Name: Terapia Celular para insuficiência cardíaca em Rat: Double toracotomia para infarto do miocárdio e Epicárdica implante de células e Biomatrix (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a realizar toracotomia dupla minimamente invasiva em ratos para ligadura coronária e aplicação epicárdica de células e biomatriz. Este método reduz riscos cirúrgicos e melhora a fixação de biomateriais no reparo cardíaco.

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Os autores agradecem ao Prof Hendrik Tevaearai e do Departamento de Cirurgia Cardiovascular de apoio financeiro para a parte inicial do estudo.

NOTA: Lewis ratos machos e fêmeas, de 200-220 g foram alojados em condições padrão de laboratório (12 horas de luz e de ciclo de escuro, de água ad libitum e alimentares, IVC gaiola). Todos os animais foram tratados de acordo com as recomendações do FELASA ea Lei Suíça sobre a protecção animal. 1. celular Preparação: Isolamento de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea <ol><li> Anestesiar os ratos com isoflurano a 5% de O 2 e 5 L / min, numa câmara de indução por 5 min. Coloque focinho do animal, para um cone de nariz ligada ao sistema de anestesia. Realize um dedo do pé ou cauda pitada de confirmar sedação. </li><li> Retirar a pele da perna com uma tesoura de corte da pele do tornozelo para o quadril. Retirar os músculos e corte da artéria femoral para a exsanguinação animal. Expor a articulação do quadril e deslocar a cabeça do fêmur. É importante para não danificar a cabeça do fêmur. Colocar os ossos em PBS estéril num tubo de plástico de 50 ml. </li><li> Remova todas as muscles e ligamentos dos ossos sem quebrá-los. NOTA: É importante que o osso permanece intacto para evitar ligação de solução de lavagem ou de contaminação com etanol. Lave os ossos pelados em etanol 70% por 5 min. </li><li> Sob a estéril câmara de fluxo laminar, cortar ambas as pontas dos ossos com uma tesoura. Lave a medula óssea através da injeção de PBS estéril a partir da extremidade do osso. Recolha de medula para um tubo de 15 ml. Centrífuga 7 min a 300 x g. </li><li> Remover o sobrenadante. Suspender o sedimento em 3 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão durante 1 min à temperatura ambiente antes de girar de novo durante 7 minutos a 300 x g. Em um frasco de cultura de 150 ml, estéril adicionar meio de cultura celular (395 ml de meio IMDM, 5 ml de pen / strep, 100 ml de FBS) e propagar as células. </li><li> Alterar o segundo meio dia para remover células não aderentes. <ol><li> Realizar as mudanças de meio a cada segundo dia, durante 2-3 semanas, até que a quantidade de célula desejado é obtido. </li><li> Em alternativa, preparar o biograft por sementesção das células para a matriz sólida, como descrito noutro local necessário e 3. </li></ol></li><li> O dia da implantação cardíaca, preparar as células ou colher o biograft imediatamente antes da aplicação do epicárdio. <ol><li> Coletar as células usando solução desprendimento de células Accutase. Contar as células. Encher um tubo de centrífuga de 1,5 ml, com o volume de suspensão de células para obter uma quantidade calculada de célula desejado. Centrifuga-se durante 7 minutos a 300 xg e remover o sobrenadante. </li><li> Alternativamente, a colheita biograft de meio de cultura celular, enxaguar em PBS estéril, e manter em meio de cultura fresco sem soro. </li></ol></li></ol> 2. Primeiro toracotomia e LAD Ligadura <ol><li> Pesa-se o rato. Ligue o bloco de aquecimento a 37 ° C. Anestesiar ratos com 5% de