Name: Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Lernen Sie den Hornhaut-Mikrotest zur Untersuchung der Angiogenese bei der Maus. Diese Methode ermöglicht die quantifizierte Analyse von Gefäßwachstum in vivo und unterstützt die Entwicklung neuer Therapien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Kristin Johnson für die grafische Arbeit.

Alle Protokolle mit Tieren sind, die von der Institutional Animal Care und Use Committee im Kinderkrankenhaus Boston vorgestellt und genehmigt und werden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Labortierpflege (AAALAC) durchgeführt. Achten Sie darauf, sterile Instrumente und aseptischen techniqure verwenden, während der Durchführung des Verfahrens. 1. Herstellung der Pellets <ol><li> Wiegen Sie 10 mg von Sucralfat und 60 mg hydron mit der sterilen ungebeugt Spachtel. In getrennten Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Setzen Sie eine 1 cm quadratisches Stück von Mesh in eine sterile 10 cm Schüssel. Invertieren, so Netz ruht auf flachen Deckel. Beiseite stellen. </li><li> Fügen Sie 500 ul Ethanol zum hydron und Wirbel für mindestens 10 min. </li><li> Die entsprechende Menge von Wachstumsfaktor-(Standard: 20 ug für bFGF, 50 ug für VEGF) mit dem Sucralfat und kurz vortexen. Shop-Wachstumsfaktor in eine-80 ° C-Tiefkühler bei einer Konzentration von 1 mg / ml. Flüssigkeitsvolumen zugegeben wird, sollte ein Minimum von 20 ul, die Sucralfat vollständig benetzt zu gewährleisten, sollte jedoch 50 ul betragen. Größeres Volumen macht die Verdampfung der Flüssigkeit im nächsten Schritt schwierig. </li><li> Legen Sie die Mischung in die Sucralfat Zentrifugalverdampfer auf niedrig eingestellt, bis die Mischung vollständig trocken ist, normalerweise 30-50 min je nach dem Volumen der Flüssigkeit verwendet. <ol><li> Überprüfen Sie die Mischung für Restfeuchte mit der konischen Ende eines sterilen Spatel. Die Mischung sollte &quot;knackig&quot; zu fühlen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie das verjüngte Ende des Spachtel, um in der Röhre brechen die Sucralfat Mischung. </li><li> Werden 10 ul der zu Hydron Sucralfat. <ol><li> Aufgrund der Natur der viskosen hydron, schneiden Sie das Ende von einem 200 ul Pipettenspitze und zeichnen Sie dann und lassen Sie die 10 ul vor dem Pipettieren wieder und Ergänzung Sucralfat. </li></ol></li><li> Verwenden schnell gebogen spuckteula, die hydron und Sucralfat mischen und aus dem Rohr zu entfernen. <ol><li> Sammeln Sie die Mischung entlang der Unterseite der Spitze des gebogenen Spatel und dann durch Drehen des Rohres beim Zeichnen der Spatel entlang der Wand des Rohres. Die Mischung wird rasch trocknen, so muss dieser Schritt effizient durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Verbreiten Sie die Mischung auf die vorbereitete Mesh mit einer Pinzette, um sie in Position zu halten. Die Mischung sollte eine gleichmäßige Schicht zu füllen und in die Löcher des Netzes. </li><li> Tauchen Sie den gebogenen Spatel in das Röhrchen mit hydron und verwenden Sie es Mantel beide Seiten des Netzes. </li><li> Das beschichtete Gitter stützte sich auf Seite gegen Rand der Schale und trocknen bei RT für 30-45 min. </li><li> Legen Sie das Netz in -20 ° C Gefrierschrank oder gehen Sie sofort zum nächsten Schritt. Halten Sie Netz-Innenschale. </li><li> Legen Sie die 35-mm-Schale im Inneren der größeren Petrischale, Deckel ab. Verwenden Sie die Zange, um die Fasern des Netzes auseinander über die 35-mm-Schale vorsichtig abziehen. Streu Pellets cein von der größeren Schüssel am Ende gesammelt werden. <ol><li> Überprüfen Pellets für Einheitlichkeit unter Rahmen. Das Verfahren ergibt ca. 250 Pellets somit die Standarddosis pro Pellet für bFGF und VEGF 80 ng und 200 ng auf. </li></ol></li><li> Speicher Pellets in 35 mm-Schale in 20 ° C-Gefrierschrank für 3 Monate. </li></ol> 2. Chirurgische Implantation von Pellets <ol><li> Einrichtung eines OP-Bereich unter Operationsmikroskop. </li><li> Betäuben die Maus mit Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal) und positionieren Sie die Maus unter dem Mikroskop, so Auge sichtbar ist. Führen toe Prise ausreichende Anästhesie zu gewährleisten. </li><li> Betäuben die Maus Auge, indem 1 Tropfen Proparacain Lösung oben auf Augapfels. Warten Sie 20-30 Sekunden und tupfen mit einem Gaze-Pad. </li><li> Proptose die Maus mit dem Auge abgestumpft # 1 Juweliere Zange sicher zu sein, um die Haut zwischen