Name: İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Öğrenin, iPS hücreleri ve bunlardan türetilen retina pigment epiteli ile fetal RPE arasındaki microRNA ifade profillerini mikroarray analiziyle nasıl karşılaştırılır. Bu yöntem, retina hücre gelişimi ve rejeneratif tıp araştırmaları için önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Burada yer alan görüşler ya da iddiaların yazarların özel görünümleri ve resmi gibi ya da Ordu Departmanı ya da Savunma Bakanlığı görüşlerini yansıtan tefsir edilmesi değildir. Yazarlar Whitney A. Greene, Alberto Muniz&#39;in ve Ramesh R. Kaini USAISR bir Ulusal Araştırma Konseyi Doktora Sonrası Araştırma Associateship tutarken Bu araştırma yapıldı. Mikroarray deneyler Greehey Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü Mikrodizi Çekirdek Tesis ve UT Sağlık Bilimleri Merkezi San Antonio Biyoinformatik Bölümü tarafından yapılmıştır. Bu çalışma ABD Ordusu Klinik Rehabilite Tıp Araştırma Programı (CRMRP) ve Askeri Tıp Yöneylem Araştırma Programı (MOMRP) tarafından desteklenmiştir.

Kültür Reaktifler ve Kültür Plakaların 1. Hazırlanması <ol><li> mTeSR1 ortam üreticinin talimatlarına göre mTeSR1 ortamını hazırlayın. Gece boyunca 4 ° C&#39;de 5x mTeSR1 ek 100 ml çözülme MTeSR1 bazal ortam 400 ml mTeSR1 5x ek 100 ml ekleyin ve iyice karıştırın. Bu ortam kadar 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de 6 ay boyunca -20 ° C &#39;de stabildir. </li><li> Farklılaşma media: 10 ug / ml gentamisin 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 2.0 mM L-glutamin,% 10 nakavt serum ve vermek üzere DMEM/F12 ortamı farklılaşma hazırlayın. </li><li> iPS-RPE media: 1x N1 ek, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml triiyodo-L-tironin sodyum tuzu, 20 ng / ml hidrokortizon, 5 ug verecek şekilde MEM içinde iPS-RPE ortamını hazırlayın / ml gentamisin ve% 15 FBS 26. </li><li> Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu stok solüsyonu. Stok çözelti hazırlamak için triiyodo-L-tironin 1.0 mg çözülürhafifçe dönen 1 N sodyum hidroksit içinde, sodyum tuzudur. Sonraki triiyodo-L-tironin sodyum tuzunun 20 ug / ml &#39;lik 50.0 ml yapmak için taban ortamının 49.0 ml. Hacimde hazırlayın ve ihtiyaç kadar -20 ° C&#39;de dondurma. Nihai kültür ortamı içinde arzu edilen bir konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacmi kullanın. </li><li> Hidrokortizon stok çözeltisi: Bir hidrokortizon stok çözelti hazırlamak hafif çalkalama ile mutlak etanol içinde 1 ml hidrokortizon, 1 mg çözünür hale getirmek için. Sonraki 50 ug / ml, 20 ml hidrokortizon stok çözeltisi için taban ortamının 19.0 ml. -20 ° C&#39;de alikot ve dondurularak gerekli olana kadar. Nihai kültür ortamı içinde arzu edilen konsantrasyonu elde etmek için uygun bir hacmi kullanın. </li><li> Fetal RPE büyüme ortamı. FBS haricinde üreticinin talimatlarına göre, bazal ortam maddesi içinde RTEGM kit tüm reaktifleri karıştırarak büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> Fetal RPE kaplama medya. Steril bir kap ve bir büyüme ortamı küçük bir miktar aktararak kaplama ortamı hazırlamak% 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar dd FBS. </li><li> Dispase: DMEM/F12 &#39;de 1 mg / ml&#39; lik dispase çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Matrigel kaplı plakalar: 0.08 mg / ml DMEM/F12 içinde Matrigel hazırlayın. </li><li> Coat her Matrigel çözeltisi 1.0 ml&#39;lik bir 6-yuvalı plakanın. </li><li> 1.0 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin kaplanmış plakalar. </li><li> 1.0 saat inkübe edildikten sonra, fazlalık DMEM/F12 aspire. </li><li> Kurumayı önlemek için mTeSR1 medya 0.5 ml ekleyin. Matrigel kaplanmış plakalar artık kullanıma hazırdır. </li></ol> 2.. IPS Kültür <ol><li> IPS hücre ekimi öncesinde tüm tüpler, oda sıcaklığına kadar sıcak mTESR1 ortam ve hazır Matrigel kaplı plakalar. </li><li> Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde IMR90-4 iPS hücrelerini eritin. Daha sonra su banyosundan çıkarın ve dondurarak saklamaya uygun vialler% 70 etanol kullanılarak sterilize edin. </li><li> Hücre agrega kırılmasını en aza indirmek için, 2 ml bir pipet kullanarak 15 ml konik tüp hücreleri aktarın. </li><li> Bırak-bilge wa 5 ml ekleyinrm yavaşça mTeSR1 hücrelere medya ve karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler supernatant çıkarın. </li><li> Dikkatle mTeSR1 ortam, 2 ml hücre agrega tekrar süspansiyon ve altı çukurlu bir levhanın bir kuyu üzerine hücreleri tohum. </li><li> % 5 CO2,% 95 nem ile 37 ° C