isoflurano e 5 L / min de 100% de O 2 em uma câmara de indução para 5-7 min. Realize um dedo do pé ou cauda pitada de confirmar sedação. Coloque o rato sobre a almofada de aquecimento. </li><li> Entubar o animal com um 14L iv cateter. Conectar o cateter intubação a um ventilador roedor programado para 2,5 L / min de oxigênio, 2,5% de isoflurano, o volume corrente de 2 ml, e uma freqüência respiratória de 90 ciclos / min. </li><li> Prepara-se uma solução de buprenorfina a 0,1 mg / kg. Injectar subcutaneamente um terço da solução. Raspar a parte esquerda do tórax. Desinfectar com uma solução de Betadine 1%. </li><li> Incisar a pele perpendicular ao esterno no quarto espaço intercostal. Separe as três camadas de músculo torácico (peitoral maior, peitoral ascendente e peitoral oblíquo externo). Abra o quarto espaço intercostal (entre as costelas 4 e 5). </li><li> Use um pequeno afastador para espalhar as costelas e para expor o coração. Abra o pericárdio com cuidado. Localize e ligadura da artéria descendente anterior coronariana (LAD), com 7,0 sutura 4 milímetros abaixo do átrio. </li><li> Feche o espaço intercostal, com dois pontos com 3,0 suturas. Posicione as duas suturas proximal e distal do esterno. Em primeiro lugar, tighten sutura distal. Prenda o tubo de escape ventilador para 2 segundos, a fim de inflar o peito e evitar pneumotórax. Aperte a segunda sutura. Posicione as camadas de músculos de volta no lugar (sem suturas são necessários). Fechar a pele com uma sutura 5.0. </li><li> Desinfetar a sutura com solução Betadine 1%. Injectar o resto da solução de buprenorfina. Desligue o sistema de anestesia. Remover cateter intubação. </li><li> Mantenha o rato na gaiola sob uma lâmpada quente por 1-2 horas. Manter um termómetro na gaiola e controlar a distância entre a lâmpada e o compartimento quente, a fim de evitar um excesso de aquecimento. Retorne o rato na unidade IVC. Injetar por via subcutânea Buprenorfina 0,05-0,1 mg / kg pós -operatively cada 6-12 horas para 48 horas. </li></ol> 3. Epicárdica Administração da Via Tratamento Segunda toracotomia <ol><li> Repita os passos de 2,1-2,3. </li><li> Incisar a pele perpendicular ao esterno no quinto espaço intercostal. Separar a fase 3s do músculo torácico (peitoral maior, peitoral ascendente e peitoral oblíquo externo). Abra o quinto espaço intercostal (entre as costelas 5 e 6). </li><li> Use um pequeno afastador para espalhar as costelas e para expor o coração. Se há alguma adesão, retire-os cuidadosamente com uma pinça fina. </li><li> Localize a área do infarto que aparece como uma área clara abaixo da ligadura. NOTA: Se necessário, use um pedaço de 10 cm de sutura (7,0) inserido no ápice para melhor visualizar o ventrículo esquerdo. Puxe delicadamente à sutura mantida frouxamente por uma braçadeira para expor o coração. </li><li> Aplique um dos seguintes tratamentos: <ol><li> Posicionar o biograft na superfície do coração. Utilizar a seringa pré-cheia de selante de fibrina previamente aquecida à temperatura ambiente durante 10 min. Aplique uma gota (50-100 L) de selante de fibrina sob a biograft usando uma agulha 25 G Luer. Verifique se o biograft está perfeitamente selado. </li><li> Alternativamente, aplicam-se o sedimento de células recolhidas com uma pipeta de ponta na superfície of o coração na área abaixo da ligadura pálido. Aplicar uma gota (50-100 ul) de selante de fibrina sobre o sedimento celular. </li></ol></li><li> Remover o pedaço de fio de sutura a partir do vértice. </li><li> Repita os passos de 2,6-2,8. </li></ol>