Pinzette und Augen verlassen. Es ist wichtig, den Druck korrekt angewendet beurteilen.60; Halten Sie die Augen zu fest wird dazu führen, dass rot und gereizt zu werden, während eine zu locker halten können, um während der Operation Auge zu bewegen. </li><li> Verwenden Sie die 30 ° microknife um einen Einschnitt in die Hornhaut zu etwa 1 mm vom Limbus. Der Schnitt sollte 1-2 mm lang sein. Einschnitt sollte tief genug sein, um über die Epithelschicht in midstroma eindringen, aber nicht so tief, um das Auge, bersten. </li><li> Verwenden Sie die von Graef Messer, um eine Tasche senkrecht zur Schnittführung machen. <ol><li> Schieben Sie das Messer unter der Hornhautschicht an der Einschnittstelle und sanft arbeiten Messer in und es entlang der Schnitt, um den Raum zu vergrößern, wodurch die Tasche entsteht. Es hilft, um die Maus zu bewegen und in der Lage sein, um mit der Krümmung des Auges zu arbeiten. Achten Sie darauf, mit der Spitze nach unten zu drücken, um zu vermeiden, Aufbrechen des Auges. </li></ol></li><li> Befeuchten Sie die Zange # 5 Juwelier mit Proparacain und wählen Sie ein Pellet aus Schale. Legen Sie ein Pellet auf dem Auge. </li&gt; <li> Befeuchten Sie die von Graef Messer mit Proparacain und übertragen einige der Flüssigkeit auf Pellet es gummiartig und biegsam zu machen. Überschüssige Feuchtigkeit mit Gaze oder einem Wattestäbchen. </li><li> Legen Sie die Tablette in die Tasche mit dem von Graef Messer, um es im Inneren der Hornhaut unter Schicht schieben. Sobald die gesamte Pellet drinnen ist, führen Sie die flache Seite von Graef Messer über Website, um zu überprüfen, dass das Pellet sicher ist. </li><li> Mantel das Auge mit Dreifach-antibiotische Salbe. </li><li> Drehen Sie die Maus um und wiederholen Chirurgie in der entgegengesetzten Auge. </li></ol> 3. Quantifizierung der Hornhaut-Neovaskularisation. Tiere verlassen auf Schiffe über einen festgelegten Zeitraum zu entwickeln. Der Tag des Schiffes Einstufung hängt von Wachstumsfaktor verwendet. Grade bFGF an Tag 5 und dem schwächeren VEGF am Tag 6 Der Tag der Implantation ist Tag 0. <ol><li> Betäuben die Maus mit Avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneal). </li><li> Verwenden Sie das Spaltlampenmikroskop für grading. Ein Augen hat ein Fadenkreuz, Linien innerhalb des Okulars als Messhilfe verwendet werden, um Gefäßlänge und der Abstand um den Umfang des Auges, die die Gefäße gekeimt quantifizieren. <ol><li> Halten Sie die Maus vor der Umfang, die Positionierung der Maus so Auge in Auge mit Pellet direkt vor gesehen. Stabilisieren Sie den Kopf zwischen Daumen und Zeigefinger so Haut auf Gesicht gestrafft und Auge leicht proptosed. </li></ol></li><li> Platzieren der y-Achse des Fadenkreuzes auf dem Limbus Behälter direkt unterhalb Pellets. Messen Sie die Länge der Schiffe Verzweigung nach oben in Richtung Pellets. Notieren Sie sich diese Messung in Zehntel Millimetern und bezeichnen Gefäßlänge (VL) (Abbildung 1A). </li><li> Schalten Sie entweder die Maus oder die Zielmarke, so dass der Abstand rund um das Auge, dass diese Schiffe haben gekeimt klar wird. Am einfachsten ist es des Auges als Zifferblatt mit Abständen von 1 bis 12 designierten denke diese Zahl vollen Stunde (CH) (Abbildung 1B). Es kann eine ganze Zahl oder Bruchteile von 0,25 (Beispiel 2, 2,25, 2,5 oder 2,75) sein. Hinweis: CH ist subjektiv. Zum Beispiel können einige den Abstand um das Auge zu messen, um alle Schiffe aus dem Limbus gekeimt, während andere möglicherweise nicht messen an dem Punkt, wo Schiffslänge ist die Hälfte der maximalen gehören. Wichtig ist, stimmt mit der man beschließt, Klasse zu sein. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Quantifizierung der Hornhautgefäßneubildung. (A) 80 ng bFGF-Pellet in C57BL / 6J Maus zeigt Spaltlampe Fadenkreuz ausgerichtet, um Schiffslänge messen implantiert. VL = 0,9 mm. (B) Gleiche Auge zeigt Spaltlampe Fadenkreuz gedreht, um vollen Stunde messen. CH = 3.25. Berechnet Gefäßfläche = 1,84 mm 2. Diese Bilder wurden digital erhöht, um für die Zugabe von Fadenkreuz schematische ermöglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <ol start="5"><li> Berechnen Sie die Gefäßfläche (VA) mit Hilfe der folgenden Formel, die auf dem Gebiet eines ovalen basiert (Anmerkung, ist es hilfreich, dies bei der Einstufung zu halten.) In Millimetern im Quadrat Express VA. Die Formel ist wie folgt: Schiffslänge x 0,2 x Uhrzeit-π = Fahrzeug-Bereich </li></ol>