inkübatör içine ve kültür plakası yerleştirin. </li><li> Günlük iPS hücre kültür ortamı değiştirin. Farklılaşmamış kolonileri 5-7 gün tohumlama sonra görünecektir. Pasaj (yoğun merkezi ile koloniler) için hazırız farklılaşmamış koloniler kontrol edin. </li></ol> IPS Hücreler 3. Pasajlanması <ol><li> Önceki kanalına başlangıcına iPS hücreleri, bütün tüpler, dispaz çözeltisi ve mTERS1 DMEM/F12 ortamı oda sıcaklığına ısıtıldı gelmiştir ve Matrigel kaplı plakalar, hazır. </li><li> IPS hücreleri pasaj önce, bölgeyi kazıma ve medya aspire tarafından herhangi bir diferansiyasyon alanları kaldırmak. Farklılaşma yüksek için kuyunun% 20&#39;nin altında kalmalıdırkalite kültürleri. Dikkatlice iPS hücresi içeren de 2 ml DMEM/F12 yıkayın ve her bir oyuğa, 1 mg / ml dispase 1 ml ekleyin. </li><li> 7 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Dispaz aspire ve yavaşça iki kez 2 ml DMEM/F12 ile hücre kolonileri yıkayın. </li><li> Durulamadan sonra, her bir kuyucuğa mTSER1 2 ml ekleyin. </li><li> 5 ml&#39;lik bir pipet kullanarak yavaşça agregatlar oluşturması için plakanın koloniler kazıyın. </li><li> 15 ml konik tüp müstakil koloniler aktarın. Hücrelerin bir sonraki geçişini tohum için yeterli mTeSR1 ortam ekleyin. </li></ol> IPS-RPE iPS Hücreler 4. Farklılaşma <ol><li> MTESR1 ortam içinde bir yeni kaplanmış plaka üzerinde iPS hücreleri Plate. </li><li> IPS hücre kolonileri kültüründe 4-5 gün boyunca genişletmek için izin verir. </li><li> 4 ml farklılaşma ortamı ile Yedek mTeSR1 ortam. Her 3 gün medyanın yarısını değiştirin. </li><li> Pigmentli odakları (40-50 gün) el kültürün dışında disseke edilmesi için yeterince büyük büyümek için izin verir. </li><li> Bir kullanın200 ul pipet ucu etrafında kesmek ve pigmentli koloniler kaldırın. </li><li> Toplayın ve 15 ml konik tüp içinde disseke koloniler havuzu. </li><li> Daha sonra iki kere 5 dakika için 300 x g de RPE hücreleri toplanmış ve santrifüj DMEM/F12 5 ml ekleyin. </li><li> % 0.25 tripsin EDTA ile bir araya getirilmiş iPS-RPE inkübe edilmesi ile tek bir hücre çözeltisi hazırlayın. </li><li> IPS-RPE medya ile iPS-RPE hücreleri durulayın ve üzerine toplanan hücreleri plaka taze matrigel kaplı iPS-RPE medya 4 ml iyi. </li><li> Kültür önce geçide 3 hafta için hücreler. Her 3 gün medya değiştirin. Deney için, levha iPS-RPE / cm 2 100.000 hücre. Günün 17 hücreleri toplamak. Günü 0 olarak tohumlama günü sayın. </li></ol> 5.. Örnek Toplama <ol><li> iPS hücre Collection <ol><li> Kültür iPS hücreleri farklılaşmamış koloniler merkezinde yoğun olduğu gözlenmektedir kadar. </li><li> DMEM/F12 koloniler durulayın. </li><li> Accutas kullanan tek hücrelere ayrıştırmaları<html> e. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de, 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri toplamak. Süpernatant aspire. 2 ml DMEM/F12 içinde yeniden süspanse edin. </li></ol></li><li> Fetal RPE Koleksiyonu <ol><li> DMEM/F12 Fetal RPE hücre kültürleri yıkayın ve% 0.25 tripsin EDTA kullanılarak tek hücrelere ayrışır. </li><li> Bir 15 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj. Süpernatant aspire. 2 ml DMEM/F12 içinde yeniden süspanse edin. </li></ol></li><li> iPS-RPE Hücre Koleksiyonu <ol><li> IPS-RPE geçiş 3 ve geçit 5 ulaştığınızda, geçit 17. günden sonra hücreleri toplamak. Iki defa PBS içinde iPS-RPE yıkayın ve 1.0 ml% 0.25 tripsin ile inkübasyon sonucunda tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. </li><li> Buz iPS-RPE medya 2 ml tripsin nötralize. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de, 15 ml konik bir tüp ve santrifüj hücreleri toplamak. Süpernatant aspire. </li><li> Mikroboncuk kiti lekeleme tampon maddesi, 3 ml hücre süspansiyonu yeniden süspanse edin. </li></ol></li></ol>farklılaşmamış hücreler çıkarmak iPS-RPE&gt; 6 ve_title &quot;. Negatif Seçim <ol><li> Kullanılıncaya kadar 4 ° C&#39;de tüm reaktifler tutun, ancak buz üzerinde çalışmaz. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ikinci aşama 5.3.4 hücre süspansiyonu. Süpernatant aspire. </li><li> 2 x 10 6 hücre başına microbead kiti boyama tamponu 100 ul yeniden süspanse hücreleri. </li><li> 2 x 10 6 hücre başına anti-TRA-1-60-PE antikor 10 ul ekle. </li><li> İyice karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 2 x 10 6 hücre başına tampon 1-2 ml hücreleri yıkayın. 300 x g 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatant aspire. </li><li> 2 x 10 6 hücre başına lekeleme tampon maddesi 80 ul içinde süspanse hücreler. 