadosamente entre dos portaobjetos adhesivos, los cuales luego se congelan en hielo seco. A continuación, se separan los portaobjetos para romper los nematodos y se colocan inmediatamente en fijador.Los nematodos se tiñen entonces utilizando técnicas estándar de tinción con anticuerpos; el análisis mediante microscopía fluorescente revela una tinción exitosa con anticuerpos de nematodos semienteros. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la fijación de nematodos enteros, es que minimiza el tratamiento químico de la muestra. En general, las personas nuevas en este método suelen tener dificultades porque la preparación de las muestras y los nematodos es algo complicada de demostrar.El procedimiento lo realizaré yo junto con RTO Basu, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para preparar placas de nematodos para tinción, comience colocando una pieza plana de metal sobre hielo seco para enfriarla; luego, enjuague con agua destilada y una pipeta de vidrio. Transfiera

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

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