<ol><li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells%3A+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li>
<li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li>
<li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-promoting+phorbol+esters+induce+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro.</a> Cell. 42, 469-477 (1985).</li>
<li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).</li>
<li>Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histotypic+angiogenesis+in+vitro%3A+light+microscopic%2C+ultrastructural%2C+and+radioautographic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies.</a> In Vitro. 18, 538-549 (1982).</li>
<li>Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).</li>
<li>Sandison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+microscopic+study+of+living+growing+tissues+by+the+introduction+of+a+transparent+chamber+in+the+rabbit%27s+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear.</a> Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).</li>
<li>Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+angiogenesis+assays%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative angiogenesis assays: progress and problems.</a> Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).</li>
<li>Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+in+vivo+by+prevention+of+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization.</a> J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).</li>
<li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+growth+and+neovascularization%3A+an+experimental+model+using+the+rabbit+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea.</a> J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).</li>
<li>Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+heterogeneity+of+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice.</a> FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).</li>
<li>Chang, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li>
<li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li>
<li>Turner, P. V., Albassam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+rats+to+corneal+lesions+after+injectable+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Comp%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia.</a> Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).</li>
<li>Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reversible+cataract+induced+by+xylazine+and+by+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice.</a> Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere wichtige Schritte bei der Durchführung einer erfolgreichen Hornhauttest. Die erste ist es, einheitliche Pellets geeignet ist, eingepflanzt und anregende Gefäße. Die wichtigsten Teile des Pelletzubereitung sind: 1) unter Verwendung von trägerfreien Wachstumsfaktor; 2) die Sicherstellung einer guten Mischung aus Wachstumsfaktor mit dem Sucralfat und hydron und 3), die sich die endgültige Mischung zügig, aber sorgfältig von der Eppendorf-Röhrchen auf das Netz, wo die Pellets gegossen werden. Es wird empfohl...