2 x 10 6 hücre başına anti-PE etiketli mikrotaneciklerin 20 ul (kit) ekleyin. İyice karıştırın. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe </li><li> 2 x 10 6 hücre başına lekeleme tampon 1-2 ml ilave edilir. 300 x g 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatant aspire. </li><li> 500 &amp; # süspansiyon hücrelerin956, lekeleme tamponu l. </li><li> Manyetik hücre ayırma: <ol><li> Manyetik hücre sıralayıcı sütun yerleştirin. Lekeleme tampon maddesi 3 ml ile sütun durulayın. </li><li> Sütunu üzerine 6.8 hücre süspansiyonu uygulanır. </li><li> TRA-1-60 negatif hücreleri toplamak için olumsuz limanında bir tüp yerleştirin. </li></ol></li></ol> 7. Toplam RNA Ekstraksiyon <ol><li> Lyse nükleik asit miniprep için tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen bir mikrosantrifüj homojenleştirici küçük spin kolon yoluyla örnekleri çalıştırarak hücreleri. </li><li> IPS hücreleri, iPS-RPE ve küçük RNA molekülleri 27 korumak için tasarlanmış ticari olarak piyasada mevcut RNA özütleme kiti ile fetal RPE toplam RNA ekstrakte edin. </li><li> Nanodrop spektrofotometre kullanılarak toplam RNA konsantrasyonları belirler. </li></ol> 8. Bioanalyzer ve Microarray Deneyi <ol><li> Piyasada mevcut RNA kaliteli kiti ile birlikte Bioanalyzer ile RNA bütünlüğünü kontrol edin. </li><li> 100 ng of inkübe30 dakika boyunca 37 ° C &#39;de dana bağırsak fosfatazı ile total RNA </li><li> 5 dakika boyunca 100 ° C &#39;de% 100 DMSO kullanılarak RNA denatüre. </li><li> PCP-Cy3 1 saat boyunca 16 ° C&#39;de inkübasyon yoluyla T4 ligazı kullanılarak örnekleri etiketleyin. </li><li> Bir 8_x_15K formatta insan miRNA dizi üzerinde melezleşir. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre diziler yıkayın ve bir tarayıcı kullanarak 5 mikron çözünürlükte tarayın. </li><li> MiRNA mikroarray ile uyumlu mikrotertip özellik çıkarma yazılımı kullanarak veri elde. </li><li> Her bir numunedeki ifadenin rölatif seviyesini belirlemek üzere miRNA sinyalleri işler. </li><li> Örnek gruplar arasında, her miRNA ekspresyon seviyelerini karşılaştırın. Daha fazla analiz için en az iki kat diferansiyel ekspresyonu ile miRNA&#39;lar seçin. </li><li> Farklı olarak ifade miRNAs 28 görselleştirilmesi için ısı haritaları oluşturmak için yönergeleri izleyin, veri analizi için ticari olarak satılan yazılım kullanma. </li></ol> 9. Yol Analizi <ol><li> Excel formatında 8.9 seçilen miRNAs verileri kaydetmek. </li><li> Online RNA yolu analiz programına oturum açın. Excel dosyasını yükleyin. Dosya biçimi için &quot;Esnek Format&quot; seçeneğini seçin ve tanımlayıcı türü için açılır listeden &quot;Agilent&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Ham veri başlığının altında, kimlik sütunu prob &quot;ID&quot; atamak ve &quot;Gözlem 1&quot; atamak ve günlük rasyon sütuna &quot;oranı log&quot;. Diğer tüm sütunlar için &quot;görmezden&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Aşağıdaki gibi analiz için parametreleri seçin: Güven: deneysel sadece görülmektedir; doğrudan ve dolaylı ilişkiler arasında; ve endojen kimyasallar içerir; Referans kümesi olarak marifet Bilgi tabanını seçin. Tüm türler veri, tüm hücre hatları ve dokuları ve tüm mutasyon içeren bir referans moleküllerin bir veritabanı seçin. </li><li> Run ağ ve yolu analizleri. </li></ol>

<ol><li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+regulate+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation.</a> Front Genet. 3, 191 (2012).</li>
<li>Romano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+commentary+on+iPS+cell+biology%3A+Potential+applications+in+autologous+tissue+and+cell+transplantation%2C+development+of+new+models+for+the+study+of+human+pathological+conditions+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening.</a> J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).</li>
<li>Almeida, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+pluripotent+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives.</a> Circ Res. 112, 549-561 (2013).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).</li>
<li>Kokkinaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem-derived+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cells+exhibit+ion+transport%2C+membrane+potential%2C+polarized+vascular+endothelial+growth+factor+secretion%2C+and+gene+expression+pattern+similar+to+native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE.</a> Stem Cells. 29, 825-835 (2011).</li>
