Name: Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama Aedes aegypti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin Aedes aegypti tat algılayıcı sinirlerinin elektrofizyolojik yanıtlarını ve RNA dizileme ile gen ifadesini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, böceklerde tat algısının genetik temelini anlamak için araştırmacılara yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, istatistiksel analizler için USDA, Tarımsal Araştırma Servisi, Henry A. Wallace Beltsville Tarımsal Araştırma Merkezi, Biyometrik Danışmanlık Servisi, Beltsville, MD'den Bryan T. Vinyard'a teşekkür eder. Bu çalışma kısmen, Silahlı Kuvvetler Haşere Yönetim Kurulu (AFPMB) aracılığıyla Savunma Bakanlığı tarafından finanse edilen Konuşlandırılmış Savaş Savaşçısı Koruma (DWFP) Araştırma Programından JCD'ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Yetiştirme Ae. aegypti yetişkin <ol><li> Sığ tepside yaklaşık ¾ inç suda Hatch yumurta. Aşırı kalabalık yetişkinler boyutunu azaltacaktır. </li><li> Arka larva 25 ° C (12-HL: 12-HD) de ve zemin balık gıda ile beslemek. NOT: Fazla besleme sağkalım oranlarını azaltmak olabilir. </li><li> Günlük Pasteur pipeti tek tek pupa çıkarın ve böylece 24 saat yaş gruplaşmalar kurulması, ince örgü kapaklı plastik tabaklar küçük çevreleme kovalar içinde (5.5 cm x 9 cm) aktarın. </li><li> Bir kafes yuvanın elek çeperlerine yerleştirilen pamuk besleme yetişkin sivrisinekler,% 10 sukroz çözeltisi larvaları ile aynı bir fotoperyod ile 27 ° C&#39;de ve% 70 nispi nemde bir çevre odasında sivrisinekler. </li><li> Elektrofizyoloji için, 5-10 gün eski hayvanları kullanın. Genel olarak, büyük hayvanların daha iyi sonuçlar üretecektir. RNA izolasyonu için, 5-10 gün eski aralığında bir tek 24 saat yaş gruplama içinde olan hayvanları kullanın. </li></ol><ol><li> Seçilen duyusal nöronlar minimal aktivite ortaya çıkaran elektrolit (örneğin, 1-10 mM), uygun bir konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 mM NaCl veya 1mm KCl bir deney başlarken temel aktiviteyi test etmek için makul elektrolitler bulunmaktadır. </li><li> Tek başına elektrolit ile karşılaştırıldığında büyük çivi aktivitesi üzerinde hiç veya çok az etkiye sahip olan her deney uygun bir çözücü içinde kimyasal (eğer su kullanılması etanol ya da DMSO) içinde çözülür. % 10 etanol ya da% 1 DMSO nihai konsantrasyonu uygun başlangıç ​​konsantrasyonlardır. </li><li> Böcekler besleme caydırıcı veya uyarıcı iyi tarif edilmiştir kontrol kimyasalları (tatlı için acı veya sukroz gibi kinin) uygun seçin. </li></ol> 3. Elektrofizyoloji (8 ipucu kayıt; 1 Şekil) <ol><li> Mekanik cam kılcal çekerek Formu cam elektrotlar. Isı Optimize ve uygun şekilli recordi oluşturmak için cam çekmek için ayarları çekinng elektrotlar. Dikkatle hedef Sensillum zarf yeterince geniş, ama komşu yapılarla temas önlemek için yeterince küçük açılış elektrot ucu oluşturmak için bir mikroskop altında forseps kullanılarak cam elektrot ucu kesiyorum. </li><li> Bir mikroskop altında, görsel morfoloji ile tespit ve ucu kayıt tekrarlanabilirlik sağlamak için hedef Sensilla / Sensillum yerleştirin. Hazırlık hayvanlar elektrot giriş açıdan Sensilla ücretsiz erişim sağlamak için. </li><li> -20 ° C&#39;de derin dondurucuda soğuk anestezisi yetişkin böcekler. Soğuğa aşırı maruz periferik nöronlarda zarar kaçının. Cam slayt jilet ile selofan bantı dar şeritler halinde kesilir. Dar şeritler kullanılarak cam slayt tüm böcek hareketsiz. </li><li> Kayıtsız (toprak) elektrot olarak hizmet dorsal toraks veya göz içine bir kimyasal bilenmiş tungsten tel yerleştirin. </li><li> Ilgi uyarıcı çözeltisi ile adım 3.1 yapılan cam elektrot doldurun. Eklenen bir şırınga kullanarak, kapağı doldurmakçekti ucundan Illary ucunu künt. Aşağı çekti ucunu tutarak, tüm hava kabarcıklarını dışarı itin. Kayıt ve uyarıcı elektrot olarak hizmet adım 3.1 yapılan cam elektrot içine bir gümüş tel (chloriding isteğe bağlı) takın. </li><li> Böceklerde temas chemoreceptive Sensilla gelen kayıtları için tasarlanmış bir ön amplifikatöre elektrotları bağlayın. Bu Preamplifikatör (300 Hz-3 kHz bant geçiren filtre) mümkün olduğunca giriş uyarıcı kadar yakın nöronal aktiviteyi yakalamak için yerleşme süresini azaltacaktır. Toplamak mağaza ve başak kayıt yazılımı ile donatılmış bir mikrobilgisayar kullanarak elektrik sinyallerini analiz. NOT: ölçüde sinyal-gürültü oranını artırabilir düzgün kayıt kurulumu Topraklama. </li><li> Işlevselliği sağlamak için bir kontrol çözümü (elektrolit yalnızca) ile Sensilla teşvik. Tüm hazırlıklar için uyaran artifact aşağıdaki 200 msn başlayan ani sayın. </li><li> Doz-cevap çalışmaları hariç, bütün deneyler için Test kimyasal sırasını Rastgele,önyargı ortadan kaldırmak için. Doz-cevap çalışmaları için, deney kimyasal artan konsantrasyonlarına Sensilla maruz