Der Prozess der Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße zu bilden, auffindbar sind, ist sehr komplex und wird durch verschiedene endogene Faktoren, die verschiedene Schritte des Schiffes Keimen und Morphogenese Steuerung geregelt. Angiogenese aufgrund einer Verschiebung im Gleichgewicht zwischen pro-und anti-angiogene Faktoren, die das Gleichgewicht hält normalerweise das Gefßsystem in einem Ruhezustand ausgelöst. Angiogenese beim Erwachsenen kommt in bestimmten physiologischen Bedingungen wie bei der weiblichen ovariellen Zyklus oder Reparaturprozessen wie der Wundheilung und Geweberegeneration. Es ist jedoch auch ein Markenzeichen von mehreren Krankheiten, einschließlich Malignitäten, Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen. Die Beteiligung von Angiogenese in diesen physiologischen und pathologischen Bedingungen ist es ein wichtiges Thema für Forschung und ein attraktives Ziel für die Therapie. Aufgrund der Komplexität der Angiogenese und der Beteiligung mehrerer ceLLS und Faktoren in dem Verfahren, einschließlich Endothelzellen, Perizyten, zirkulierenden Zellen und Stromazellen in vitro-Modellen beschränkt bleiben und die einzigartige Mikroumgebung in vivo nicht zu wiederholen. Der Haupt in-vitro-Assays der Angiogenese sind weitgehend auf die Beobachtung direkte Auswirkungen auf Endothelzellen und Messen bestimmter Schritte in angiogenen Prozess unter kontrollierten Bedingungen konzentriert. Diese Assays umfassen die Quantifizierung der Endothelzellproliferation 1, Migration 2, Netzwerkbildung 3, 4 und Schlauchbildung Keime aus Sphäroiden. 5 Ex-vivo-Modellen, im Gegensatz zu den in vitro diejenigen, sind komplexer und enthalten mehrere Gewebezelltypen, wobei ein Beispiel die Aorten-Ring-Test 6. Dennoch, wie andere Systeme, kann es nicht den Beitrag von zirkulierenden Zellen und natürliche Stroma von Endothelzellen zu erfassen, wie in vivo existiert. VersucheAngiogenese unter Strömungs untersuchen, um die in vivo-Situation unter Verwendung mikrofluidischer Systeme 7 durchgeführt wird, aber auch diese Assays nachahmen, obwohl viel verbessert, sind noch nicht für alle in vivo vorhandenen Kammern entfallen. Aufgrund der Einschränkungen der in vitro und ex vivo-Angiogenesemodellen in vivo Modellen bleibt das zuverlässigere Auswahl für Angiogenese-Studien. Beispiele für diese Modelle sind die Implantation von transparenten Kammern, &quot;Fenster&quot;, die die Visualisierung von wachsenden Blutgefäße unter dem Mikroskop 8 zu ermöglichen, injizierbare subkutane Implantate wie Matrigel und Gefäßbildung in normalen Geweben wie Mausohr und dem Huhn Chorioallantoismembran (CAM ). Allerdings ist eine der akzeptablen und quantitative in vivo Angiogenese-Modellen die hier beschriebene Hornhautmikrotaschen-Assay Neovaskularisierung, welche das natürlich avaskulären nutztHornhaut als &quot;Bildschirm&quot; zu visualisieren und zu beurteilen, neue angiogene Wachstums 9. Hier beschreiben wir die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt. Zunächst wurde das Modell verwendet werden, um unspezifische Reize angiogenen in Kaninchen-Hornhaut messen. Dies wurde durch die Einführung von Tumorstücke in das Kammerwasser von der Vorderkammer des Auges des Kaninchens durchgeführt und gemessen Tumor-induzierte Neovaskularisierung 11. Allerdings wurde der Test später entwickelt, um Effekte von spezifischen Wachstumsfaktoren zu untersuchen 10, besser zu spezifizieren und zu standardisieren, die angiogene Wirkung. Um den Wachstumsfaktor in das Auge zu lösen, wurden Pellets mit langsamer Freisetzung, die bekannte Mengen von angiogenen Wachstumsfaktoren anstelle von Geweben verwendet. Die Verfügbarkeit von gereinigten rekombinanten Proteine ​​angiogenen wie bFGF oder VEGF aktiviert ihre Verwendung als spezifische Ziele der Angiogenese modulaters 12. Zunächst wurde der Assayweitgehend in Kaninchen, die einfacher, mit aufgrund ihrer Größe, aber später wurde das Modell in Mäuse setzten Werk verwendet werden; ein kleiner und kostengünstiger Tiermodell. Der Wechsel von Kaninchen, Mäuse vorgesehen einen wichtigen Vorteil in der Lage zu genetisch manipulierten Tieren zu verwenden, wodurch eine neue Ära der Erforschung der genetischen Komponenten beeinflussen die Angiogenese 13 entsteht. Neben der Nutzung von akzeptabler Hornhaut-Test bei der Untersuchung der Angiogenese, andere