Name: VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer VIGS-gebaseerde forward genetics screening om genen te identificeren die betrokken zijn bij nonhost-resistentie in Nicotiana hamama. Deze methode combineert virus-geïnduceerde gen-silencing met GFPuv-expresserende pathogenen voor efficiënte identificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd gefinancierd door The Samuel Roberts Noble Foundation. Auteurs bedanken Mss. Janie Gallaway en Colleen Elles voor een uitstekende verzorging van planten, en mevrouw Katie Brown voor kunstwerk. We zouden ook graag Mss bedanken. Trina Cottrell, Pooja Uppalapati, Moumita Saha, Swetha Vinukonda en de heer Isaac Greenhut voor technische hulp tijdens de totstandkoming van dit protocol.

1. Plant Groei en Target gen silencing <ol><li> Plantengroei voorwaarden: <ol><li> Sow N. benthamiana zaden op bodem-minder potgrond, Metro-Mix 350 en ontkiemen de zaden in een kweekkamer. Elk ander bodem of aardeloos medium kan ook worden gebruikt in plaats van Metro-Mix. </li><li> Transplant drie weken oude zaailingen in individuele potten en ze groeien in een broeikas bij 21 ± 2 ° C, samen met andere groeiomstandigheden zoals beschreven in eerdere literatuur 12. Twee tot drie dagen na het uitplanten, kunnen planten worden gebruikt TRV inoculatie. </li></ol></li><li> Groeiende TRV2 klonen: TRV is een tweedelig virus en zijn genoom bestaat uit RNA1 en RNA2. RNA1 codeert voor een RNA-afhankelijke RNA polymerase en een beweging eiwit 20,21. RNA2 codeert voor een manteleiwit (CP) en twee niet-structurele proteïnen van het subgenome RNA&#39;s 21. Zowel RNA1 en RNA2 zijn nodig voor de vorming van gerijpte virons deeltjes en hun verspreiding 20,21. cDNA bibliotheek bouw in TRV2 vector is beschreven in eerdere literatuur 22,23. Kort VIGS bibliotheek in deze studie werd geconstrueerd van het RNA geëxtraheerd uit bladweefsel blootgesteld aan verschillende biotische en abiotische elicitors. <ol><li> Neem Agrobacterium (stam GV2260) met de cDNA klonen in TRV2 vector (een 96-well plaat) van de vriezer. Ze geleidelijk ontdooien en na het kweken op kamertemperatuur komen, beënten afzonderlijke Agrobacterium kweek op Luria-Bertani (LB) agar plaat met rifampicine (10 ug / ml) en kanamycine (50 ug / ml) met een 96-pin replicator. </li><li> Incubeer de platen bij 28 ° C gedurende twee dagen. We groeien meestal vier repliceren kolonies voor elke kloon, zodat adequaat Agrobacterium inoculum is beschikbaar voor prikken enting van twee fabrieken. Voer alle stappen onder steriele omstandigheden. </li></ol></li><li> VIGS: <ol><li> GroeienAgrobacterium (GV2260) uitvoeren TRV1 bij 28 ° C in LB vloeibaar medium met bovengenoemde antibiotica. Oogst cellen door centrifugatie uit nacht gekweekt kweken, resuspendeer de inoculatie buffer (10 mM MES, pH 5,5, 200 pM acetosyringoon) en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een schudinrichting bij 50 rpm. </li><li> Oogst de cellen door centrifugeren en resuspendeer in 5 mM MES buffer (pH 5,5) en enten (OD 600 = 0,3) in abaxiale kant van 3-4 N. benthamiana laat met behulp van een naaldloze injectiespuit. Gedetailleerde inoculatie procedure in voorafgaand literatuur 24. Later, op de plaats van inoculatie TRV1 Inoculeer respectieve TRV2 kolonies door een prik de bladeren met een tandenstoker. </li><li> Onderhouden van de planten met adequate voeding als krachtige groei is belangrijk voor een efficiënte VIGS 12. Ongeveer twee weken na inoculatie van de transcripties van gerichte genen zal beginnen te verlagen en de planten zijn klaar voor pathogeen Inoculatie drie weken na de TRV inenting. </li></ol></li></ol> 2. Voorbereiding van Nonhost Pathogen Culturen en Plant Enten <ol><li> Details van pathogenen die in deze studie: Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. tomaat T1, P. syringae pv. glycinea en Xanthomonas campestris pv. vesicatoria worden in deze studie. Groeien P. syringae stammen in King&#39;s B (KB) vloeibaar medium aangevuld