Name: Imaging desnaturalizadas colágeno Strands En vivo Y Ex vivo A través de Photo-desencadenada Hibridación de Caged colágeno Mimetic Péptidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a visualizar fibras de colágeno desnaturalizado in vivo y ex vivo mediante hibridación fotoactivada de péptidos miméticos en ratones. Esta técnica de imagen infrarroja permite estudiar la remodelación tisular con aplicaciones diagnósticas.

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Los autores agradecen a Gilbert verde para la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por becas de NIAMS / NIH (R01-AR060484) y DOD (W81XWH-12-1-0555) otorgado a SMY y de NIH (CA92871 U24 y U54 CA151838) otorgados a MGP

Se realizaron todos los estudios con animales de acuerdo con las regulaciones del Comité de Cuidado de Animales y Uso Johns Hopkins. 1. Infrarrojo Cercano (NIR) Fluorescencia de Imagen de Skeletal colágeno Remodelación En vivo <ol><li> Foto-activación de la inyección en la vena de la cola de CMP y enjaulado <ol><li> Preparar 110 l de solución de CMP enjaulado para cada ratón (20-30 g de peso del ratón): 100 l de solución para la dosificación, con un extra de 10 l cojín para la posible pérdida durante el traslado y la inyección. Mezclar 11 l de IR680-Ahx-NB (GPO) 9 solución madre (400 M) con 11 l de cisteína 100 mM en solución PBS estéril, y luego obtener un volumen total de 110 l con tampón PBS 1x. La solución de péptido final contiene 4 nmol de IR680-Ahx-NB (GPO) 9 y 1 nmol de cisteína en 100 l de solución de 1x PBS. </li><li> Lentamente withdraw la solución de péptido en una jeringa de insulina de 0,5 ml con un barril transparente y un pequeño calibre (28-30 G) de la aguja, y cuidadosamente eliminar las burbujas de aire. Encienda la lámpara UV para que la lámpara se caliente durante 2-5 min. </li><li> Coloque la jeringa que contiene péptido-directamente bajo la lámpara UV (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) durante 5 min para permitir la foto-activación. </li><li> Mientras tanto, coloque el ratón en una inmovilización bajo una lámpara caliente; etiquetar el ratón con un marcador permanente en la cola o de otros métodos de identificación como marca auricular o del pie del tatuaje, y la desinfección de la cola con 70% de alcohol. </li><li> Inmediatamente después de la activación UV, inyectar 100 l de UV-activado IR680-Ahx-NB (GPO) 9 solución en la vena de la cola, preferentemente en la parte posterior de la cola. Coloque el ratón de nuevo a la jaula después de la inyección. </li></ol></li><li> NIR imágenes de fluorescencia de la actividad de la remodelación del colágeno <ol><li> Conjuntola placa de calentador de la cama de formación de imágenes de la impresora de imágenes impulso de 37 ° C utilizando la perla Impulso de software 2.0. </li><li> Ponga el ratón desnudo o afeitado a la cámara de la inducción anestésica que contiene 2% de isoflurano en oxígeno. Verifique la profundidad del plano de la anestesia por la falta de movimiento del ratón durante la manipulación y el control de la frecuencia de las respiraciones (~ 1/seg). </li><li> Después de anestesiar el ratón, abrir el cajón de imágenes Pearl, y colocar el animal en la cama de imágenes. Quite rápidamente la clavija de cono de la nariz, y deslice el hocico del ratón dentro del cono de la nariz para mantener el ratón bajo anestesia (un 2% de isoflurano en oxígeno suministrado a 2 l / min a través del cono de la nariz) durante el proceso de obtención de imágenes. Una vez que el ratón está en su lugar, cierre el cajón. </li><li> Cuando aparezca la indicación &quot;Listo&quot; en el panel de software de imagen, haga clic en el &quot;700 canales&quot;, &quot;luz blanca&quot; y &quot;85 micras&quot; cajas seguido por el &quot;botón de adquirir una imagen&quot;. NIR (excitación 685 nm, emisión 720 nm) de und blancas fotografías de luz entonces serán tomadas con el enfoque automático y la exposición. </li><li> Cuando se completa la grabación, abra el cajón, gire el ratón, y adquirir imágenes desde otro ángulo. El ratón se puede colocar con la parte frontal (ventral), espalda (dorsal) o en los lados frente a la cámara. Estrechas tiras