biologische Prozesse können ebenfalls unter Verwendung von modifizierten Assays untersucht. So wurden beispielsweise Studien von Lymphangiogenese möglich durch die Implantation von niedrig dosiertem bFGF-Pellets, die die Visualisierung von Lymphgefäßen durch spezifische molekulare Marker 14 erlaubt werden. Darüber hinaus hat dieser Test ein Mittel, um die Wirkung der Strahlung auf die Angiogenese zu bewerten 15 vorgesehen. In Summe ist die Hornhaut-Mikro Angiogenese-Assay eine quantitative, reproducible, flexible Beurteilung der Angiogenese in vivo. Ein großer Vorteil dieses Tests besteht darin, dass die Messung der Hintergrundgefäße unnötig, weil die Behälter wachsen auf einem natürlich avaskulären Gewebe. Wir beschreiben hier das Protokoll dieses Tests in Details und verschiedenen Szenarien, die auftreten können, zu diskutieren. Der Test besteht aus 3 diskrete Segmente. Hier werden wir die Herstellung von Wachstumsfaktor-inclusive-Pellets, die spätere chirurgische Implantation und schließlich die Methode verwendet, um die daraus resultierenden neovaskulären Wachstum zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>Abschnitt 1: Pelletvorbereitung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucralfat</td><td>Sigma</td><td>#S0652</td><td></td></tr><tr><td>Hydron (auch bekannt als Poly(2-Hema))</td><td>Sigma</td><td>#P3932-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco Products Inc</td><td>#111000200CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktoren:</td><td></td><td></td><td>Muss trägerfrei sein (kein Rinderserumalbumin (BSA))</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)</td><td>PeproTech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF)</td><td>R D Systems</td><td>#293-VE-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Schale</td><td>Becton-Dickson</td><td>#353001</td><td>Zur Lagerung von Pellets</td></tr><tr><td>10 cm Petrischale</td><td>VWR</td><td>#25384-342</td><td>Wird als Arbeitsfläche für die Vorbereitung von Pellets verwendet</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Sefar America</td><td>#03--300/51</td><td>300 um Nitex Nylon, in cm quadratische Stücke geschnitten und im Autoklaven</td></tr><tr><td>sterilisiert Spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>#21-401-10</td><td>Verwenden Sie das konische Ende von einem, um die Pelletmischung aufzubrechen. Biegen Sie das konische Ende des anderen, um die Mischung aus dem Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-408-146</td><td>Eines für Hydron, eines für Sucralfat</td></tr><tr><td>Jewelers Pinzette, #5</td><td>Ambler Surgical</td><td>#2315E</td><td>Benötigen 2 zum Auseinanderziehen des Netzes</td></tr><tr><td>Zentrifugalverdampfer</td><td>ThermoSavant</td><td>DNA110 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abschnitt 2: Chirurgische Implantation von Pellets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operationsmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5% Avertin</td><td></td><td></td><td>Allgemeinanästhetikum</td></tr><tr><td>Proparacainhydrochlorid ophthalmische Lösung 0,5%</td><td>Falcon</td><td>NDC# 6131401601</td><td>Augenanästhetikum</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ophthalmic Salbe</td><td>Bausch Lomb</td><td>NDC# 2420878055</td><td>Enthält Neomycin, Polymixin und Bacitracin</td></tr><tr><td>Ophthalmic Mikromesser, 5 mm</td><td>Surgistar</td><td>#924501</td><td>30 Grad Winkel</td></tr><tr><td>von Graef Messer</td><td>Ambler Surgical</td><td>#3401E</td><td></td></tr><tr><td>Juwelier Pinzette, #1</td><td>Ambler Surgical</td><td>#2301E</td><td>Muss mit Schleifstein zum Stützen des Auges abgestumpft werden</td></tr><tr><td>Juwelier Pinzette, #5</td><td>Ambler Surgical</td><td>#2305E</td><td>Zum Aufnehmen von Pellets und Aufsetzen auf das Auge</td></tr><tr><td>Kleine gebogene Schere</td><td>Ambler Surgical</td><td>#5636E</td><td>Zum Trimmen von Schnurrhaaren</td></tr><tr><td>Gaze</td><td></td><td></td><td>Zum Abtupfen des Auges nach Proparacain</td></tr><tr><td>Abschnitt 3: Einstufung der Hornhautneovaskularisation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5% Avertin</td><td></td><td></td><td>Allgemeinanästhetikum</td></tr><tr><td>Spaltlampe</td><td>Nikon</td><td>FS-2</td><td>Benötigt ein Okular mit einem Fadenkreuz, um die Messung zu erleichtern</td></tr></tbody></table>

