Een introductie tot Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae, ook wel bekend als bakkersgist, is een van de vele modelorganismen die in laboratoria over de hele wereld worden bestudeerd. Omdat het genoom is gesequenced, de genetica eenvoudig te manipuleren zijn en het in het laboratorium makkelijk in stand te houden is, is deze gistsoort een onschatbare hulpbron geweest bij het begrijpen van fundamentele cellulaire processen zoals celdeling en celdood. Deze video geeft u een overzicht van dit modelorganisme en de brede reeks toepassingen in biologisch en biomedisch onderzoek.

Gisten behoren tot het domein Eukaryota, dat bestaat uit organismen met membrangebonden kernen, ook wel eukaryoten genoemd. Samen met paddenstoelen en schimmels behoort S. cerevisiae tot het rijk Fungi vanwege de aanwezigheid van een celwand gemaakt van chitine, een polysaccharidepolymeer dat niet alleen in Fungi, maar ook in de exoskeletten van insecten en kreeftachtigen wordt gevonden.

Interessant is dat veel eiwitten in gist vergelijkbare sequenties delen met eiwitten van andere eukaryoten. Deze eiwitten zijn vaak homologe eiwitten, en hun vergelijkbare sequenties wijzen erop dat de organismen een gemeenschappelijke voorouder delen. Door de functie van een bepaald eiwit in gist te onderzoeken, verkrijgen onderzoekers inzicht in de functie van dat eiwit in hogere eukaryoten, zoals wij, mensen.

In de natuur komt S. cerevisiae voor in warme, vochtige omgevingen met een suikerbron in de nabijheid. Een van de favoriete verblijfplaatsen is de wijngaard, waar het op de druivenschil leeft.

S. cerevisiae heeft een ronde tot ellipsoïdale ovoïde vorm en heeft doorgaans een diameter van 5-10 micrometers wanneer het wordt gevisualiseerd met een lichtveldmicroscoop.

Wanneer de meeste eukaryote cellen zich delen via mitose en cytokinese, vindt er een gelijke segregatie van genetisch materiaal en cytoplasma in de dochtercellen plaats. Aan de andere kant ondergaat S. cerevisiae celdeling via een proces dat knopvorming wordt genoemd.

Deze vorm van ongeslachtelijke voortplanting omvat de vorming van een nieuw gesynthetiseerde knop vanuit de moedercel, die in grootte toeneemt gedurende de celcyclus tot aan de cytokinese. In tegenstelling tot typische eukaryote celdeling zijn de twee cellen na de mitose niet gelijk in grootte.

Nu we meer hebben geleerd over S. cerevisiae als organisme, bespreken we wat het een uitstekend modelsysteem voor onderzoek maakt.

Ten eerste groeien gistcellen snel en delen ze zich ongeveer elke 90 minuten. Ten tweede zijn ze gemakkelijk te kweken en is er slechts eenvoudige techniek en instrumentatie nodig voor de propagatie. Ten derde was S. cerevisiae het eerste eukaryote organisme waarvan het volledige genoom werd gesequenced, waardoor alle gensequenties publiekelijk beschikbaar zijn via de gistgenoomdatabase.

Genetische manipulatie van gist is bovendien uiterst praktisch. De meeste S. cerevisiae-vectoren, dragers van een DNA-sequentie van belang, zijn shuttle-vectoren. Shuttle-vectoren zijn gewoonlijk plasmiden die zich in twee verschillende soorten kunnen voortplanten, zoals in zowel E. coli als S. cerevisiae. Hierdoor kan moleculaire klonering worden uitgevoerd in E. coli, bijvoorbeeld om het gen voor groen fluorescent eiwit uit kwallen in een shuttle-vector in te bouwen, die vervolgens in gist kan worden geïntroduceerd om deze te laten gloeien.

Het integratieve gistplasmide is een type shuttle-vector waarmee vreemd DNA in het gistgenoom kan worden ingebouwd via een proces dat homologe recombinatie wordt genoemd. Homologe recombinatie is een uitwisseling van DNA tussen overeenkomende of gelijkaardige sequenties, wat resulteert in een genetische crossover tussen de vector en het genomische DNA van de gastheer. Dit kan ervoor zorgen dat een gen wordt uitgeschakeld (knock-out), of dat het ene gen wordt vervangen door een ander. Daarnaast blijft de genetische verandering behouden na de deling van de gistcel, aangezien homologe recombinatie leidt tot integratie in het genoom van de gastheer.

Nu u weet wat gist zo geschikt maakt voor onderzoek, laten we kijken waarom deze kleine organismen wetenschappelijk gezien zo belangrijk zijn geweest. Heel lang geleden, aan het begin van het 6e millennium v.Chr., was gist betrokken bij de fermentatie van druiven om wijn te maken. Later speelde gist een rol bij het bakken van brood in het oude Egypte.