kalmaktadır. Yeterli iyileşme sağlamak için uyarılara arasında 3 dk en az bekleyin. NOT: Bu gereklilik, böcek ve Sensilla bağlı olarak değişebilir. Eşik standart sapması test edilen en düşük konsantrasyonda standart hata ile örtüşmeyen olan konsantrasyon olarak tanımlanır. </li></ol> 4. RNA izolasyonu ve Sıralama (Şekil 2) <ol><li> Sıkıca geçmeli kapak tüpleri uygun doku disruption.Prepare eşlik RNaz ücretsiz havan elleri önce kuru buz üzerinde onları soğutma sıkıca uydurma RNAse ücretsiz pestles hazırlayın. Aktif aşırı yoğunlaşmayı önlemek için diseksiyon sürece kapalı toplama tüpleri tutun. </li><li> Süzülmüş aspiratör kullanarak, 30 ila 40 soğuk anestezi sivrisinek (° C derin dondurucuda -20 15 sn), soğuk sahnede ve sıralama cinsiyete göre yerleştirin. Yer hayvanlar tat uzantıları zarar değil kanatlarını kavrama, aşağı tarafı dorsal.</li><li> Ince forseps iki çift kullanarak, bir mikroskop altında erkek veya kadınlardan eşleştirilmiş Labella veya tarsi incelemek ve komşu dokuların dahil sınırlamak. Not: 500 eşleştirilmiş labella mRNA&#39;nın yaklaşık 800-1.000 nanogram elde edilir. 400 ayrı tarsi (5 segmentlerinin her biri) toplam mRNA 1,200-1,800 nanogram verir. </li><li> Nefes nefese-forseps bir çift, hafifçe iç stileleri açığa Labella&#39;ya sadece proksimal sivrisinek burnumun kavramak. Toplama-forseps diğer çifti kullanarak, Labella kaldırmak ve soğuk toplama tüp tarafına doku ekleyin. </li><li> Forseps bir çift ile hafifçe tibia ve ilk tarsal segment kavşakta sivrisinek bacak kavramak. Forseps diğer çifti kullanarak, tarsi çıkarın ve soğuk toplama tüpünün yan doku ekleyin. NOT: istedim ve istenmeyen doku arayüzünde dikkate hücre tipleri alın. Bu doku komşu dahil sınırlamak için önemli olmakla birlikte, istenen doku bölümlerini ihmal değil aynı derecede önemlidir. final numune doğru çıkar tüm organı temsil etmelidir. Toplama forseps tam kazıma veya sadece istenilen doku kapma kurtarmak öyle ki doyumsuz forseps ile kesin bir sınır oluşturun. </li><li> Periyodik olarak, tüpün alt kısmında doku tutmak için 9.000 xg&#39;de kısaca 0 ° C santrifüj toplama tüpü aşağı doğru döndürün. Nem diseksiyonu sırasında toplama tüpleri birikir ise, toplanan doku kapsayacak şekilde soğuk Trizol reaktif 50ul ekleyin. </li><li> Anti-leke laboratuvar işaretleyici kullanarak, açıkça bir RNaz ücretsiz 1.5 ml toplama her doku türü için kapak tüp ek etiket. (Trizol eğer ince parçalara) 1.5 ml tüp raf ve sıvı azot kullanarak, sonra ince toz haline doku öğütmek donma. Kez tekrarlayın. 1 ml Trizol toplam hacmi getirin ve vorteks zemin dokusu tekrar süspansiyon. </li><li> Kloroform, 200 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika sonra, 4 ° C&#39;de ve 15 dakika boyunca 11,000 x g&#39;de santrifüj aşağı doğru döndürün. Dikkatlicegenomik DNA, filtre kolonuna sulu katman ekleyin. 5 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. Içeri akış ve kamış ile karıştırmak için RNaz içermeyen,% 70 etanol, eşit hacim. Bir RNA toplama kolonuna sıvı aktarın ve verilen talimatlara göre RNA ekstraksiyon devam ediyor. </li><li> Ölçmek ve hassas spektrofotometre toplam RNA saflığını değerlendirmek ve herhangi bir standart RNA sıralama yöntemi ile devam edin. </li></ol> 5. Kantitatif RT-PCR RNA Dizilimine Doğrulama (Şekil 3) <ol><li> Tahmin edilen sekans bolluğu ve varsayılan duyusal gen fonksiyonu hem de bir dinamik alan üzerinde göreceli gen ekspresyonu seviyesini karşılaştırmak için mümkün olduğu kadar çok gen seçin. </li><li> Her bir hedef genin için tasarım primer çiftleri belirli 100-180 baz çiftlik PCR ürünü amplifiye etmek için. Set başına en az bir astar sağlayarak non-spesifik gDNA amplifikasyon dışla bir intron sınır kapsamaktadır. Seçenek olarak ise, genom kirlenmeyi azaltmak için DNaz tedavisi kullanımı. </li><li> ToplamakÖnceki bölümde tarif edildiği gibi böcek doku. Tüm Mah-PCR reaksiyonları tamamlamak için yeterli RNA sağlamak için gereken ne kadar doku hesaplayın. NOT: Biyolojik üçlü ve teknik üçlü reaksiyonları sonuçlarında maksimum güven sağlayacaktır. </li><li> , Biyolojik ve teknik hem de her biri için her hedef gen ve ortalama (Ct [hedef] -CT [Referans]) çoğaltmak - X hedef olarak göreceli gen kantifikasyonunu hesaplayın. Biyolojik çoğaltır arasında Ct değerleri normalleştirmek için temizlik gen (ler) kullanın ve bağıl ifade karşılaştırmalarda Y ekseni ölçeği kök. </li><li> RNA seq ve regresyon tabanlı önyükleme denklik prosedürü 9 tekrarlı her dokudan elde edilen verilere uygulanan kullanılarak QRT-PCR veri setleri benzerliğini değerlendirin. NOT: Bu prosedür gözlenen RNA-seq ve Mah-PCR verilerine etrafında inşa edilebilir en küçük &quot;benzerlik bölgesini&quot; tanımlar ve qRT- ile ölçülen bağıl gen ifadesini izinPCR, RNA-seq göreceli gen ifadesinin ölçümü istatistiksel eşdeğer kabul edilecek. </li></ol>