die hornhaut-mikrotest: ein modell der angiogenese bei der maus augen

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Das Maushornhaut-Mikrotaschen-Assay ist ein robustes und quantitative in vivo-Test zur Bewertung der Angiogenese. Durch die Verwendung von standardisierten Slow-Release-Pellets, die bestimmte Wachstumsfaktoren, die Blutgefäßwachstum in der gesamten Hornhaut natürlich avaskuläre auslösen können Angiogenese gemessen und quantifiziert werden. In diesem Assay wird im Laufe von mehreren Tagen die angiogene Antwort erzeugt, abhängig von der Art und Dosis des Wachstumsfaktor verwendet wird. Die Induktion einer Neovaskularisation wird üblicherweise entweder durch basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ausgelöst. Durch die Kombination dieser Wachstumsfaktoren mit Sucralfat und Hydron (Poly-HEMA (Poly (2-hydroxyethylmethacrylat))) und Gießen der Mischung zu Pellets, können sie operativ in der Maus Auge implantiert werden. Diese einheitlichen Pellets langsam lösen Sie die Wachstumsfaktoren über fünf oder sechs Tage (bFGF oder VEGF beziehungsweise) ermöglicht ausreichend angiogene Antwort für Gefäßfläche q erforderlichuantification mit der Spaltlampe. Dieser Test kann für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Bewertung von angiogenen Modulators Medikamente oder Behandlungen sowie Vergleich zwischen unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu beeinflussen Angiogenese verwendet werden. Ein erfahrener Ermittler nach dem Üben dieses Assays können ein Pellet in weniger als 5 min pro Auge zu implantieren.

Typische Ergebnisse für bFGF und VEGF-Pellets in den normalen niedrigen angiogenen C57BL / 6J Mäuse werden in 2A und B gezeigt. 2E zeigt die normale Verteilung der Gefäßfläche (VA) in der C57BL / 6J Belastung mit variierenden Dosen von diesen Wachstums Faktoren. 80 ng bFGF Pellets normalerweise in einer VA von etwa 2,0 mm 2 führen, wenn Werte in einem Bereich von 1,8 bis 2,4 mm 2 sind akzeptabel. 200 ng VEGF-Pellets führen typischerweise eine Reakt...

Das Protokoll beschreibt die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt.

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Wachstum von Blutgefäßen in der Mauscornea zu stimulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Pellets mit Wachstumsfaktor hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die chirurgische Implantation eines Pellets in die Cornea durchzuführen.Die Mäuse werden anschließend fünf bis sechs Tage lang belassen, abhängig vom Wachstumsfaktor, um die Gefäßentwicklung zu ermöglichen. Der letzte Schritt besteht in der Quantifizierung der Gefäßfläche, wobei ein Spaltlampenmikroskop verwendet wird, um die durchschnittliche Gefäßlänge sowie die Strecke entlang des Augenumfangs zu messen, die die Gefäße besiedelt haben. Letztendlich dient der Hornhaut-Mikrotaschen-Assay als reproduzierbare und zuverlässige Methode zur Untersuchung der Angiogenese in vivo.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der technisch anspruchsvollen Natur des Verfahrens Schwierigkeiten haben. Die Forscher sollten umfangreiche Übungen vor den experimentellen Versuchen einplanen, um Konsistenz sowohl bei den chirurgischen Techniken als auch bei der Bewertung zu gewährleisten. Beginnen Sie die Pellet-Herstellung, indem Sie 10 Mi