<ol><li>Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling+at+the+population+level--risk+factors%2C+screening%2C+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes.</a> Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).</li>
<li>Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+functional+heart+tissue+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regenerating functional heart tissue for myocardial repair.</a> Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).</li>
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<li>Siepe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast-seeded+biodegradable+scaffolds+to+prevent+post-myocardial+infarction+evolution+toward+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiov.+Sur%22%5BJournal%5D)">Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure.</a> J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).</li>
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<li>Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+marrow-derived+cardiac+stem+cells+carried+in+fibrin+improves+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).</li>
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<li>Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging+for+Assessment+of+Immune+Responses+Following+Implantation+of+Engineered+Heart+Tissue+%28EHT%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT).</a> J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A ligadura permanente da LAD causa lesão miocárdica irreversível. O primeiro modelo animal foi descrito em 1960 4. Desde então, tem sido considerado como um modelo padrão e adequado para MI crónica. Sua estabilidade e reprodutibilidade permitiu a avaliação experimental de terapias para MI 5. Procedimentos melhorou após a descrição inicial relatou uma taxa de mortalidade operatória de 35-13% 6. Como esperado, a ligadura LAD induzida função cardíaca comprometid...

Desde o final do século 19, a doença cardiovascular continua a ser o número um assassino em série nos países industrializados. Entre eles, a doença arterial coronária representa a etiologia principal. Os resultados de fase aguda no infarto do miocárdio (MI) e é seguido por remodelação mal-adaptativo que se desenvolve progressivamente em direção a uma fase crônica e insuficiência cardíaca grave. Apesar dos recentes avanços tecnológicos e terapêuticos significativos, a morbidade ea mortalidade devido à progressão da insuficiência cardíaca ainda está crescendo 1. Neste contexto, a terapia celular tem ganhado cada vez mais interesse como uma nova opção terapêutica para parar a progressão da doença para a insuficiência cardíaca e para estimular a capacidade regenerativa recentemente identificado do miocárdio. Estudos experimentais e clínicos têm fornecido muitas evidências dos efeitos benéficos obtidos após o transplante cardíaco de vários tipos de células. Entre os principais resultados incluíram melhoria cardifunção contrátil ac, diminuição do remodelamento ventricular esquerdo, redução do tamanho do infarto, e aumento da densidade vascular na área infartada. No entanto, a baixa retenção número de células após a injeção de células manteve-se uma desvantagem importante. Associação de células com um biomatriz para melhorar de entrega célula 2, recentemente promovido pesquisador e interesses clínicos. Ligadura da artéria descendente anterior da artéria coronária (LAD) é um método de referência para MI em modelo animal de pequeno porte que resulta em infarto transmural e uma cicatriz madura. A terapia celular aplicada na fase crônica da MI requer uma segunda intervenção cirúrgica. A esternotomia mediana geralmente é realizada para permitir a injeção intramiocárdica das células ou a implantação do epicárdio de bioenxertos. Tais procedimentos cirúrgicos invasivos, aumentar a taxa de mortalidade, pós-cirurgia de tempo de recuperação, a dor, e o risco de infecção. A abordagem minimamente invasiva aqui apresentada não só evita esse viés, mas também fornece oacessibilidade ptimal do coração para a aplicação dos tratamentos. MI e implantação do epicárdio de células associadas com uma biomatriz tipo gel são realizadas com o coração batendo através de toracotomia intercostal esquerdo.

<table><tbody><tr><td>Sutura Polysorb 3-0</td><td>Covidien</td><td>UL 204</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Polysorb 5-0</td><td>Covidien</td><td>UL 202</td><td></td></tr><tr><td>Sutura Surgipro II 7-0</td><td>Covidien</td><td>VP904X</td><td></td></tr><tr><td>Cateter Insyte 14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>Inspira Ventilador Avançado Controlado por Volume</td><td>Aparelho Harvard</td><td>557058</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #7</td><td>FST Alemanha</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Selante de Fibrina</td><td>Baxter</td><td>1501441</td><td>TISSEEL Cola, Congelado -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Castroviejo Eye Specula</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8925</td><td>use como retrator para as costelas</td></tr><tr><td>IMDM GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31980</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAA Clone</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de osso</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td></td></tr><tr><td>Solução de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Gentra Systems</td><td>D-50k1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Solução de desprendimento de células</td><td>Stem Tecnologia</td><td>7920</td><td></td></tr></tbody></table>

terapia celular para insuficiência cardíaca em rat: double toracotomia para infarto do miocárdio e epicárdica implante de células e biomatrix

Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix

Terapia celular cardíaca tem ganhado interesse crescente e implante de biomateriais associados com as células se tornou uma questão importante para otimizar a entrega de células do miocárdio. Roedor modelo de infarto do miocárdio (IM), que consiste de Esquerda artéria descendente anterior (LAD) ligadura tem sido comumente realizada através de uma toracotomia; uma segunda cirurgia de coração aberto através de uma esternotomia tem sido tradicionalmente realizada para a aplicação do epicárdio do tratamento. Desde a descrição do modelo de ligadura LAD, a taxa de mortalidade pós-operatória diminuiu 35-13%, porém a segunda cirurgia manteve-se crítico. A fim de melhorar a recuperação pós-cirurgia e reduzir a dor e infecção, procedimentos cirúrgicos minimamente invasivos são apresentados. Dois toracotomia foram realizadas, a inicial para LAD ligadura e o segundo tratamento a administração de epicárdico. Bioenxertos consistindo de células associadas com matrizes de tipo sólido ou de gel foram aplicados na AR enfartadaea. LAD ligação resultou em perda da função cardíaca, como confirmado por ecocardiografia realizada após 2 e 6 semanas. Goldner tricrômico coloração realizada em secções coração confirmou a formação de cicatriz transmural. Cirurgias primeiro e segundo resultou em menos que 10% de mortalidade pós-operatória.