de cinta se pueden utilizar como medios de coerción para estirar sus extremidades para conseguir la mejor vista de la región de interés (por ejemplo, las costillas, los tobillos y las muñecas). </li><li> Un tiempo adecuado para observar la captación ósea de IR680-CMP es entre 24-96 h después de la inyección (hpi), basado en la dosis (~ 4 nmol / ratón). Para obtener imágenes de alta resolución, sacrifica el ratón por dislocación cervical, mientras que bajo anestesia profunda a las 72 hpi, quitar la piel (y el pelo) con fórceps quirúrgicos y tijeras, y la imagen por NIR fluorescencia como se ha descrito anteriormente. </li><li> Analizar las imágenes de fluorescencia NIR adquiridos. </li></ol></li></ol> 2. Visualización de colágenos en ex vivo0; secciones de tejido <ol><li> Preparación de materiales <ol><li> Preparar 1 ml de 10% (w / v) de solución de BSA en agua desionizada. Descongelar 1 ml de suero de cabra en un baño de agua a temperatura ambiente. Cortar unos trozos de Parafilm en el tamaño de aproximadamente 2 cm x 5 cm. </li><li> Preparar 10 ml de tampón de bloqueo mediante la mezcla de 500 l de suero de cabra, 1 ml de 10x PBS y 8,5 ml de agua desionizada. Preparar 5 ml de tampón de dilución de CMP por dilución de 50 l de 10% (w / v) de BSA con 4,45 ml de agua desionizada y 500 l de 10x de PBS. </li><li> Diluir las soluciones madre de carboxifluoresceína marcado enjaulado CMP, CF NB (GPO) 9 (480 M), a 5 M utilizando el tampón de dilución CMP. La concentración óptima de CMP varía desde 2,5 hasta 30 mM, dependiendo del tipo de tejidos y la naturaleza de las muestras de tejido. Se recomienda un volumen de 100 l para la tinción de una sección de deslizamiento del tejido. Guarde el solut CMP formuladoiones en la oscuridad. </li><li> Deje que el ratón se desliza tejido cornea alcancen la temperatura ambiente. Incubar los portaobjetos en tampón PBS 1x durante 5 min. Los tejidos de córnea de ratón utilizadas en esta demostración se han prefijado con 4% de paraformaldehído en solución de PBS durante 1 hora, criopreservados en Tissue-Tek octubre medio, cryosectioned a 8 micras de espesor, y montados en portaobjetos de vidrio cargados. </li></ol></li><li> Tinción de tejidos y la formación de imágenes <ol><li> Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda. Para cada diapositiva, aplicar 0,5 ml de solución de bloqueo e incubar los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente. Eliminar la solución de bloqueo por borrar las diapositivas sobre una toalla de papel. </li><li> Aplicar aproximadamente 100 l de CF NB (GPO) 9 soluciones para cubrir las secciones de tejido de cada diapositiva. Incubar los portaobjetos durante 2 minutos para permitir que la solución de CMP a impregnar los tejidos. </li><li> Encienda la lámpara UV. Cuando la lámpara se calienta, exponer el tejido cubierto-CMP sícciones a la luz ultravioleta durante 6 min (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) para desproteger las CMP enjaulados. Después de la exposición UV, cubrir las secciones de tejido de cada portaobjetos con un trozo de Parafilm para evitar el secado. Colocar los portaobjetos en la cámara húmeda e incubar a 4 º C durante 2 horas. </li><li> Prepare una dilución 1:3000 de solución DAPI en 1x PBS. Después de la tinción CMP, retire suavemente el Parafilm con unas pinzas, y borra las diapositivas en una toalla de papel para eliminar el exceso de solución de CMP. Aplicar aproximadamente 100 l de soluciones DAPI diluidas a cada diapositiva del tejido y se incuba durante 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Después de la tinción, sumergir los portaobjetos en tampón PBS 1x en un frasco de tinción durante 5 min. Repita esto 3 veces en 1x PBS fresca para lavar los agentes de tinción no consolidados. </li><li> Añadir una gota de medio de montaje en la sección de tejido y se cubre con un cubreobjetos de vidrio, evitando que queden atrapadas burbujas de aire. Ponga los portaobjetos en una bandeja deslizante de cartón para protegerlos de la luz. </li><li>Imagen de las fibras de colágeno (canal FITC) y núcleos celulares (DAPI canal) en las diapositivas de tejido utilizando un microscopio de fluorescencia. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Como puede verse en este protocolo, la entrega de CMP es sencillo ya que la radiación UV-activación de los CMP enjaulados es el único paso adicional para los protocolos de inyección vena de la cola común 19. La clave es la inyección de las sondas de péptidos en un estado de un solo capítulo uncaged y metaestable. El grupo jaula impide CMP de auto-ensamblaje y unión a colágeno (Figura 2 B) hasta que salga por la luz UV y en ese momento el CMP comienza a doblar en triple hélice. La formulación inyectable contiene cisteína, que puede reaccionar rápidamente con el grupo jaula escindido durante la irradiación UV para minimizar la toxicidad. Numerosos ratones con diferentes cepas (por ejemplo SKH-1 y DR-1) han sido probados utilizando esta formulación, y no detectamos cualquier defecto de salud mental o de otro tipo en estos ratones de hasta seis meses. Si la inyección no sigue inmediatamente después de la exposición UV, las CMP se pliegan en triples hélices homotrimérica, que no tienen la capacidad de hibridación. Figura 2C muestra un caso extremo en que antes de la inyección de las CMP fueron totalmente vuelven a montar en triples hélices por el tiempo de retardo largo (&gt; 2 días). Para evitar este problema, solución CMP debe ser preparado en una concentración relativamente baja (por ejemplo, ~ 40 M), y se inyectó en los ratones inmediatamente después de UV-decaging. Debido a la lentitud de la triple hélice de plegado de las CMP en condiciones diluidas (media hora de replegamiento:&gt; 50 min) y la exposición UV corta y el tiempo de inyección (5 ~ 7 min total), la mayoría de las CMP entrar en el torrente sanguíneo en un solo hebra se forman cuando se sigue este protocolo. Se espera que una vez inyectado, CMP para permanecer como hebras individuales, como la concentración se reduce por un factor de 20 en la piscina de sangre, conduciendo a la reducción espectacular en la tasa de volver a montar 18. Si la inyección se retrasa (por ejemplo, debido a la manipulación de los animales) y se sospecha replegamiento homotrimérica, los péptidos parcialmente ensamblados se pueden reactivar por calentamiento por encima de 7076; C para disociar el CMP a hebras individuales, seguido de enfriamiento rápido y de inyección. Aunque es menos conveniente, tales CMP-disociada de calor también se muestran los resultados esperados de la dirección in vivo (Figura 2D). En esta demostración, se utilizaron ratones desnudos para imágenes de fluorescencia de NIR porque hasta el 50% de la señal de NIR puede ser bloqueada por el pelo. Cuando se trabaja con modelos de ratones de pelo (especialmente las que tienen pelos negros), se recomienda rasurar el ratón en la región de interés antes de la proyección de imagen utilizando una máquina de afeitar eléctrica o removedor de pelo. En la Figura 1, hay señales de falsos positivos de la región abdominal del animal, que es causada por auto-fluorescencia de clorofila en la dieta de los animales. Tales señales de fondo se pueden reducir de manera significativa al cambiar el ratón para dietas purificadas aproximadamente 4 días antes de la imagen. Como se ve en las figuras 1 y 2A, hay fuertes absorciones CMP en el giro de colae. Por lo tanto, para evitar artefactos que resultan de las inyecciones imperfectos vena de la cola, se recomienda la inyección en la parte posterior de la cola de modo que el lugar de la inyección no se captura en la imagen de fluorescencia. El CMP etiquetada permite la focalización y las imágenes de los lugares específicos de la remodelación del colágeno in vivo que son difíciles de detectar por otros métodos. Por ejemplo, los ensayos de sangre y orina basados ​​en ELISA son sensibles para los fragmentos de telopéptido de colágeno troceados, pero el método no puede localizar la fuente de la facturación de colágeno, porque se dirige a antígenos solubles. Las principales limitaciones de la técnica de imagen in vivo en el uso de NIR etiquetados CMP son la atenuación de la profundidad de penetración y de temple por proximales agrupado glóbulos rojos como la hemoglobina es un inhibidor endógeno de 680/710 nm colorantes NIR. Las futuras