met rifampicine (10 ug / ml), kanamycine (50 ug / ml) bij 28 ° C gedurende 12 uur. Groeien X. campestris pv vesicatoria in vloeibaar LB-medium gedurende 16 uur.. Alle ziekteverwekkers haven een plasmide die GFPuv kunnen uitdrukken, zoals beschreven in de voorgaande literatuur 19. </li><li> Voorbereiding van de pathogeen culturen voor planten inenting: <ol><li> Oogsten bacteriële cellen door centrifugeren en bevestigen de aanwezigheid van groene fluorescentie met behulp van lange wavelength UV-lamp in het donker. Twee keer was de cellen met steriel water en resuspendeer ze naar de gewenste concentratie met steriel water. </li><li> Inoculeer de betreffende ziekteverwekker (s) op abaxiale zijde van doelgen zwijgen bladeren (5e tot 8e) als puntjes (1,5 cm diameter). Verschillende nonhost pathogenen gelijktijdig getest voor hun groei in het doelgen zwijgen planten. Tegelijkertijd beënten gastheer pathogeen omdat dit kan worden gebruikt als een positieve controle voor weergave in planta bacteriegroei. Ook enten controle van vectoren (TRV :: 00) planten. </li></ol></li></ol> 3. Observatie van in planta groei van bacteriële pathogenen <ol><li> Expose de geïnoculeerde bladeren om een ​​lange golflengte UV-licht in het donker. Bacteriële kolonies worden als groen fluorescerend stippen in de abaxiale kant van het blad op de achtergrond, rode fluorescentie uitgezonden door bladoppervlak. </li><li> Observeren pathogeen groei2 dagen na inoculatie (dpi) tot 5 dpi. Alledaagse observatie gedurende deze periode nodig is. </li><li> Na het eerste scherm, korte lijst van de klonen waarvan silencing resulteert in de groei van een of meer nonhost ziekteverwekker (s). </li><li> Herhaal VIGS voor de geselecteerde klonen en opnieuw de respons van gen tot zwijgen planten om nonhost ziekteverwekker (s) te testen. Dit tweede niveau van screening wordt gedaan om de valse positieven behaald in het eerste scherm te verwijderen. </li></ol> 4. Bevestiging van Genomineerde Installaties voor Compromised Nonhost Resistance <ol><li> Geluid van de cDNA-klonen geselecteerd uit het beeld zoals hierboven beschreven. Inoculeer de hele plant met nonhost pathogeen (s) door onderdompeling van de planten met desbetreffende pathogeen kweken met 0,01% (v / v) Silwet L-77 en het onderwerpen van de ondergedompelde planten vacuüm gedurende 3 - 5 minuten. Kwantificeer de bacteriegroei door gebruikelijke groei 6,18,19 assay zoals hierna beschreven. </li><li> Bij 0 uur na inoculatie (hpi),3 dpi en 5 dpi, verzamel twee blad monsters van vijf biologische herhalingen voor elke nonhost ziekteverwekker (s) geënt bladeren met behulp van een blad punch (0,5 cm 2). Maal het blad monsters, serieel verdund en plaat het sap op KB agar medium aangevuld met geschikte antibiotica en incubeer bij 28 ° C gedurende 2 dagen. Tel de kolonies met een kolonie teller en bereken de bacteriegroei in de bladeren, zoals beschreven in de voorgaande literatuur 6. </li><li> Planten gevoelig voor nonhost ziekteverwekker (s) moet hoger aantal pathogeen groei ten opzichte van vector controle te tonen. </li></ol> 5. Sequencing de Invoegen en Identificatie van Target Gene <ol><li> Voer kolonie PCR voor de geselecteerde kloon met attB1 en attB2 primers of met de primers aan weerszijden van de kloneringsplaats van de vector TRV2. Voer het PCR-product op de gel en controleren voor amplificatie van de enkele band. </li><li> Plantengen insert in de TRV2 vector kan worden gesequenced met behulp attBprimers of primers flankerende de kloneringsplaats. </li><li> Voer BLAST met de sequentie en de identificatie van gen gegevens. </li><li> Verkrijgen van volledige lengte gensequentie samen met de niet-vertaalde regio&#39;s (UTR). </li><li> Selecteer 300-400 bp fragmenten uit drie verschillende gebieden van de sequentie en klonen ze in TRV2 vector. Zelfstandig VIGS behulp van alle drie VIGS constructies uit te voeren en bevestig het compromis van nonhost verzet in alle drie de genen tot zwijgen planten. </li></ol>