<ol><li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220%2C+picaridin%2C+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti%2C+Anopheles+stephensi%2C+and+Phlebotomus+papatasi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li>
<li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini+review%3A+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li>
<li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+chemosensory+appendages+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae+reveals+tissue-+and+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding.</a> BMC Genomics. 12 (271), (2011).</li>
<li>Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLOS Genet. 8 (8), e1002930(2012).</li>
<li>Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+adult+Drosophila+antenna+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Studies%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing.</a> Zoological Studies. 52 (42), (2013).</li>
<li>Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+Aedes+aegypti+odorant+receptor+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family.</a> Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).</li>
<li>Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+receptors+and+neurons+for+DEET+and+new+insect+repellents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents.</a> Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).</li>
<li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li>
<li>Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regression-based+equivalence+test+for+model+validation%3A+shifting+the+burden+of+proof%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof.</a> Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li>
<li>Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li>
<li>Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptor+neuron+responds+to+DEET+and+other+insect+repellents+in+the+yellow-fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwiss%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).</li>
<li>Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptor+expression+in+the+labella+and+tarsi+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).</li>
<li>Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gr+family+of+candidate+gustatory+and+olfactory+receptors+in+the+yellow-fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti.</a> Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).</li>
<li>Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundance+of+ubiquitously+expressed+genes+revealed+by+tissue+transcriptome+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data.</a> PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598(2009).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+based+criterion+for+gene+expression+calls+using+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data.</a> Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).</li>
<li>Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+active+genes+in+deep+RNA-seq+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies.</a> BMC Genomics. 14 (778), (2013).</li>
<li>Isono, K., Morita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+designs+of+insect+taste+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cellu.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular designs of insect taste receptor system.</a> Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