Pas in 1856 identificeerde Louis Pasteur S. cerevisiae als de belangrijkste microbe voor het maken van wijn en het bakken van brood. Hij classificeerde gist als een facultatief anaeroob, dat in afwezigheid van zuurstof overschakelt op fermentatie, een proces waarmee gist suikers kan metaboliseren en waarbij alcohol als bijproduct vrijkomt. In dit proces wordt pyruvaat, dat wordt geproduceerd door glycolyse, gereduceerd tot aceetaldehyde, wat vervolgens, dankzij de conversie van NADH naar NAD+, wordt gereduceerd tot ethanol, het bepalende ingrediënt in wijn.

Als we vooruitspringen naar de 20e eeuw, werden de eiwitten die de celcyclus reguleren ontdekt in gist door Hartwell en Nurse.

De celcyclus is een reeks cellulaire gebeurtenissen die de correcte replicatie en segregatie van nucleair DNA omvat voordat een cel zich deelt. De identificatie van het eiwit cycline en cycline-afhankelijke kinase, samen met de verandering in hun relatieve abundantie tijdens de interfase en mitose, suggereerde dat deze eiwitten sleutelregulatoren zijn van de celdeling. De sterk geconserveerde aard van deze eiwitten maakt hun studie in gist waardevol voor het begrijpen van de rol van cycline-afhankelijke kinases in meercellige organismen, zoals de dysregulatie van de celcyclus, wat kan leiden tot ongecontroleerde celdeling, oftewel kanker.

Vijftien jaar later verrichtten Blackburn, Greider en Szostak baanbrekende studies naar het begrip van telomeren, evenals de ontdekking van telomerases. Telomeren zijn repetitieve DNA-sequenties aan het uiteinde van een chromosoom die voorkomen dat genomisch DNA degenerateert. De toevoeging van deze repetitieve sequenties wordt uitgevoerd door telomerases aan het 3’-flankerende uiteinde van het chromosoom, waarna aanvulling van nucleotiden wordt gevolgd door DNA-polymerase in de lagging strand. Telomeren hebben implicaties voor veroudering, aangezien deze DNA-segmenten korter worden gedurende de levensduur van een organisme.

Nog recenter, in 1992, ontdekten Ohsumi en zijn collega's genen die autofagie reguleren, een vorm van celrecycling. Tijdens nutriëntentekort worden overbodige organellen omsloten door een autofagosoom. Het autofagosoom versmelt vervolgens met een lysosoom om organelleiwitten verder af te breken tot aminozuren die essentieel zijn voor het maken van nieuwe eiwitten. Autofagie is betrokken bij belangrijke cellulaire mechanismen die beschermen tegen invasieve pathogenen en tumorgroei.

Er is een breed scala aan toepassingen voor het bestuderen van gist. Gist kan bijvoorbeeld worden gebruikt om mitofagie te bestuderen, wat de verwijdering van beschadigde mitochondriën door autofagosomen is. Dit proces heeft implicaties bij ziekten zoals Alzheimer en Parkinson. In deze video wordt autofagie in gistcellen geïnduceerd door de toevoeging van een stikstofarm medium. Vervolgens worden de cellen voorbereid voor fluorescentiemicroscopie om mitofagie in stikstofarme cellen waar te nemen.

S. cerevisiae wordt gebruikt voor de expressie en zuivering van grote hoeveelheden eiwitten, zoals het cystic fibrosis transmembrane conductance regulatory-eiwit. In deze video worden gistcellen die het CFTR-plasmide dragen, gekweekt in grote culturen. Daarna wordt centrifugatie van de cellen uitgevoerd om de microsomen te scheiden. Microsomen zijn artefactuele blaasjes die ontstaan uit het endoplasmatisch reticulum wanneer cellen worden gelyseerd. De isolatie en zuivering van CFTR uit microsomen stelt wetenschappers in staat de structuur van het eiwit te bestuderen met methoden zoals röntgendiffractie.

Gist kan ook worden gebruikt als modelsysteem voor genetische studies naar menselijke DNA-reparatie-eiwitten. Deze eiwitten detecteren en herstellen beschadigd DNA om de proliferatie van cellen met een defect genoom, zoals kankercellen, te voorkomen. Hier ziet u auteurs gistcellen met het getransformeerde DNA-reparatie-eiwit, WRN, uitplaten op selectieve mediumplaten. De celmorfologie van WRN-mutanten kan worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie, en de detectie van dit eiwit in cellysaat wordt uitgevoerd door middel van een eiwitgel voor Western Blot-analyse.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over S. cerevisiae bekeken. In deze video hebben we de geschiedenis, de cel- en moleculaire biologie en de biomedische toepassingen van S. cerevisiae besproken. We hopen dat u onze video heeft gewaardeerd en moedigen u aan om deze met een collega te delen.