aplicaciones de CMP en imágenes in vivo incluyen SPECT o PET utilizando CMP marcadas con radionucleidos emisores gamma directos o con positrones emitters, para el diagnóstico de estados de enfermedad que implican la remodelación del colágeno (por ejemplo, la osteoporosis, la artritis, la aterosclerosis, y fibrosis). Estos análogos CMP radiomarcados eliminarán las limitaciones de la pérdida de señal debido a la profundidad del tejido y la presencia de glóbulos rojos agrupados, y permitirá a las mediciones cuantitativas de los tejidos enfermos. Además, el tiempo de formación de imágenes relativamente tarde (por ejemplo, 48 a 96 hpi) como resultado de la lenta holgura de unión y de CMP podría hacer difícil seguir los rápidos cambios en la remodelación del colágeno. Esta limitación podría superarse con uso de ingeniería de la cinética de unión y la afinidad de los agentes de formación de imágenes CMP. Desde CMP se une a colágenos desnaturalizados que tienen poca estructura, la formación de imágenes de colágeno a base de CMP es complementario al segundo microscopía de generación de armónicos que sólo pueden fibras de colágeno de imagen 5. Cuando la tinción los cortes de tejido con la etiqueta fluorescente CMP, encontramos que es beneficioso para incubar lamuestras en las soluciones de péptidos UV-activado a 4 ° C, debido a que la hibridación de triple hélice se facilita a temperatura menor de 1,20. También se encontró que la inmersión de los portaobjetos en tampón PBS fresco en un tarro de tinción es la forma más eficaz para lavar CMP no unidos, que funciona mucho mejor que simplemente pipeteando tampones de lavado sobre las muestras. La hebra CMP-colágeno de hibridación es muy específica y robusta, por lo tanto el protocolo de tinción sencilla se presenta en este vídeo puede ser modificado fácilmente para costaining biomarcadores adicionales, y para la identificación de colágenos degradadas en secciones de tejido fijadas. Esta es una alternativa eficaz y conveniente para el uso de anticuerpos anti-colágeno para la detección de colágenos fibrosos en diversas muestras histológicas.

El colágeno, la proteína más abundante en mamíferos, juega un papel crítico en el desarrollo y regeneración de tejidos mediante el apoyo a la proliferación y diferenciación de las células. Mientras que los colágenos fibrosos (por ejemplo, tipo I, II), en los tejidos conectivos dar resistencia mecánica a los tejidos, el colágeno de tipo red (tipo IV) forman andamio básica de la membrana basal donde las células se unen y forman tejidos organizados. La remodelación del colágeno implica tanto la degradación del colágeno (por proteasas) y síntesis (promovida por factores de crecimiento). Aunque la remodelación del colágeno, por ejemplo en el hueso, es parte del proceso normal de renovación de los tejidos, el exceso de actividad de remodelación, o su ocurrencia en lugares anormales, típicamente indica cicatrización de la herida respuesta a una lesión o condiciones patológicas crónicas tales como el cáncer, la osteoporosis, la artritis, y la fibrosis 1-4. La posibilidad de directamente colágenos imagen experimenta una remodelación in vivo podría conducir a la comprensión de los avancesiones de estas enfermedades, así como de nuevos diagnósticos y productos terapéuticos. Por ejemplo, imágenes en vivo puede proporcionar información sobre la severidad y la localización de las enfermedades, y también puede ser utilizado para evaluar la eficacia de nuevos agentes terapéuticos. Multifotónica microscopía de barrido láser y segunda generación de armónicos se han aplicado a los colágenos fibrilares imagen para el seguimiento de remodelación de la matriz extracelular en el tumor en ratones vivos 5. Sin embargo, esta técnica requiere los animales para ser montado con cámaras de pliegues cutáneos dorsal transparentes, que es un procedimiento invasivo. La imagen directa y no invasiva de la remodelación del colágeno se beneficiará de una sonda que se dirige específicamente colágeno experimenta una remodelación. Esta sonda es difícil de preparar, ya que las necesidades de distinguir los colágenos de remodelación de los colágenos intactas y maduros, que son abundantes