<li>Bharti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Pera, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+A+new+year+and+a+new+era%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells. A new year and a new era.</a> Nature. 451, 135-136 (2008).</li>
<li>Subba Rao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+outside+the+liver%3A+Induced+pluripotent+stem+cells+for+hepatic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications.</a> World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+source+of+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a source of cardiac regeneration.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).</li>
<li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sensory+neurons+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+support+varicella-zoster+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Alipio, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+hyperglycemia+in+diabetic+mouse+models+using+induced-pluripotent+stem+%28iPS%29-derived+pancreatic+beta-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).</li>
<li>la Cour, M., Tezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Organ+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium.</a> Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).</li>
<li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li>
<li>Muniz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+uptake%2C+processing+and+secretion+in+human+iPS-RPE+support+the+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).</li>
<li>Leonardo, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+microRNAs+in+pluripotency+and+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming.</a> Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).</li>
<li>Arora, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+microRNAs+affecting+mRNA+expression+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development.</a> BMC Dev Biol. 10, (2010).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).</li>
<li>Mallanna, S. K., Rizzino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+microRNAs+in+the+control+of+embryonic+stem+cells+and+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Dev Biol. 344, 16-25 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466, 835-840 (2010).</li>
<li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphthalmia-associated+transcription+factor+%28MITF%29+promotes+differentiation+of+human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+by+regulating+microRNAs-204%2F211+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression.</a> J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+miRNA+signatures+during+the+differentiation+of+hESCs+into+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Wilson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).</li>
<li>Neveu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+two+distinct+p53-related+human+pluripotent+stem+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states.</a> Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li>
<li>Qiagen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNeasy+Mini+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22Sample+and+Assay+Technologies%22%5BJournal%5D)">miRNeasy Mini Handbook.</a> Sample and Assay Technologies. , (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+System+with+miRNA+Complete+Labeling+and+Hyb+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit.</a> Agilent Technologies. , (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+hESCs+and+hiPSCs+in+mTESR1+and+mTESR2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Technologies%22%5BJournal%5D)">Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2.</a> Stem Cell Technologies. , (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Analysis+of+DNA+or+RNA+using+its+wavelengths%3A+230+nm%2C+260+nm%2C+280+nm%5BTitle%5D)+AND+%22About+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm.</a> About Biotechnology. , (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Sonuç olarak, bu rapor kültür iPS hücreleri için kullanılan yöntemler, iPS-RPE ve fetal RPE açıklar. IPS türetilen RPE morfolojik ve fonksiyonel olarak fetal RPE benzer. IPS-RPE de RPE65, CRALBP, PEDF ve LRAT 16 gibi karakteristik RPE genleri ifade eder. Bundan başka bu hücrelerin karakterize etmek için, RNA ekstre edilmiş ve farklı şekilde eksprese miRNA belirlemek için mikrodizi analizi için kullanılmıştır. Sinyal yoğunluklarının analizi farklı şekilde ifade miRNA&#39;ların büyük sayı iPS-RPE daha olgun ola...