the-corneal-micropocket-assay-a-model-of-angiogenesis-in-the-mouse-eye

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Hornhaut ist einzigartig, es fehlt Gefäßgewebe. Allerdings kann robuste Wachstum der Blutgefäße und das Überleben in der Hornhaut durch potente angiogenen Faktoren ausgelöst werden. Daher kann die Hornhaut mit uns ein wertvolles Instrument für die angiogenen Studien. Dieses Protokoll zeigt, wie die Maus-Modell der Hornhaut Tasche Test und wie die Angiogenese durch angiogene Faktoren mit diesem Modell induziert Beurteilung durchzuführen.

Ein Maus-Modell der Cornea Pocket-Assay für die Angiogenese-Studie

Normalen Erwachsenen vaskularisierten Säugetiergewebe, dass physiologische Angiogenese fehlt und die nicht zur chirurgischen Intervention wird verwendet, um Studie ausgesetzt worden: (i) die Initiierung und Entwicklung der Angiogenese nach intraperitonealer Verabreichung von Test-Agenten, und (ii) die Veränderung der Angiogenese nach systemischer Gabe von ausgewählten Test-Agenten.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines ex vivo-Modells der Aderhautkeimung zur Untersuchung der okulären mikrovaskulären Angiogenese. Der Assay umfasst die Kultivierung von Mausaugen-Explantaten, die das Aderhautgewebe enthalten, das an der Sklera und dem retinalen Pigmentepithel befestigt ist, unter bestimmten Bedingungen, die das keimende choroidale mikrovaskuläre Keimen fördern.

Aderhaut-Keimungs-Assay zur Ex-vivo-Untersuchung der okulären mikrovaskulären Proliferation

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Neovaskularisation (NV) der Hornhaut können mehrere optische Pathologien erschweren. Mit Hilfe eines kontrollierten, alkali Verbrennungen Modell kann ein quantifizierbarer Höhe der Hornhaut NV für mechanistische Studie der Hornhaut NV und Bewertung von möglichen Therapien für neovaskulären Erkrankungen hergestellt werden.

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Hier präsentieren wir das Maus-Laser-induzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) Protokoll, ein experimentelles Modell, das die vaskulären Kennzeichen der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nachbildet. Einmal gemeistert, kann es zuverlässig und effektiv CNV als Modellsystem induzieren, um verschiedene experimentelle Maßnahmen zu testen.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

Hier präsentieren wir Ihnen die Nützlichkeit der längs in-Vivo Bildgebung bei der Nachbereitung der morphologischen Veränderungen der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation bei Mäusen.

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.

Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Dieses Protokoll stellt einen Aderhautkeim-Assay dar, ein Ex-vivo-Modell der mikrovaskulären Proliferation. Dieser Test kann verwendet werden, um Wege zu bewerten, die an sich vermehrenden aderatorischen Mikrogefäßen beteiligt sind, und medikamentöse Behandlungen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe zu bewerten.

Ein Ex Vivo Choroid Sprouting Assay der ocular Microvascular Angiogenese

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die durch Alkaliverbrennungen induzierte Hornhautneovaskularisation bei Mäusen. Die Methode generiert ein reproduzierbares und kontrollierbares Hornhauterkrankungsmodell, um die pathologische Angiogenese und die damit verbundenen molekularen Mechanismen zu untersuchen und neue pharmakologische Wirkstoffe zur Verhinderung der Hornhautneovaskularisation zu testen.

Ein Mausmodell für Hornhautneovaskularisation durch Alkaliverbrennung

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

Untersuchung der Angiogenese auf funktioneller und molekularer Ebene durch Nutzung des Scratch Wound Migration Assay und des Spheroid Sprouting Assay

Lernen Sie den Hornhaut-Mikrotest zur Untersuchung der Angiogenese bei der Maus. Diese Methode ermöglicht die quantifizierte Analyse von Gefäßwachstum in vivo und unterstützt die Entwicklung neuer Therapien.

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

Weitere Videos entdecken