<ol><li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhost+resistance+and+nonspecific+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Nonhost resistance and nonspecific plant defenses.</a> Currrent Opinion in Plant Biology. 3, 315-319 (2000).</li>
<li>Mysore, K. S., Ryu, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhost+resistance%3A+how+much+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Nonhost resistance: how much do we know.</a> Trends in Plant Science. 9, 97-104 (2004).</li>
<li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+nonhost+disease+resistance%3A+can+they+assist+disease+control+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into nonhost disease resistance: can they assist disease control in agriculture.</a> The Plant Cell. 18, 523-528 (2006).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhost+resistance+against+bacterial+pathogens%3A+retrospects+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Nonhost resistance against bacterial pathogens: retrospects and prospects.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, (2013).</li>
<li>Lu, M., Tang, X., Zhou, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+NHO1+is+required+for+general+resistance+against+Pseudomonas+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis NHO1 is required for general resistance against Pseudomonas bacteria.</a> The Plant Cell. 13, 437-447 (2001).</li>
<li>Rojas, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolate+oxidase+plays+a+major+role+during+nonhost+resistance+responses+by+modulating+reactive+oxygen+species+mediated+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Glycolate oxidase plays a major role during nonhost resistance responses by modulating reactive oxygen species mediated signal transduction pathways.</a> The Plant Cell. 24, 336-352 (2012).</li>
<li>Daurelio, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+novel+genes+involved+in+nonhost+response+to+bacterial+infection+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals novel genes involved in nonhost response to bacterial infection in tobacco.</a> Journal of Plant Physiology. 168, 382-391 (2011).</li>
<li>Moreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDS1+contributes+to+nonhost+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+against+Erwinia+amylovora%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">EDS1 contributes to nonhost resistance of Arabidopsis thaliana against Erwinia amylovora.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 421-430 (2012).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornithine-delta-aminotransferase+and+proline+dehydrogenase+genes+play+a+role+in+non-host+disease+resistance+by+regulating+pyrroline-5-carboxylate+metabolism-induced+hypersensitive+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Ornithine-delta-aminotransferase and proline dehydrogenase genes play a role in non-host disease resistance by regulating pyrroline-5-carboxylate metabolism-induced hypersensitive response.</a> Plant, Cell & Environment. 35, 1329-1343 (2012).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> The Plant Journal. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+dimensions+for+VIGS+in+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New dimensions for VIGS in plant functional genomics.</a> Trends in Plant Science. 16, 656-665 (2011).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+can+persist+for+more+than+2+years+and+also+be+transmitted+to+progeny+seedlings+in+Nicotiana+benthamiana+and+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing can persist for more than 2 years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 797-806 (2011).</li>
<li>Bombarely, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+draft+genome+sequence+of+Nicotiana+benthamiana+to+enhance+molecular+plant-microbe+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A draft genome sequence of Nicotiana benthamiana to enhance molecular plant-microbe biology research.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 1523-1530 (2012).</li>
<li>Sharma, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+silencing+of+WIPK+and+SIPK+genes+reduces+resistance+to+a+bacterial+pathogen%2C+but+has+no+effect+on+the+INF1-induced+hypersensitive+response+%28HR%29+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genomics%22%5BJournal%5D)">Virus-induced silencing of WIPK and SIPK genes reduces resistance to a bacterial pathogen, but has no effect on the INF1-induced hypersensitive response (HR) in Nicotiana benthamiana.</a> Mol Gen Genomics. 269, 583-591 (2003).</li>
<li>Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+forward+genetics+based+on+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing.</a> Current Opinion in Plant Biology. 2, 109-113 (1999).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO Journal. 22, 5690-5699 (2003).</li>
<li>Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPKKK%5Balpha%5D+is+a+positive+regulator+of+cell+death+associated+with+both+plant+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MAPKKK[alpha] is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease.</a> EMBO Journal. 23, 3072-3082 (2004).</li>
<li>Wang, K., Senthil-Kumar, M., Ryu, C. -M., Kang, L., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosterols+play+a+key+role+in+plant+innate+immunity+against+bacterial+pathogens+by+regulating+nutrient+efflux+into+the+apoplast%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phytosterols play a key role in plant innate immunity against bacterial pathogens by regulating nutrient efflux into the apoplast.</a> Plant Physiology. 158, 1789-1802 (2012).</li>
<li>Wang, K., Kang, L., Anand, A., Lazarovits, G., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+in+planta+bacterial+infection+at+both+cellular+and+whole-plant+levels+using+the+green+fluorescent+protein+variant+GFPuv%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Monitoring in planta bacterial infection at both cellular and whole-plant levels using the green fluorescent protein variant GFPuv.</a> New Phytologist. 174, 212-223 (2007).</li>
<li>Ratcliff, F., Martin-Hernandez, A. M., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advance%3A+Tobacco+rattle+virus+as+a+vector+for+analysis+of+gene+function+by+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Technical Advance: Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing.</a> The Plant Journal. 25, 237-245 (2001).</li>
<li>MacFarlane, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+tobraviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the tobraviruses.</a> Journal of General Virology. 80, 2799-2807 (1999).</li>
<li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+plant+genes+involved+in+Agrobacterium-mediated+plant+transformation+by+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of plant genes involved in Agrobacterium-mediated plant transformation by virus-induced gene silencing.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 41-52 (2007).</li>
<li>Liu, E., Page, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cDNA+libraries+for+virus-induced+gene+silencing+%28VIGS%29+using+tobacco+rattle+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus.</a> Plant Methods. 4, 5(2008).</li>
<li>Velásquez, A. C., Chakravarthy, S., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+%28VIGS%29+in+Nicotiana+benthamiana+and+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and tomato.</a> J. Vis. Exp. (28), e1292(2009).</li>
<li>Peart, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligase-associated+protein+SGT1+is+required+for+host+and+nonhost+disease+resistance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+99%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligase-associated protein SGT1 is required for host and nonhost disease resistance in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99. , 99-10869 (2002).</li>
<li>Oh, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+Types+I+and+II+nonhost+resistance+using+expression+patterns+of+defense-related+genes+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Insight into Types I and II nonhost resistance using expression patterns of defense-related genes in tobacco.</a> Planta. 223, 1101-1107 (2006).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. RNAi and Plant Gene Function Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSenthil-Kumar%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Kodama, H., Komamine, A. 744, Humana Press. 13-25 (2011).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Plant immuniteit beperkt de groei van nonhost ziekteverwekkers en dus weinig of geen groene fluorescentie wordt uitgezonden van vector-controle bladeren van de planten geënt met nonhost ziekte onder lange golflengte UV-licht (Figuur 3D). Wanneer een gen voor nonhost weerstand zwijgen, het gen tot zwijgen planten bevorderen de groei van nonhost pathogeen en groene fluorescentie wordt waargenomen (figuur 3E). Dit is het uitgangspunt bij de in dit manuscript beschreven werkwijze. Deze meth...