Kök hücreler sınırı ve herhangi bir somatik hücre tipi içine ayırt etmek için potansiyeli olmadan çoğaltmak için kapasitesine sahiptir. Kişiselleştirilmiş doku rejenerasyonu gelişiyle ufukta 1 olduğu gibi pluripotent kök hücrelerinin içine somatik hücreleri yeniden programlamak tekniklerinin geliştirilmesi, araştırma topluluğu ve klinisyenler arasında büyük heyecan yol açmıştır. EKH ile ilişkili etik ikilemleri engellemeyi ise İsteyerek-pluripotent kök (iPS) hücreler (ES) hücreler, embriyonik kök olarak sınırsız Replikatif potansiyeli ve pluripotensin aynı özellikleri gösterirler. Buna ek olarak, bir hastada elde edilen kök hücreleri büyük ölçüde başarılı terapötik uygulamalar 2-3 olasılığını artırarak, bir bağışıklık tepkisi uyarmak değildir. Özel kültür koşulları altında, iPS hücreleri kardiyomiyositlerde, nöronlar, pankreatik beta hücreleri, hepatositler ve retinal pigment epitel (RP de dahil olmak üzere, in vitro olarak birkaç farklı hücre tipleri, içine ayırt gösterilmiştirE) 4-12. RPE üretimi için özel bir tür fotoreseptör dış bölümlerinin parazit ışık, fagositoz emilme görsel sağlık ve fonksiyonu için gerekli olan bir çok işlevi yerine retinanın arka tarafında yer alan pigmentli epitel hücre tabakası ve retinoidlerin işleme Görsel kromofor. Gibi yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), Stargardt hastalığı ve retinitis pigmentosa (RP) gibi altta yatan RPE patoloji sonucu kör hastalıklar kanıtladığı gibi hasar veya hastalık RPE disfonksiyonu derinden fotoreseptör sağlığı ve görme fonksiyonu etkiler 13. Vizyon geri yükleyebilirsiniz gerçekten etkili tedaviler elde edilmemiştir ve sağlıklı RPE hastalıklı RPA&#39;nin yedek görme 14-15 kaybını önlemek için en iyi seçenek olabilir. IPS (iPS-RPE) türetilmiş RPE hasarlı RPE değiştirmek için hücrelerin olası kaynaktır. iPS-RPE özelliklerini gös ifadetlc RPE proteinler LRAT, CRALBP, PEDF ve RPE65; klasik yüksek pigmentli altıgen RPE morfolojisi görüntüler; cis retinal 5,16 - ve bu fagositoz, retinoid işleme ve 11 salgılama ile RPE işlevleri yerine getirmektedir. IPS-RPE tedavi edici olarak kullanılabilir önce, ancak, iPS-RPE iyice karakterize edilmelidir. RPE farklılaşmayı idare eden faktörlerin anlaşılması klinik uygulamalar için kullanılacak hücrelerin verimini ve saflığını geliştirmek için gereklidir. Hücre farklılaşması oldukça düzenli bir gen ifadesinin bir sonucudur. Transkripsiyon faktörleri genomunun ve koordinasyonu epigenetik yeniden farklılaşması ve gelişimi sırasında meydana gelen 17 hücre hayati kararlar için gereklidir. MicroRNA (miRNA) tarafından mesaj RNA (mRNA) çeviri Yönetmelik hücre kaderini etkileyen 1. yönetmeliğin henüz bir seviye sunuyor. MiRNA&#39;lar kısa, ~ 22 nt, nükleotidlerin uzunlukları bu bastir çeviri yoluylamRNA&#39;nın 3 &#39;UTR bağlanabilen ya da indirgenmesi için mRNA hedef. MiRNA&#39;lar hemen hemen tüm dokularda tespit edilmiştir ve bugüne kadar 2000&#39;den fazla eşsiz insan microRNA miRBase veritabanında kayıtlı edilmiştir. Yani, tek bir mRNA birkaç farklı miRNAs hedeflenebilir; miRNAs hedef mRNA bağlamak için sadece kısmi tamamlayıcılık gerektirir, tek miRNA potansiyel olarak onlarca veya yüzlerce hedefleri ve tersi bağlanabilir. Bu rastgele bağlanma özelliği dramatik düzenleme karmaşıklık düzeyini yanı sıra bireysel miRNA&#39;ların işlevleri belirlenmesinde zorluk seviyesi ve rol hücresel fonksiyonlarda 18-21 her çalış artar. Bununla birlikte, araştırmalar miRNA DNA metilasyon durumunu 17 etkileyerek farklılaşması sırasında gen ekspresyonunu iyileştirir göstermiştir. RPE için daha özel bir çalışmada, miR-204/211 RPE 22 epitel fenotipine yol gösterilmiştir. Başka bir grup miRNA profili analizRPE ES hücrelerinden farklılaşması sırasında ve miRNA farklı setleri ortaya farklılaşma sırasında 23 olarak ifade edilmiştir. Aslında, miRNA profil açıkça ES hücreleri, ön-madde hücreleri, ve terminal olarak farklılaşmış hücreler 24,25 dahil olmak üzere hücre tipleri, ayırt edebilir. 