tat Sensilla gelen kayıt aksiyon potansiyelleri en zorlu yönü hangi yanıtları karar olduğunu &quot;normal.&quot; verilen bir böcek türlerinin toplam sayısı ve tat reseptör nöronların hassasiyetleri (GRNs) için ilk defa kayıt tek tat Sensillum ucu istihdam zaman vardır muhtemelen bilinmeyen. Birçok ön kayıtları ilk aralığı ve test etmek için kimyasal konsantrasyonlarını karar gereklidir. Bu durumda, bir tek GRN&#39;de DEET&#39;in (Şekil 1) düşük konsantrasyonlarda yanıt gözlem ile başladı. Daha sonra biz...

DEET, Picaridin, sitronellal ve IR3535 gibi bileşikler etkili bir 1,2 aegypti önemli hastalık vektörü Aedes dahil sivrisinek, püskürtmek için gösterilmiştir. Biz sivrisinek iticilik ile ilgili hücreleri belirlemek için özel tat Sensilla ile ilişkili duyusal nöronlar aksiyon potansiyelleri kayıt. Bu dokularda eksprese edilen genlerin alt baş dizilemesi ile birleştiğinde, geliştirilmiş iticilik özellikleri için yeni bileşiklerin taranması için büyük olasılıkla bu hücrelerin yanıtlara aracılık genleri tespit edebilir. RNA-seq hızla gen ifadesinde zamansal ve mekansal değişiklikleri izleme için standart haline güçlü bir araçtır. RNA seq böcek duyusal kulakçıkların analizleri ve organların büyük gen 6 geleneksel PCR bazlı arama gen iyileştirilmesi, çeşitli insekt türlerinin 3-5 moleküler reseptörlerine ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Böcekler en çeşitli hayvan sınıfını temsil, önbirçok fırsat reyi genler ve benzersiz fenotipleri arasındaki bağlantıyı incelemek için. RNA seq teknoloji herhangi bir yaşayan böcek doku üzerinde kullanılabilecektir. Benzer şekilde, uniporous tat Sensilla duyu hücrelerinden elektrofizyolojik kayıt birçok farklı böcek türleri elde edilebilmektedir. Bu iki teknik eşleştirme araştırmacılar gözlenen kimyasal duyu fenotip dahil set genleri daraltmak için izin verir. Farklı türler belirli zorlukları sunacak, ancak kimyasal duyu reseptör genleri ve bir kimyasal duyu adaptasyon arasındaki bağlantıyı bilgilendirebilir. büyüklüğü ve kimyasal duyu Sensilla morfolojisi değişkendir ve gürültüyü azaltmak ve tekrarlanabilir sinyalleri tespit aksiyon potansiyelleri kaydederken kapsamlı sorun giderme gerekebilir. Kimyasal duyu organlarının diseksiyonu önemsiz ya da hassas ve zaman böcek morfolojisi ve büyüklüğüne bağlı olarak, alıcı olabilir. Yüksek kaliteli RNA Kurtarma böyle sırasında belirli pigmentleri kaçınarak, yanı sıra bazı sorun giderme gerekebilirDoku Kolleksivonu. Davranış denemelerle itici bileşiklerin etkisini gösteren doğrudan ve bilgilendirici olmakla birlikte, bu yaklaşım, zaman etki mekanizması ile ilgili olarak, yoğun ve geniştir. RNA-seq ile birleştiğinde Elektrofizyoloji böcekler kaçınma davranışları neyin daha spesifik analizler için izin verir. Kimyasal ayrımcılık &quot;araç&quot;, bir böcek türlerinde tanımlanmıştır sonra, daha özel girişimler bilinmektedir kovucular mümkündür geliştirmek için. Bu davranışlarından sorumlu duyu hücrelerinde reseptörleri ve ilgili proteinler doğrudan kimyasal tarama için heterolog bir şekilde eksprese edilebilir. Ayrıca, moleküler modelleme kimyasallar bu reseptörlerin 7 güçlü tepkiler hangi tahmin edebilirsiniz. duyusal dokuların dar kümesindeki tüm aktif genlerin fotoğraf da diğer türlerdeki benzer genlerin tanımlanması yararlı olabilir. Dizi homolojisi ve sentezleme si kullanılarakmilarities, araştırmacılar büyük olasılıkla böcekler üzerinde geniş etkili kovucular yanıtlar aracılık moleküler reseptör setleri oluşturabilir. Biz böcek kimyasal duyu yolları yapısökümünden araştırmacılar yardımcı olmak ve sigara modeli ve ekonomik açıdan önemli böceklerin Nöroetoloji dalmak için fazla ikna için aşağıdaki protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td>Cam kılcal</td><td>A-M Sistemleri</td><td>628000</td><td>Standart, 1,5 mm X 0,86 mm, 4"</td></tr><tr><td>Gümüş telli</td><td>A-M Sistemleri</td><td>7875.015</td><td>" çıplak</td></tr><tr><td>Tungsten tel</td><td>Alfa Ürünleri</td><td>369</td><td>0.127 mm çap</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Buzdolabına uygun sahne</td><td>BioQuip Ürünleri</td><td>1429</td><td>Chill Tablo</td></tr><tr><td>Ön amplifikatörü</td><td>Syntech</td><td>Tat Probu</td><td></td></tr><tr><td>elektrofizyoloji için</td> ön yükseltici Yazılımı <td>Elektrofizyoloji için</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td> yazılımı</tr><tr><td>TetraMin balık yemi</td><td>Tetra</td><td>Tropikal balık yemi granülleri</td><td>ince toza öğütülmüş balık yemi</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA izolasyon reaktifi</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>, gDNA eliminator ve RNeasy spin sütunları,</td></tr><tr><td>Nanodrop spektrofotometre</td>, <td>Nano Drop Ürünleri</td>, <td>ND-1000</td><td>masa üstü spektrometre,</td></tr><tr><td>R istatistik</td><td>ücretsiz yazılımı (Robert Gentleman ve Ross Ihaka tarafından oluşturulan)</td> içerir <td>www.r-project.org</td><td>İstatistik paketinin lm fonksiyonunu ve R bilgi işlem ortamında eşdeğerlik paketinin equiv.boot fonksiyonunu kullanın.</td></tr><tr><td>1.5 ml tüp rafı</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Dokuyu dondurmak ve öğütmek için birkaç boş kuyuya sıvı nitrojen dökün.</td></tr><tr><td>Havaneli 1.5 ml toplama tüpleri</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase içermeyen</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>1.5 ml tüpün dibinde tutmak için donmuş dokuyu aşağı doğru döndürün.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Tasarım aracı</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