en los tejidos normales 6. El colágeno se compone de estructura extremadamente raro proteína llamada triple hélice, que esescindida por proteasas tales como las metaloproteinasas de matriz (MMP) durante la remodelación del colágeno. Los fragmentos de colágeno troceados pierden su estructura helicoidal triple y se convierten en hebras desplegada (gelatina), que se digirió adicionalmente por las proteasas no específicas 1. Recientemente se ha descubierto que el péptido mimético de colágeno (CMP) que tiene la propensión a plegarse en la estructura de triple hélice puede dirigirse específicamente a cadenas de colágeno que se disocian de su estado de triple hélice por cualquiera de desnaturalización por calor o por la degradación enzimática 1,7. La unión es impulsado principalmente por la hibridación de triple hélice entre CMP monoméricas y las hebras de colágeno desnaturalizado. Debido CMP auto-ensamblan para formar triples hélices homotrimérica a temperatura ambiente con poca fuerza impulsora para la hibridación de colágeno, un CMP enjaulado [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, denominado NB (GPO) 9, O: hidroxiprolina], fue desarrollado , que contiene un nitrobencilo-foto escindiblegrupo (NB) unido a la glicina central del péptido. El grupo jaula NB impide estéricamente el CMP de plegado en triple hélice; sin embargo, la eliminación del grupo jaula por irradiación UV desencadena inmediatamente el plegamiento helicoidal triple y colágeno de hibridación 1. Cuando CMP monoméricas etiquetadas con infrarrojo cercano (NIR) fluoróforos se sistémicamente entregados a modelar los ratones, pueden dirigirse específicamente y permitir de imágenes in vivo de colágenos desnaturalizados en los tejidos sometidos a normal (por ejemplo en el hueso y el cartílago) y patológicos (por ejemplo, en tumores) remodelación 1 . CMP marcados con fluorescencia también se pueden utilizar para obtener imágenes de colágenos en secciones de tejidos histológicos. En el estudio histológico, los tejidos cosechados a menudo se conservan mediante fijación para mantener los componentes celulares y la morfología general de tejido de deterioro. Los procedimientos de fijación, que incluyen calor, y el tratamiento con disolventes orgánicos, y química cruz-linkinreactivos g (por ejemplo paraformaldehído), desnaturalizar la estructura helicoidal triple del colágeno 8. Esta desnaturalización genera sitios para la hibridación de CMP. Se ha demostrado que CMP marcados con fluorescencia pueden unirse específicamente a los colágenos en secciones de tejido fijos (por ejemplo, piel, córnea y hueso) incluso más eficazmente que un anticuerpo anti-colágeno, lo que permitió la identificación fácil de las condiciones patológicas en tejidos hepáticos fibróticos 9. El CMP se dirige a hebras de colágeno desnaturalizado que contienen la secuencia de aminoácidos de los motivos de triple hélice, que es común a todos los tipos de colágenos. Por lo tanto CMP puede ser considerado como un agente de tinción de colágeno de amplio espectro. A continuación, presentamos los procedimientos experimentales detallados para i) obtener imágenes cadenas desnaturalizadas de colágeno in vivo y ii) visualización de colágenos en ex vivo secciones de tejido utilizando CMP enjaulados marcados con fluorescencia. Una etiqueta de NIR, IR680, se conjugó con el CMP enjaulado para imágenes en vivo, rodeado poe carboxifluoresceína (CF) se utilizó en el trabajo de tinción de tejidos para su compatibilidad con los microscopios de fluorescencia estándar. Este protocolo se centra en la aplicación de imágenes de CMP en relación con la remodelación del colágeno. Los métodos para la síntesis de CMP se pueden encontrar en los informes anteriores 1,7,9-15. En este informe de vídeo, de imágenes tejidos óseos en ratones normales y las secciones de tejido de córnea de ratón fueron elegidos para fines de demostración, sin embargo los métodos presentados aquí se pueden aplicar fácilmente a muchas patologías y modelos biológicos que implican la remodelación del colágeno (por ejemplo, tumores, curación de heridas), como así como a casi cualquier muestra de tejido prefijo que contiene colágenos.