Nonhost weerstand is de weerstand van alle plantensoorten tegen rassen van een bepaalde ziekteverwekker 1,2. Dit zorgt voor breed spectrum en duurzame ziekte resistentie in planten 2,3. Echter, het mechanisme, met name tegen bacteriële pathogenen, niet goed begrepen 4. Screening voor mutanten of zwijgen planten die compromis nonhost weerstand, en hoge doorvoer transcriptprofilering voor de identificatie van differentieel tot expressie genen tijdens nonhost weerstand 5-9 zijn twee belangrijke benaderingen eerder gebruikt voor het ontleden van bacteriële nonhost weerstand. Omdat nonhost weerstand wordt geregeld door een complex mechanisme (s) 4 met betrokkenheid van vele genen, een high throughput functionele genomics benadering voor genidentificatie is cruciaal voor een beter begrip van de nonhost weerstandsmechanisme (s). Virus-geïnduceerde genuitschakeling (VIGS) is met succes gebruikt om endogene planten zwijgengenen in veel plantensoorten 10,11. Nicotiana benthamiana is een van de meest geschikte planten voor VIGS 10,12 en zijn ontwerp-genoom sequentie is nu verkrijgbaar 13. Tobacco rattle virus (TRV) gebaseerde VIGS is op grote schaal gebruikt als reverse genetics hulpmiddel om genen die betrokken zijn bij nonhost weerstand 2,4,14 karakteriseren. Dit VIGS vectoren en derivaten zijn nu beschikbaar via Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, <a href="http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html</a> ). VIGS is ook gebruikt als een forward genetics hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij planten immuniteit 15-17, vooral nonhost weerstand 6,18. Beoordelen van overgevoeligheidsreactie (HR)-gemedieerde celdood geïnduceerd door planten tegen een specifiek nonhost ziekteverwekker en de beoordeling van de ziekte geïnduceerde celdood zijn twee belangrijke tests voornamelijk gebruikt voor identifying gevoelige gen zwijgen planten. Echter, wordt HR celdood geïnduceerd alleen tegen type-II nonhost pathogenen en niet tegen het type-I nonhost ziekteverwekkers 2. Vandaar, HR testen kunnen niet worden universeel gebruikt voor nonhost weerstand strategieën gebruikt door planten te identificeren, met name tegen de brede waaier van het type-I nonhost ziekteverwekkers. Ook, gedeeltelijk verlies van nonhost resistentie in een gen zwijgen installatie niet altijd tot ziekteverschijnselen 6 en derhalve ziekte puntentelling niet worden gebruikt voor het identificeren van planten compromitteren nonhost weerstand. In tegenstelling, de beoordeling van de groei van pathogenen in de nonhost gen zwijgen planten is een betere methode voor het bestuderen van het verlies van nonhost resistentie gen in planten zwijgen. Vergeleken met conventionele groei assay 6,19, een snellere methode om nonhost bacteriegroei het gen zwijgen planten kan de tijd die forward genetics screening verkorten. We eerder gemeld een werkwijze voor het observeren van bacteriënl pathogeen groei op bladeren met het blote oog onder ultraviolet (UV) licht met behulp van bacteriën uiten van groen fluorescerend eiwit (GFP) 19. In dit manuscript demonstreren we de bruikbaarheid van GFPuv expressie nonhost bacteriële pathogenen voor gemakkelijke identificatie van gen tot zwijgen planten die worden gecompromitteerd nonhost resistentie. Deze methode is nauwkeurig voor de identificatie van gevoelige planten en vatbaar voor high throughput screening.