fizyolojik kayıtlar ve sarı-ateş sivrisinek tat Çıkıntılara rna sıralama aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Sivrisineklerin duyusal nöronlarından gelen aksiyon potansiyellerinin elektrofizyolojik kaydı, araştırmacılara bu hastalık vektörlerinin kimyasal algısına bir bakış sağlar. Son zamanlarda, dişi Aedes aegypti'nin etiketinde, doğrudan elektrofizyolojik araştırma yoluyla DEET ve diğer kovuculara ve ayrıca acı kinine yanıt veren bir acı algılama nöronu belirledik. Bu tat reseptörü nöron yanıtları, bu kontakt kemoresepsiyon dokularında eksprese edilen varsayılan kemoresepsiyon genlerini aydınlatmak için hem erkek hem de dişi labella ve tarsi örneklerinden toplam mRNA dizilimimizi istedi. Tarsi örnekleri her iki cinsiyet için pro-, mezo- ve metatorasik alt tiplere ayrıldı. Daha sonra aynı doku örnekleri üzerinde qRT-PCR yaparak veri setimizi doğruladık ve iki yöntem arasındaki sonuçları karşılaştırmak için istatistiksel yöntemler kullandık. Moleküler işlevi ele alan çalışmalar, artık sivrisinekler tarafından kovucu algısında rol oynayanları belirlemek için spesifik genleri hedefleyebilir. Bu reseptör yolları, zararlı virüslerin yayılmasını engellemek için konak arama davranışının bozulmasına yönelik yeni kovucuları taramak için kullanılabilir.