250&#39;den fazla miRNA&#39;ların retinada ifade edilir. Bu çalışmalara dayanarak, biz miRNA&#39;ların iPS gelen RPE farklılaşması sırasında önemli bir rol oynamaktadır varsayımında. Bu raporun amacı, IMR90-4 iPS gelen RPE farklılaşması için protokolleri tanımlamak için hücreler, mikroarray ile analiz için RNA&#39;nın toplanması ve diferansiyel üç hücre tipleri arasında ifade edilir miRNA&#39;lar, iPS hücrelerini tanımlamak için mikroarray veri analizi iPS-RPE ve fetal RPE. Toplam RNA, her bir hücre tipi kültürlerinden ekstre edilmiş ve 1205 ve 144 insan miRNAs viral miRNAs spesifik problar ihtiva eden bir miRNA mikroarray hibridize edildi. Mikrodizi sonuçları karşılaştırmak edildimiRNAs farklı olarak farklı hücre tipleri arasında ifade edildi belirlemek için d. 2 kat ya da daha fazla ifade kat değişiklik ile miRNAs daha ileri analiz için seçildi. A MiRNA analiz yazılım programı, farklı şekilde eksprese miRNAs olası hedefleri tanımlamak için ve seçilen miRNAs düzenlenir hücre ağları oluşturmak için kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 ortamı + 5X takviyesi</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Hidroklon (Fisher)</td> <td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt serum replasmanı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>MEM ortamı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 takviyesi</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Hyclone (Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiyodo-l-tironin sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Fetal RPE ortamı RTEGM kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>195406</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Hidroklonu (Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Hidroklon (Fisher)</td> <td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec yıkama tamponu</td><td>StemGent</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec durulama tamponu</td><td>StemGent</td><td>130-092-222</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 mikro boncuk kiti</td><td>StemGent</td><td>130-095-816</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec hücre sıralayıcı sütunu</td><td>StemGent</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mikro kiti</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QIA parçalayıcı</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico LabChip kiti</td><td>Agilent</td><td>G2938-90046</td><td></td></tr><tr><td>İnsan miRNA mikrodizisi v16</td><td>Agilent</td><td>G4471A</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan ips hücreleri microrna İfade profilleri, ips kaynaklanan retina pigment epiteli ve fetal retina pigment epiteli

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Bu raporun amacı, MicroRNA (miRNA) insan iPS hücrelerinden (IPS-RPE) türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), ve fetal RPE profilleri karşılaştırmak için protokolleri tanımlamaktır. Protokoller mikro-dizisi ile analiz için RNA&#39;nın toplanması ve diferansiyel olarak üç hücre türleri arasında ifade edilmiştir miRNA&#39;lar tanımlamak için mikro-dizi veri analizi bulunmaktadır. IPS hücreleri ve fetal RPE kültürü için yöntemler açıklanmıştır. İnsan iPS ikinci RPE farklılaşması için kullanılan protokol, aynı zamanda açıklanmaktadır. Biz tarif RNA ekstraksiyon tekniği miRNA mikrodizi kullanılmak için çok küçük RNA maksimum iyileşme sağlamak için seçildi. Son olarak, hücresel yol ve mikroarray verilerinin ağ analizi açıklanmıştır. Bu teknikler, üç farklı hücre tiplerinin miRNA profillerinin karşılaştırılmasını kolaylaştıracaktır.

iPS hücreleri (Şekil 1A)-RPE iPS hücrelerine farklılaşmasını teşvik için farklılaşma koşullarda yetiştirildi. IPS-RPE altıgen pigmentli hücre morfolojisi fetal RPE (Şekil 1C) benzer (Şekil 1B) klasik RPE fenotip sergiledi. Daha iyi miRNA iPS iPS-RPE farklılaşma sürecinde oynayabileceği rolü anlamak için, miRNA ifade mikroarray analizi yapıldı. Toplam RNA, iPS hücreleri, fetal RPE ve küçük RNA&#39;ların maksimal tutulmasını sağlamak için Mirv...

MıkroRNA (miRNA) insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri (iPS-RPE), ve fetal RPA&#39;nin türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök profilleri (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), karşılaştırıldı.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Bu prosedürün genel amacı, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerdeki mikro RNA ekspresyonunu karşılaştırmaktır. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen retinal pigment epiteli hücreleri ve fetal retinal pigment epiteli hücreleri karşılaştırılır. Bu işlem, öncelikle iPS hücrelerinin ve fetal RPE'nin kültüre edilmesi ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir.İkinci adım, iPS hücrelerini RPE'ye farklılaştırmaktır. Ardından, iPS hücrelerinden, iPS-RPE hücrelerinden ve fetal RPE hücrelerinden RNA ekstre edilir. Son adım ise RNA örnekleri üzerinde mikro RNA mikroarray analizi gerçekleştirmek ve verileri analiz etmektir.Nihayetinde, yolak ve ağ analizi; proliferasyon ve hücre döngüsü ilerlemesi dahil olmak üzere birden fazla hücresel ağda yer alan diferansiyel eksprese mikroRNA'ların belirlenmesi için kullanılır. Bu yöntem, olgun RPE hücre döngüsü ilerlemesi, proliferasyon ve senesensle diferansiyasyonun düzenlenmesinde mikro RNA'nın rolü gibi görme araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkisi, terapide kullanılan hücrenin optimum pasaj sayısının belirlenebilmesi nedeniyle, hastalıklı veya hasarlı RPE'yi değiştirmek için kullanılan kök hücre türevli retina pigment epiteli tedavilerine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem, IPS'den RRP farklılaşmasını düzenleyen faktörlere dair öngörü sağlayabildiği gibi, IPS'den diğer TC'ye özgü hücre tiplerinin farklılaşması gibi diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri M tester one medyumunda, yeni kaplanmış bir plakaya kuyuk başına yaklaşık 350 hücre kolonisi olacak şekilde ekin ve IPSL kolonilerinin kültürde dört ila beş gün boyunca genişlemesine izin verin.Ardından, her üç günde bir M tesser one medyumunu dört mililitre diferansiyasyon medyumu ile değiştirin ve medyumun yarısını taze diferansiyasyon medyumu ile yenileyin. Pigmentli odakların, kültürden manuel olarak diseke edilebilecek kadar büyümesini bekleyin; bu işlem yaklaşık 40 ila 50 gün sürer. Daha sonra, pigmentli kolonilerin etrafını kesip kaldırmak için 200 µL'lik bir pipet ucu kullanın.Diseke edilen kolonileri toplayıp 15 mililitrelik konik bir tüpte birleştirin. Birleştirilen RPE hücrelerine beş mililitre DMMF 12 besiyeri ekleyin ve beş dakika boyunca 300 GS hızında santrifüjleyin. Ardından, besiyerini uzaklaştırın, hücre peletini beş mililitre besiyeri içinde yeniden süspanse edin ve santrifüj işlemini tekrarlayın.Besiyerini hücre peletinden uzaklaştırın. Ardından, hücre kümeleri tekil hücrelere ayrışana kadar birleştirilmiş I-P-S-R-P-E'yi 37 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca %0,25 TRIPSIN EDTA ile inkübe ederek tek hücreli bir çözelti hazırlayın. I-P-S-R-P-E hücrelerini I-P-S-R-P-E besiyeri ile durulayın ve ardından toplanan hücreleri, 4 mL I-P-S-R-P-E besiyeri içerisinde taze matrigel kaplı bir plakaya ekin; hücreleri pasajlama öncesinde üç hafta boyunca kültüre edin ve deney süresince her üç günde bir besiyerini taze I-P-S-R-P-E besiyeri ile değiştirin.I-P-S-R-P-E hücrelerini santimetrekare başına 100, 000 hücre olacak şekilde ekin ve ardından diferansiye olmamış IPS hücrelerini toplamak için ekimden 17 gün sonra hücreleri toplayın. Hücreleri, diferansiye olmamış kolonilerin merkezinde yoğunlaştığı gözlemlenene kadar kültüre edin. Bu durum gözlemlendiğinde, kolonileri D-M-E-M-F 12 besiyeri ile durulayın ve ardından IPS hücrelerini Accutane kullanarak tekil hücrelere ayırın.Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve 300 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini iki mililitre D-M-E-M-F 12 ortamında yeniden süspanse ederek fetal RPE'yi toplayın; fetal RPE hücre kültürlerini önce D-M-E-M-F 12 ile durulayın. Ardından, hücre kültürlerini 37 degrees Celsius sıcaklıkta, %0,25 TRIPSIN EDTA kullanarak beş ila 10 dakika boyunca tekil hücrelere ayırın.Fetal RPE hücrelerini 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve beş dakika boyunca 300 GS'de santrifüjleyin. Ardından süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 2 mililitre D-M-E-M-F 12 besiyerinde yeniden süspande edin.17. günde I-P-S-R-P-E hücrelerini toplayın. Üçüncü ve beşinci pasajdan sonra, I-P-S-R-P-E hücrelerini iki kez PBS ile durulayın ve 37 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca 1 ml %0,25 tripsin ile inkübe ederek tek hücre süspansiyonu hazırlayın. Ardından, tripsini 2 ml buz gibi soğuk I-P-S-R-P-E besiyeri ile nötralize edin ve hücreleri 15 ml'lik konik bir tüpe toplayın.Tüpü 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatantı aspire edin. Hücre peletini, mikroboncuk kitinden alınan üç mililitre boyama tamponunda yeniden süspande edin; boyama tamponu içindeki I-P-S-R-P-E hücre süspansiyonunu 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı aspire edin ve yeniden süspande edin.Hücre peletini, mikroboncuk kitindeki boyama tamponu ile 100 µL başına 2 × 10⁶ hücre konsantrasyonunda süspande edin. 2 × 10⁶ hücre başına 10 µL anti TRA1-60 PE antikoru ekleyin. İyice karıştırın ve ardından 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.Hücreleri, her 2×10⁶ hücre için 1 mL boyama tamponu ile yıkayın. Ardından, hücre süspansiyonunu 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Sonrasında, üst fazı aspire edin ve hücre peletini her 2×10⁶ hücre için 80 µL boyama tamponu içerisinde yeniden süspande edin.Ardından, her 2 × 10⁶ hücre için 20 µL anti-PE işaretli mikroboncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika inkübe edin. Her 2 × 10⁶ hücre için 1 mL boyama tamponu ekleyin, 300 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.Ardından hücre peletini 500 µL boyama tamponunda yeniden süspande edin ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı üzere manyetik hücre ayırıcıda TRA1-60 negatif hücreleri için ayıklama yapın. Her örneği, nükleik asit mini preparasyonları için tasarlanmış, ticari olarak temin edilebilen bir mikro santrifüj homojenizatör mini spin kolondan geçirerek hücreleri lize edin. Ardından, küçük RNA moleküllerini korumak için tasarlanmış, ticari olarak temin edilebilen bir RNA ekstraksiyon kiti ile iPS hücrelerinden, iPS-RPE ve fetal RPE'den toplam RNA'yı ekstrakte edin.Toplam RNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir NanoDrop spektrofotometresi kullanın; örnek grupları arasında en az iki kat farklı ekspresyon seviyelerine sahip olduğu belirlenen mikroRNA'ların listesini içeren bir Excel dosyası oluşturun. Ardından, çevrimiçi RNA yolak analiz programına giriş yapın ve Excel dosyasını yükleyin. Dosya formatı için esnek formatı (flexible format) seçin ve tanımlayıcı (identifier) için açılır listeden Agilent'ı seçin.Ham veri başlığı altına yazın. Prob ID sütununa ID'yi atayın ve log oranı sütununa gözlem birini ve log oranını atayın. Diğer tüm sütunlar için yoksay seçeneğini seçin.Analiz parametrelerini şu şekilde seçin: güven düzeyini yalnızca deneysel olarak gözlemlenenler şeklinde belirleyin, doğrudan ve dolaylı ilişkileri dahil edin ve endojen kimyasalları ekleyin. Referans set olarak Ingenuity bilgi tabanını seçin. Ardından referans molekül veritabanını belirleyin.Bu, tüm türlerden, tüm hücre hatlarından, dokulardan ve tüm mutasyonlardan gelen verileri içerir. Tüm parametreleri seçtikten sonra, ağları seçerek ağ analizini çalıştırın. Ardından örtüşen ağları seçin ve sonuçları görmek için ilgilenilen bir ağa tıklayın.I-P-S-R-P-E hücrelerine farklılaştırılan IPS hücreleri, fetal RPE hücrelerine benzer şekilde, heksagonal pigmente hücre morfolojisi ile klasik RPE fenotipini sergilemiştir. Farklılaşmamış IPS hücrelerinin I-P-S-R-P-E hücreleri ile mikro RNA ekspresyon profillerinin karşılaştırılması, 47 mikro RNA'nın yukarı regüle olduğunu ve 36'sının aşağı regüle olduğunu ortaya koyarken; fetal RPE hücrelerinde I-P-S-R-P-E hücrelerine kıyasla 61 mikro RNA'nın yukarı regüle, 49'unun ise aşağı regüle olduğu görülmüştür. Ingenuity IPA yazılımı ile yapılan yolak analizi, diferansiyel eksprese olan mikro RNA'ların hedef genlerinin hücresel gelişim, büyüme ve hücre döngüsü dahil olmak üzere hücresel süreçlerde yer aldığını göstermiştir. Bu analiz ayrıca, in vivo olarak oküler dokularda eksprese edilen mikro RNA'ların, IPS hücrelerine kıyasla I-P-S-R-P-E ve fetal RPE'de zenginleştiğini belirtmiştir. Bu prosedürü uygularken, işlemin ardından RNA örneklerinin kontaminasyonunu ve degradasyonunu önlemenin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Deployment sonrasında, her hücre tipindeki mikro RNA ekspresyon seviyesini doğrulamak için R-T-P-C-R gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, görme araştırmaları alanındaki araştırmacıların rrp'de mikro RNA'nın diferansiyasyon ve hücre döngüsü ilerlemesindeki rolünü keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, IPS'den RPE'nin nasıl türetileceği ve I-P-S-R-P-E'nin mikroRNA ekspresyon profilinin IPS hücreleri ve fetal RPE ile nasıl karşılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Burada, sıçanlarda ve farelerde bir RPE hücresi bolusunu subretinal olarak enjekte etmek için multimedya formatında topluluk tarafından kabul edilen bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, retinal dejenerasyonun hayvan modellerinde implantasyon üzerine aşılanmış RPE hücrelerinin kurtarma potansiyellerini, güvenlik profillerini ve hayatta kalma kapasitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır.

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Bu iletişim kuralı, retina pigment epitel hücreleri (RPE) pluripotent kök hücre üretmek açıklar. Yöntem farklılaşma kök hücre içine olgunlaşmamış RPE on dört gün ve olgun, fonksiyonel RPE üç ay sonra büyüme faktörleri ve küçük moleküller bir arada kullanır.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Öğrenin, iPS hücreleri ve bunlardan türetilen retina pigment epiteli ile fetal RPE arasındaki microRNA ifade profillerini mikroarray analiziyle nasıl karşılaştırılır. Bu yöntem, retina hücre gelişimi ve rejeneratif tıp araştırmaları için önemli bilgiler sunar.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

Daha fazla video keşfet