<table><tbody><tr><td>96-well U-bottom plates</td><td>Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>35-3077</td><td></td></tr><tr><td>96-pin replicator stainless steel</td><td>Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap</td><td>Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)</td><td>6283K50</td><td>Manufacturer ID 95-0127-01 </td></tr><tr><td>Stuart SC6 colony counter</td><td>Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK</td><td>SC6PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350</td><td>SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)</td><td>Custom synthesized</td><td></td></tr><tr><td>MES, Monohydrate </td><td>VWR international (Radnor, PA, USA)</td><td>CAS No. 145224-94-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone (Dimethoxy-4&rsquo;-hydroxyacetofenon) </td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77)</td><td>Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)</td><td>VIS-30</td><td></td></tr></tbody></table>

vigs-mediated forward genetics screening voor de identificatie van genen betrokken bij nonhost resistance

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost ziekte resistentie van planten tegen bacteriële ziekteverwekkers wordt bestuurd door complexe verdedigingsmechanismen. Inzicht in dit mechanisme is van belang voor het ontwikkelen van duurzame ziekte-resistente planten tegen brede waaier van ziekteverwekkers. Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) gebaseerde forward genetics screening is een nuttige aanpak voor de identificatie van het verdedigingsmechanisme van planten genen meegeven nonhost weerstand. Tobacco rattle virus (TRV) gebaseerde VIGS vector is de meest efficiënte VIGS vector to-date en is efficiënt gebruikt om endogene doelwitgenen zwijgen in Nicotiana benthamiana. In dit manuscript, demonstreren we een forward genetics screening aanpak voor het tot zwijgen brengen van de individuele klonen uit een cDNA-bibliotheek in N. benthamiana en de beoordeling van de respons van gen tot zwijgen planten voor gecompromitteerde nonhost verzet tegen nonhost pathogenen, Pseudomonas syringae pv. tomaat T1, P. syringae pv. glycINEA, en X. campestris pv. vesicatoria. Deze bacteriële pathogenen zijn ontworpen om express GFPuv eiwitten en hun groene fluorescerende kolonies zichtbaar met het blote oog onder UV-licht in de nonhost pathogeen geënte planten als draaid doelgen is betrokken in het meegeven nonhost weerstand. Dit vergemakkelijkt betrouwbare en snellere identificatie van gen tot zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Verder kan veelbelovende kandidaat-gen gegevens worden gekend door sequencing de plant geninsert in TRV vector. Hier laten we de high throughput capaciteit van VIGS gemedieerde forward genetics genen betrokken bij nonhost weerstand identificeren. Ongeveer, kan 100 cDNA individueel tot zwijgen worden gebracht in ongeveer twee tot drie weken en hun relevantie in nonhost weerstand tegen verscheidene nonhost bacteriële pathogenen kan worden bestudeerd in een week daarna. In dit manuscript, sommen we de gedetailleerde stappen die betrokken zijn bij deze screening. VIGS-gemedieerde forward genetics screening aanpak kan worden uitgebreid niet alleen om de identificatie van genen die betrokken zijn bij nonhost verzet, maar ook aan het bestuderen van genen meegeven van verschillende biotische en abiotische stress tolerantie in verschillende plantensoorten.