Ae aksiyon potansiyellerinin iz kayıtları. aegypti tat Sensilla (Şekil 1) kimyasal bir dizi doğrudan uyarılması etkinliğini göstermektedir. Bu teknik, makul bir zaman aralığında (genellikle az 500 ms) içinde belirli bir genlik ve süreye sahip sivri sayarak bir uyarıcı kimyasal tepkiler ölçmek için kullanılabilir. İz kayıtları deneysel koşullar, belirli bir dizi şartlar altında kolaylıkla tekrar üretilebilir olmalıdır. Aksi takdirde, gözlenen fizyolojik yanıtlar testi türlerinin bireyle...

Elektrofizyolojik inceleme ile belirlendiği zaman Aedes aegypti büyük tat uzantıları gen ekspresyonunu değerlendirmek için iki yöntem kullanılarak,, varsayım olarak, acı ve itici bileşikler, nöronal yanıtları altında yatan genlerin dizi belirledik.

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Bu prosedürün genel amacı, böceklerde tat alma nöronlarının tepkilerini gözlemlemek ve tat alma dokularındaki gen ekspresyonunu ölçmektir. Bu, ilk olarak belirli tat tüylerinin farklı konsantrasyonlarda çeşitli tatlara verdiği tepkilerin kaydedilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, tat dokularını dikkatlice incelemektir.Daha sonra örnekleri cinsiyete ve eklere göre ayırın. Daha sonra, her doku örneğinden toplam RNA'yı izole edin ve yeni nesil dizileme ve QPCR için CD NA preparatları oluşturun. Son adım, gen ekspresyon verilerini analiz etmek ve ifade edilen kemos duyusal genlerin böceklerdeki tatlara fizyolojik tepkilere nasıl aracılık ettiği gibi hipotezler oluşturmaktır.Sonuç olarak, böcek tat alma sisteminin alıcı aralığını göstermek için elektrofizyolojik kayıtlar kullanılır ve tatlandırıcı dokunun RNA dizilimi, tat alımının en önemli genetik bileşenlerini vurgulamak için kullanılır. Genel olarak, bu yöntemlere yeni olan bireyler, böcek kemoterapisinin küçük boyutu nedeniyle mücadele edeceklerdir. Duyusal ekler.İster küçük böcek organlarından diseksiyon ister kayıt olsun, hastalarda pratik yapmak bu tekniklere hakim olmanın anahtarıdır. Bu işleme başlamak için, diseksiyon mikroskobu altında cam kılcal bir pipet çektirme makinesine ince uçlu bir kayıt elektrodu çekin. Elektrot ucunu, açıklığı hedef santimetreyi saracak kadar geniş, ancak komşu yapılarla temas etmeyecek kadar küçük olacak şekilde dikkatlice kırın.Daha sonra, dondurucuda eksi 20 santigrat derecede 20 saniye boyunca iki ila dört yetişkin böceği uyuşturun. Bundan sonra, küçük selofan bant şeritleri içeren bir kapak fişi kullanarak böceklerden birini hareketsiz hale getirin. Mikroskop altında.Hedef sensörü morfolojisi ve konumu ile tanımlayın ve hayvanı, elektrot giriş açısından ona serbest erişime izin verecek şekilde yönlendirin. Daha sonra dorsal göğüs kafesine bir tungsten tel yerleştirin. Toprak elektrodu olarak hizmet etmek için, cam elektrodu uçtan ilgili uyarıcı bir çözelti ile doldurun.Ucu aşağıda tutarken hava kabarcıklarını dışarı doğru itin. Kayıt ve uyarıcı elektrot olarak işlev görmesi için elektrotun içine gümüş bir tel yerleştirin. Bundan sonra, elektrotları, nöronal aktiviteyi yakalamak için çökeltme süresinin azaltılmasına izin veren bir ön amplifikatöre bağlayın.