<table><tbody><tr><td>IRdye 680RD Maleimida (IR680)</td><td>LI-COR</td><td>929-71050</td><td>Utilizado para el etiquetado CMP, protocolo presentado en otro lugar1.</td></tr><tr><td>5(6)-Carboxifluoresceína</td><td>Sigma</td><td>21877-5G-F</td><td>Se utiliza para el etiquetado de CMP, protocolo presentado en otro lugar12.</td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>Advanced Chemtech</td><td>YC2200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Mayordomo Suministro Veterinario 4</td><td>/4/5260</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche Applied Science</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Fluoroshield</td><td>Sigma</td><td>F6182-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>lámpara UV</td><td>McMaster-Carr</td><td>1447T17</td><td></td></tr><tr><td>Pearl generador de imágenes por impulsos</td><td>LI-COR</td><td>9400</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas y tijeras quirúrgicas Sistema de</td> tinción de portaobjetos EasyDip Light Labs M900-12B Bandeja portaobjetos para microscopio de cartón de 20 plazas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Light Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher</td><td>12-545-c</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-E</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging desnaturalizadas colágeno strands<em&gt; en vivo</em&gt; y<em&gt; ex vivo</em&gt; a través de photo-desencadenada hibridación de caged colágeno mimetic péptidos

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

El colágeno es un componente estructural de la matriz extracelular que soporta la formación de tejido y mantenimiento. Aunque la remodelación del colágeno es una parte integral de la renovación del tejido normal, cantidad excesiva de actividad de remodelación está implicado en los tumores, artritis, y muchas otras condiciones patológicas. Durante la remodelación del colágeno, la estructura helicoidal triple de las moléculas de colágeno se rompe por las proteasas en el medio ambiente extracelular. Además, los colágenos presentes en muchas muestras de tejidos histológicos están parcialmente desnaturalizados por los procesos de fijación y de preservación. Por lo tanto, estas cadenas de colágeno desnaturalizado puede servir como dianas eficaces para la formación de imágenes biológica. Hemos desarrollado previamente un péptido mimético de colágeno enjaulado (CMP) que puede ser activado por la foto para hibridar con hebras de colágeno desnaturalizado mediante la formación de la estructura de triple hélice, que es único para colágenos. Los objetivos generales de este procedimiento son: i) a la imagen de cadenas de colágeno desnaturalizado resulting de las actividades normales de remodelación in vivo, y ii) para visualizar los colágenos en ex vivo secciones de tejido usando las CMP enjaulados fotos por alarma. Para conseguir una hibridación eficaz y exitoso en vivo e imágenes ex vivo, CMP enjaulados marcados con fluorescencia son inmediatamente antes de la inyección intravenosa o bien activado por foto, o se activan directamente en cortes de tejido. Normal remodelación del colágeno esquelético en ratones desnudos y colágenos de ratón secciones de tejido de córnea prefijados son expuestas en este procedimiento. El método de imágenes basado en la tecnología de hibridación CMP-colágeno que aquí se presenta puede llevar a una comprensión más profunda del proceso de remodelación de tejidos, así como permitir el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico para las enfermedades asociadas con la actividad de remodelación alta colágeno.

La Figura 1 muestra un resultado típico de cómo la foto-desencadenado IR680-Ahx-(GPO) 9 distribuye en un ratón desnudo hembra SKH1 sano después de la inyección de post 24-96 horas. Se muestra la acumulación de CMP aparente en el esqueleto después de 24 hpi, en cuyo punto la mayor parte de los péptidos no unidos han sido talados en gran parte fuera. El proceso de CMP hibridar con las cadenas de colágeno remodelación parece relativamente lento, especialmente en contraste con otras sondas de imagen (por ejemplo, péptido RGD 16). Esto muy probablemente se debe a la velocidad de plegado lenta de la triple hélice del colágeno 17,18. Sin embargo, una vez hibridado, las hebras CMP están fuertemente ligados a los tejidos de colágeno, ya que sólo ligera reducción de la señal se ve después de 24 hpi (Figura 1). A las 96 hpi, la imagen de fluorescencia de NIR del ratón después de la eliminación de la piel demuestra claramente la captación ósea de IR680-Ahx-(GPO) 9 en la columna vertebral y las costillas, así como dentro de las rodillas, los tobillos,las muñecas y las mandíbulas inferiores (Figura 2A). In vivo tinción ex tejido, foto-desencadenó la etiqueta fluorescente-CMP enjaulados hibridan específicamente a las hebras de colágeno desnaturalizado en secciones de tejido. En la Figura 3, la tinción de CMP revela claramente las fibrillas de colágeno paralelas finas en el estroma de la córnea, lo que demuestra su uso como un agente de tinción específica de colágeno. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Figura 1. NIR imágenes de fluorescencia en serie de un ratón desnudo administran por vía intravenosa con foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 que muestra la captación ósea durante cuatro días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width = &quot;4 pulgadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. NIR imágenes de fluorescencia de ratones administrados con foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 (A), enjaulado IR680-Ahx-NB (GPO) 9 sin exposición UV (B), dobladas de triple hélice [IR680-Ahx-(GPO ) 9] 3 (C), o disociada de calor de una sola hebra IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) a 96 hpi después de la eliminación de la piel. focalización esquelético por el CMP sólo se puede observar en A y D. Señales de fluorescencia NIR se muestran en la escala de arco iris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografías de fluorescencia de un compañero del ratónsección de tejido RNeal prefijo en paraformaldehído, y se tiñeron con DAPI y foto-activado CF (GPO) 9 utilizando el Protocolo 2, que muestra estroma colágeno denso (manchado por la CMP, en verde), así como el epitelio celular y endotelio (manchado por DAPI, en azul ) (barra de escala: 100 micras).