Belangrijkste doel van deze studie is om een methode aan te tonen voor een eenvoudige en nauwkeurige identificatie van gen tot zwijgen N. benthamiana planten die worden aangetast voor nonhost weerstand. Er zijn vier belangrijke stappen in deze methode. Eerste stap is om individueel zwijgen groot aantal genen met behulp van TRV-VIGS. We hadden ongeveer 5.000 genen 6,18 zwijgen over een periode van ongeveer 1,5 jaar gebruik van het protocol in figuur 1. Sommige genen tot zwijgen plante...

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Het algemene doel hier is om de methodologie van virus-geïnduceerde gen-silencing te demonstreren voor het identificeren van genen die betrokken zijn bij de resistentie van niet-gastheren, om zo VIGS van de endogene plant te bereiken. Inoculeer voor het doelgen Nicotiana hamama-planten met een tobacco rattle virus-vector die een fragment van het doelgen bevat; bereid vervolgens culturen van de pathogenen van de niet-gastheren voor die het groen fluorescerend proteïne tot expressie brengen en inoculeer deze op de bladeren van de planten met gene silencing. Beoordeel daarna de groen fluorescerende kolonies van de pathogenen van de niet-gastheren onder UV-licht in het donker.Om gen-gesilencete planten te identificeren die de resistentie van niet-gastheren compromitteren, wordt het doelgen geïdentificeerd door het insert in de virusvector te sequensen. Over het algemeen stelt deze methodologie van VIX-gemedieerde forward genetische screening onderzoekers in staat om eenvoudig genen te identificeren die betrokken zijn bij de resistentie van niet-gastheren van planten tegen bacteriële pathogenen. In een korte periode hebben we vastgesteld dat het essentieel is om virus-geïnduceerde gen-s

vigs-mediated-forward-genetics-screening-for-identification-genes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie...

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

Stressbestendigheid is een van de kenmerken voor een lange levensduur en is bekend genetisch geregeld. Hier, een onbevooroordeelde high-throughput methode ontwikkelden we voor het screenen op mutaties die stress-resistentie in ES-cellen waarmee de muis modellen te ontwikkelen voor een lange levensduur studies.

Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen

Details worden gepresenteerd over hoe QTL mapping met een genoomkaart op basis van een genoom sequentie kan worden gebruikt om een ​​drug resistentie gen in Toxoplasma gondii te identificeren en hoe dit kan worden gecontroleerd met het CRISPR / Cas9 systeem dat efficiënt een genomisch doel bewerkt, in dit geval de Drug resistentie gen.

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Insertionele mutagenese is een essentieel hulpmiddel in forward genetics voor het identificeren van functionele genomische elementen. Hier beschrijven we het op insertie gebaseerde scherm voor functionele elementen en transcripten (InSET), een methode voor het detecteren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een op lentivirus gebaseerde insertiemutagenese-celbibliotheek.

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

Nieuwe gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie kan worden geïdentificeerd door middel van cel-gebaseerde genoom-brede verlies van functie RNAi screening.

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

Leer VIGS-gebaseerde forward genetics screening om genen te identificeren die betrokken zijn bij nonhost-resistentie in Nicotiana hamama. Deze methode combineert virus-geïnduceerde gen-silencing met GFPuv-expresserende pathogenen voor efficiënte identificatie.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Meer video's verkennen