Ön amplifikatör, elektrik sinyallerini toplamak, depolamak ve analiz etmek için spike kayıt yazılımı ile donatılmış bir bilgisayara bağlanır. Şimdi işlevselliğini sağlamak için centum'u bir kontrol solüsyonu ile teşvik edin. Uyaran artefaktını takip eden 200 milisaniye sonra başlayan ani artışları sayın.Doz yanıt sonuçlarını elde etmek için. Santimetreyi deneysel kimyasalın artan konsantrasyonlarına maruz bırakın ve yeterli geri kazanımı sağlamak için stimülasyonlar arasında en az üç dakikalık aralıklarla izin verin. Bu prosedürde, kuru buz ile sığ bir soğutucu hazırlayın.Doku toplama tüpleri için, farklı doku türlerinin toplanması için 1.5 mililitre RNA içermeyen geçmeli kapaklı tüpleri etiketleyin. Aşırı yoğuşmayı önlemek için tüpleri kapalı tutun. Daha sonra, eksi 20 santigrat derece dondurucuda 30 ila 40 sivrisineği 15 ila 30 saniye boyunca uyuşturun.Daha sonra anestezi uygulanmış sivrisinekleri soğuk bir aşamaya aktarın ve cinsiyete göre sıralayın. Böceklerin sırt tarafını kanatlarını kavrayarak aşağı çevirin, tat eklerine zarar vermemeye dikkat edin. Diseksiyon mikroskobu altında, sivrisinek pro Bois'i etiketin hemen yakınında nazikçe kavrayarak eşleştirilmiş Bella veya tarsi etiketini erkeklerden veya dişilerden ayırın.Bella, iç kalemi ortaya çıkarmak için bir çift forseps ile ve diğer forseps çiftiyle etiketi çıkarın. Daha sonra dokuyu tarsal doku için soğuk toplama tüpüne yerleştirin. Sivrisinek bacağını tibia ve ilk tarsal segmentin birleştiği yerde nazikçe kavrayın ve tarsi'yi çıkarın.Daha sonra dokuyu soğuk etiketli tüpe yerleştirin. Dokuyu tüpün dibinde tutmak için toplama tüplerini sıfır derece Celsius santrifüjde 9.000 kez yerçekiminde bir dakika döndürün. Diseksiyon sırasında toplama tüplerinde nem birikirse, toplanan dokuyu kaplamak ve korumak için 50 mikrolitre soğuk triol reaktifi ekleyin.Tüpleri sıvı nitrojen içeren 1,5 mililitrelik tüp rafında dondurun. Bundan sonra, doku bozulmadan önce kuru buz üzerinde soğutarak sıkıca oturan RNA içermeyen tokmakları hazırlayın. Sonra dokuyu ince toz haline getirin ve bir kez daha tekrarlayın.Toplam triol hacmini bir mililitreye getirin ve yeniden canlandırın. Zemin dokusunu girdap yaparak askıya alın. Bundan sonra, zemin dokusuna 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve iyice karıştırın.Oda sıcaklığında beş dakika sonra, 15 dakika boyunca yerçekiminin 11.000 katı sıcaklıkta dört santigrat derecede santrifüjde döndürün. Sulu tabakayı dikkatlice doğrudan bir genomik DNA filtre kolonuna ekleyin. Sonra beş dakika boyunca yerçekiminin 11.000 katı kadar döndürün.Akışa eşit hacimde RNA içermeyen %70 etanol ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Sıvıyı bir RNA toplama kolonuna aktarın ve RNA ekstraksiyonuna devam edin. Bundan sonra, toplam RNA'nın saflığını hassas bir spektrofotometrede ölçün ve değerlendirin ve herhangi bir standart RNA dizileme yöntemiyle devam edin.Yardımcının E GTI tat illetinden elde edilen aksiyon potansiyellerinin iz kayıtları, çeşitli kimyasallarla doğrudan stimülasyonun etkinliğini göstermektedir. Bu teknik, 500 milisaniyeden daha kısa makul bir zaman aralığında belirli bir genlik ve sürenin sivri uçlarını sayarak herhangi bir uyarıcı kimyasala verilen yanıtları ölçmek için kullanılabilir. Bu üç sivri uç, farklı hassasiyetlere sahip üç duyusal nöron alt tipine karşılık gelir.RNA-Seq veri setleri için biyolojik replikatlar, doku toplamanın maliyeti veya zorluğu ile sınırlı olabilir. Q-R-T-P-C-R, toplam gen ekspresyonunun küçük alt kümelerini daha az maliyetle doğrulama yeteneği sunar ve daha az kaynak gerektirir. Sol panelde yan yana gösterilen RNA, RN Aeq tarafından belirlenen bağıl ifade ile Q-R-T-P-C-R tarafından belirlenen bağıl ifade arasında bir karşılaştırmadır.Bu iki yöntem, gen bolluğu tahmini için farklı kimyalara dayanır. Sağ panelde grafiksel olarak görüntülenen istatistiksel eşdeğerlik fonksiyonları, her durumda kesinlik sınırlarını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, RNA izolasyonu için böcek dokusunun nasıl kesileceğini ve canlı böceklerin tat tüylerinden gelen nöral sinyallerin nasıl kaydedileceğini iyi anlamış olmalısınız.