Este procedimiento se muestra en vivo cerca de IR de imágenes de fluorescencia de las actividades de remodelación de colágeno en ratones, así como la tinción ex vivo de colágenos en secciones de tejido utilizando jaulas de colágeno péptidos miméticos que pueden ser desencadenados foto-para hibridar con los filamentos de colágeno desnaturalizado.

Imaging desnaturalizadas colágeno Strands<em&gt; En vivo</em&gt; Y<em&gt; Ex vivo</em&gt; A través de Photo-desencadenada Hibridación de Caged colágeno Mimetic Péptidos

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Los objetivos generales de los siguientes experimentos consisten en demostrar la obtención de imágenes in vivo de las actividades de remodelación del colágeno, así como la visualización ex vivo del colágeno y de secciones histológicas de tejidos mediante la hibridación de péptidos miméticos del colágeno. Esto se logra mediante el plegamiento de un péptido mimético del colágeno enjaulado en una hélice triple únicamente tras la irradiación con luz ultravioleta para obtener imágenes de la remodelación del colágeno in vivo; los péptidos miméticos del colágeno enjaulados marcados con el fluoróforo de infrarrojo cercano Fluor se activan mediante irradiación UV inmediatamente antes de la inyección intravenosa, lo cual escinde el grupo enjaulador y desencadena la hibridación del CMP con las cadenas de colágeno mediante la formación de una hélice triple. Para la tinción de tejidos ex vivo, los péptidos miméticos del colágeno enjaulados marcados con carboxifluoresceína se activan directamente con luz sobre secciones de tejido fijadas, lo que provoca la hibridación del péptido mimético del colágeno con las cadenas de colágeno desnaturalizadas presentes en la sección de tejido. Los resultados del análisis de imágenes mediante fluorescencia de infrarrojo cercano y microscopía de fluorescencia muestran la localización específica del CMP en cadenas de colágeno desnaturalizadas en tejidos en proceso de remodelación in vivo, así como en secciones de tejido fijadas, para preparar CMPs activados por luz para inyección intravenosa.Primero encienda la lámpara UV mientras la lámpara se calienta. Aspire lentamente el tinte recién preparado del infrarrojo cercano, solución de péptido CMP encapsulado marcado, en una jeringa de insulina de 0,5 mililitros con un cilindro transparente y una aguja de calibre 28 a 30. Luego, después de eliminar cuidadosamente cualquier burbuja de aire, coloque la jeringa directamente bajo la lámpara UV durante cinco minutos para fotoactivar el péptido.Mientras tanto, coloque al ratón en un sujetador bajo una lámpara calentadora. Etiquete la cola con un marcador permanente y luego desinfecte la cola con etanol al 70 % inmediatamente después de la activación fotónica. Inyecte 100 microlitros de la solución de péptido en la vena de la cola en el extremo posterior de la misma.Coloque el ratón nuevamente en la jaula después de la inyección para visualizar la actividad de remodelación del colágeno in vivo. Primero, utilice el software Pearl Impulse 2.0 para ajustar la placa calefactora de la camilla de imagen del impulsor de imagen a 37 grados Celsius. Luego, abra el cajón del impulsor de imagen y coloque un ratón desnudo anestesiado sobre la camilla de imagen.Una vez que el ratón esté en su lugar, cierre el cajón. Luego, cuando el instrumento indique listo en el panel del software de imagen, haga clic en los cuadros de luz blanca del canal 700 y de 85 micrones, seguidos del botón de adquirir imagen. Cuando la grabación haya finalizado, abra el cajón, gire al ratón y adquiera imágenes desde otro ángulo para obtener imágenes de alta resolución.De 24 a 96 horas después de la inyección. Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para retirar la piel del ratón y luego image el animal mediante fluorescencia en el infrarrojo cercano, tal como se acaba de demostrar con la fluorescencia en el infrarrojo cercano adquirida. Las imágenes pueden analizarse entonces para visualizar el colágeno y las secciones de tejido.Coloque los portaobjetos con córneas de ratón previamente equilibradas a temperatura ambiente en una cámara humidificada. A continuación, incube cada portaobjetos en 0,5 mililitros de solución de bloqueo a temperatura ambiente. Tras media hora, seque los portaobjetos sobre una toalla de papel para eliminar la solución de bloqueo y luego cubra cada sección de tejido con aproximadamente 100 microlitros de solución de CMP etiquetada con carboxifluoresceína para jaula durante dos minutos.Mientras la solución de CMP penetra en el tejido, caliente la lámpara UV y luego exponga las secciones de tejido cubiertas con CMP a la luz UV durante seis minutos para desproteger los CMPs fotoactivables. Después de la exposición a UV, cubra cada portaobjetos con un trozo de parafina para evitar que las secciones de tejido se sequen y almacene los portaobjetos en una cámara humedecida a cuatro grados Celsius durante dos horas. Después de la tinción con CMP, use un par de pinzas para retirar suavemente la parafina.Deposite los portaobjetos sobre una toalla de papel para eliminar cualquier exceso de solución CMP, y luego incube cada sección de tejido en aproximadamente 100 microlitros de solución dappy recién diluida durante un minuto a temperatura ambiente. A continuación, sumerja los portaobjetos tres veces en PBS dentro de un frasco de tinción durante cinco minutos, utilizando PBS fresco para cada lavado. Luego añada una gota de medio de montaje a cada sección de tejido y coloque una cubreobjetos de vidrio sobre cada portaobjeto.Con cuidado de evitar atrapar burbujas de aire, proteja los portaobjetos de la luz en una bandeja de cartón para portaobjetos. Finalmente, observe las fibras de colágeno mediante microscopía fluorescente. En este primer conjunto de imágenes, un resultado típico para la distribución del tinte infrarrojo seis 80 activado por luz, etiquetado como CMP enmascarado, y un ratón hembra sano SKH uno sin pelo.De 24 a 96 horas después de la inyección. Observe la acumulación aparente de CMP en el esqueleto a las 24 horas tras la inyección, momento en el cual la mayor parte de los péptidos no unidos han sido ampliamente eliminados a las 96 horas posteriores a la inyección. La imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano de un ratón despellejado demuestra claramente la captación esquelética de IR D six 80, CMP marcado, en la columna vertebral, las costillas, así como en las rodillas, tobillos, muñecas y mandíbulas inferiores.En la tinción de tejidos ex vivo, los CMP (péptidos de colágeno marcados con fluoróforo y fotoactivables) se hibridaron específicamente con las cadenas de colágeno desnaturalizadas en cortes de tejido, tras la activación mediante luz. En estas imágenes finales, la tinción con CMP revela claramente las finas fibrillas de colágeno paralelas del estroma corneal, lo que valida el uso de los CMP como agente de tinción específico para el colágeno. Los métodos de imagen aquí descritos, basados en la hibridación de CMP con colágeno, proporcionan a los investigadores una nueva herramienta para estudiar el proceso de remodelación tisular y podrían conducir al desarrollo de nuevos diagnósticos para enfermedades asociadas con una alta actividad de remodelación del colágeno, como el cáncer, la osteoporosis, la artritis y la fibrosis.

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Imaging desnaturalizadas colágeno Strands En vivo Y Ex vivo A través de Photo-desencadenada Hibridación de Caged colágeno Mimetic Péptidos (Video) | JoVE Journal

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