Todos os animais recuperados dentro de 1 hora após toracotomias. A cicatrização foi rápida. Não se observou qualquer edema ou infecção. A toracotomia esquerda dobro permitido o acesso ideal para o coração (Figura 1). Dor e mortalidade pós-operatória foi baixa. O animal recuperou-se rapidamente a partir da cirurgia e ganho de peso (Figura 2). A percentagem de sobrevivência de Kaplan Meir foi de 96% para o primeiro toracotomia. Quatro ratos mais de 104 morrera...

Implantação de um biograft para tratar infarto do miocárdio induzido por ligadura LAD em um modelo de roedor tem convencionalmente necessárias duas cirurgias de coração aberto. A fim de reduzir a mortalidade e proporcionar as condições óptimas para a fixação de Biomatrizes sólidos gelatinosos e associados a células, procedimentos minimamente invasivos têm sido desenvolvidos.

Terapia Celular para insuficiência cardíaca em Rat: Double toracotomia para infarto do miocárdio e Epicárdica implante de células e Biomatrix

Cardiac cell therapy has gained increasing interest and implantation of biomaterials associated with cells has become a major issue to optimize myocardial ...

O objetivo deste procedimento é realizar uma dupla toracotomia em ratos para executar a ligadura coronariana e a aplicação epicárdica. Isso é realizado primeiramente mediante uma toracotomia no quarto espaço intercostal. Em seguida, a artéria coronária descendente anterior esquerda, ou LAD, é ligada.Em seguida, uma segunda toracotomia é realizada duas semanas depois no espaço intercostal quinto. Finalmente, as células e a matriz são aplicadas à superfície do coração em batimento infartado. Em última análise, a ecocardiografia é realizada para avaliar a função cardíaca e a histologia é realizada por meio de medidas do tamanho do infarto.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a esternotomia, é que se trata de uma abordagem minimamente invasiva; demonstrar o procedimento será e ine Lopez enviou colaboradores do nosso laboratório. Todos os animais foram tratados em conformidade com as recomendações da F-E-L-A-S-A e da Lei Suíça de proteção animal. Após a exsanguinação de uma rata, isolamento e limpeza dos ossos do fêmur de acordo com o protocolo descrito, utilize uma tesoura para cortar ambas as extremidades dos ossos.Em seguida, para lavar a medula ós

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Este vídeo demonstra como usar um modelo rápido e confiável para o estudo de processos Pathobiological e fisiopatológicas da isquemia miocárdica.

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Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato...

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

Numerosas manipulações genéticas e / ou injeções intramiocárdica de genes, proteínas, células e / ou biomateriais são sobrepostos sobre a dimensão do tempo em estudos de lesão de isquemia / reperfusão aguda e crônica em camundongos remodelação. Este vídeo ilustra os procedimentos de microcirurgia para isquemia / reperfusão, ligadura da artéria coronária permanente, e estudos de injeção intramiocárdica.

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Aqui nós apresentamos um protocolo para a indução de cryoinjury ventricular esquerdo, seguido da implantação de um patch do músculo cardíaco, derivado de células iPS humana cardiomyocytes em um modelo de cobaia.

Implantação de Patches hiPSC-derivado do músculo cardíaco após lesão miocárdica em um modelo de cobaia

Buscamos estabelecer um modelo suíno de insuficiência cardíaca induzido pelo bloqueio da artéria circunflexo esquerda e ritmo rápido para testar o efeito e a segurança da administração intramiocárdia de células-tronco para terapias baseadas em células.

Estabelecendo um modelo suíno de insuficiência cardíaca pós-miocárdio para tratamento de células-tronco

A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

Este artigo detalha um protocolo otimizado para injeções intramiocárdicas guiadas por ecocardiografia em modelos de infarto do miocárdio em ratos usando uma agulha de 29 G x 88 mm. Essa técnica garante a administração robusta, precisa e reprodutível de agentes terapêuticos diretamente na zona peri-infarto.

Injeção guiada por ecocardiografia para entrega de células-tronco intramiocárdicas direcionadas e confiáveis em um modelo de infarto do miocárdio em ratos

Aprenda a realizar toracotomia dupla minimamente invasiva em ratos para ligadura coronária e aplicação epicárdica de células e biomatriz. Este método reduz riscos cirúrgicos e melhora a fixação de biomateriais no reparo cardíaco.

Terapia Celular para insuficiência cardíaca em Rat: Double toracotomia para infarto do miocárdio e Epicárdica implante de células e Biomatrix (Vídeo) | JoVE Journal

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