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Koku için koku alma duyu nöronlarının elektrofizyolojik yanıtlar tek sensillum kayıtları kullanarak böcekleri ölçülebilir. Bu video makalede, sirke sineği antenler tek sensillum kayıtları nasıl gerçekleştirileceği gösterecektir...

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae</em

A açıklanmıştır sivrisinek hemocytes toplamak ve leke henüz doğru yöntem basitleştirilmiş. Bizim metodumuz Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon teknikleri doğruluk ile perfüzyon sadeliği birleştirir. Bu yöntem çalışmaları gerektiren türleri hemocytes bilgi ve bolluk kolaylaştırır.

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

RNA-Seq analizleri, model olmayan organizmalarda adaptif özelliklerin moleküler temellerini belirlemek için giderek daha önemli hale geliyor. Burada, diyapoz ve diyapoz olmayan Aedes albopictus sivrisinekleri arasında diferansiyel olarak ifade edilen genleri tanımlamak için bir protokol, sivrisinek yetiştiriciliğinden RNA dizilimine ve RNA-Seq verilerinin biyoinformatik analizlerine kadar açıklanmaktadır.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü, Aedes albopictus

Yağ vücut böceklerde Merkezi metabolik organdır. Biz izole yağ vücut dokusu yanıt çeşitli uyaranlara karşı eğitim kullanıcı sağlayan bir canlı organ kültür sistemi mevcut.

Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

Virüs iletim kaynaklı sivrisinek verimli kontrol ilgili sivrisinekler vektör potansiyelini bilgisine özel ilgi içindir. Biz zorla salya vektör yetkinlik Aedes albopictus ve üç farklı Culex takson Zika virüs iletimi için analiz etmek için bir yöntem olarak tanımlamak.

Salya vektör yetkinlik sivrisinek analiz etmek için bir yöntem olarak zorla

Bu protokolün amacı, yapay bir membran besleyici aracılığıyla Aedes aegypti sivrisineklerine hayvansal türevli ve yapay kan yemekleri sunmak ve yutturılan yemek hacmini tam olarak ölçmektir.

Aedes aegypti Sivrisineklerinde Hayvansal Türevli Kan ve Yapay Yemeklerin Beslenmesi ve Ölçülmesi

Bu makale, hem dişiler hem de erkekler de dahil olmak üzere çeşitli sivrisinek cinslerinde başarılı ve düşük gürültülü elektroantennogramlar için adım adım bir protokolü detaylandırmaktadır.

Sivrisinek elektroantennografisi için adım adım kılavuz

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Culex tarsalis sivrisineklerinin insan elleri üzerindeki sondalama ve yutma davranışlarını AC-DC elektropenetrografi kullanarak incelemek için prosedürler açıklanmıştır.

Culex tarsalis sivrisineklerinin insan ellerinde sondalama ve yutma davranışlarının incelenmesi için AC-DC elektropenetrografi

Burada, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak sivrisinek A. aegypti'de embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla genom düzenleme için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Sarı Humma Sivrisineği Aedes aegypti'de CRISPR-Cas9 Kullanılarak Genom Düzenleme

Öğrenin Aedes aegypti tat algılayıcı sinirlerinin elektrofizyolojik yanıtlarını ve RNA dizileme ile gen ifadesini nasıl ölçeceğinizi. Bu yöntem, böceklerde tat algısının genetik temelini anlamak için araştırmacılara yardımcı olur.

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama Aedes aegypti

Daha fazla video keşfet