Name: Détection et analyse de lADN dommages souris muscle squelettique In Situ Utilisation de la méthode TUNEL (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Découvrez la détection des cassures d'ADN et de la mort cellulaire dans le muscle squelettique de souris par marquage TUNEL. Cette méthode rapide et spécifique permet une analyse semi-automatisée quantitative.

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Nous remercions JHU SOM Microscope Facility pour l’utilisation du cryostat.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux décrits dans le présent protocole ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health 26. Le protocole (MO13M391) a été approuvé par le Comité Université soin et l&#39;utilisation des animaux Johns Hopkins. Sacrifice 1. néonatale souris, Dissection, et fixation <ol><li> Sacrifiez une souris néonatale par inhalation de CO 2. </li><li> Immédiatement couper la patte arrière au-dessus du genou. Jusqu&#39;au jour environ 7 postnatale, les os de la jambe sont assez doux pour couper à travers avec des ciseaux de laboratoire grandes ou lame tranchante et de l&#39;article par la suite sur un cryostat. </li><li> Placer la patte arrière dans 10 ml de glace froide 4% de paraformaldehyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube de 15 ml. </li><li> Immersion fixer le membre postérieur au paraformaldéhyde pendant 4-24 heures à 4 ° C. Tissus embryonnaires nécessite seulement plusieurs heuress de la fixation. <ol><li> Évitez la fixation de plus de 24 heures, car cela peut réduire l&#39;efficacité de l&#39;essai TUNEL. </li></ol></li><li> Cryoprotect la patte arrière en l&#39;immergeant dans une solution de saccharose. <ol><li> Changer paraformaldehyde à 10% de saccharose dans du STP dans le même tube de 15 ml, incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Changement de saccharose à 30% dans du PBS, incuber une nuit à 4 ° C ou jusqu&#39;à ce que les puits des membres postérieurs au fond du tube. Tissu peut être laissé dans 30% de saccharose pendant une période plus longue, à condition que le saccharose a été stérilisée par filtration. </li></ol></li></ol> 2. Enrobage des tissus <ol><li> Remplir un moule intégration à mi-chemin marqué avec milieu d&#39;inclusion. </li><li> Passer membre postérieur sur le dessus du milieu d&#39;inclusion, avec la face de coupe la plus proche possible à une paroi du moule. Marquer l&#39;orientation de la patte arrière à l&#39;extérieur du moule. <ol><li> Incluez plusieurs membres postérieurs et couper dans le même bloc. Cependant, il est important de se assurer que tous hindlimbs dans le bloc sont orientés parallèlement les uns aux autres pour obtenir des sections correspondant à des niveaux le long de l&#39;axe du membre. </li></ol></li><li> Couvrir avec les membres postérieurs milieu d&#39;inclusion. Si hindlimbs Maj enfoncée tout en versant le milieu, les réorienter avec une pince à bout mousse ou un cure-dent. </li><li> Autoriser milieu d&#39;inclusion pour infiltrer le tissu à la température ambiante pendant au moins 15 min. </li><li> La place moules directement sur la glace sèche ou en isopentane sur glace sèche de geler milieu d&#39;inclusion. Assurez-vous de maintenir le niveau des moules en tout temps et éviter tout déplacement du tissu intégré. </li><li> Gardez moules congelées à -80 ° C jusqu&#39;au moment de couper, pendant plusieurs mois. </li></ol> 3. Cryosectioning embarqué Limbs <ol><li> Régler la température de la chambre cryostat à -20 ° C, température de l&#39;objet à -18 ° C; régler la température de l&#39;objet de la manière nécessaire. </li><li> Équilibrer le bloc de tissu à l&#39;intérieur de la chambre de cryostat pendant au moins 30 min. Bloc correcte températurerature est crucial pour la section qualité. </li><li> Couper des sections transversales d&#39;une épaisseur de 10 um ou moins. Sections plus épaisses ne seront pas entièrement pénétré par les réactifs TUNEL. Utilisez la plaque anti-roulis, lames, et l&#39;angle de la lame (typiquement 5 °) recommandé pour le cryostat. </li><li> Recueillir sections SUR DES gelatin- ou lames de verre vectabond revêtus à la température ambiante. Placez immédiatement dans une boîte de diapositives sur glace sèche. Gardez la boîte de diapositive dans un récipient séparé avec de la glace sèche est placé près du cryostat à portée de bras. <ol><li> Couper sections transversale série à travers le grand axe de la branche, en sautant 100-200 um. Collectez au moins 3 sections adjacentes à chaque niveau de série. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Essai sur les articles des membres postérieurs en utilisant un kit disponible dans le commerce (toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire) <ol><li> Décongeler diapositives avec des sections à température ambiante et sécher pendant la nuit ou le week-end. </li><li> Réhydrater sections par immersing lames dans du PBS pour 2 x 10 min dans une jarre de Coplin. Sécher avec un laboratoire lingette, retirer autant de liquide autour de la section que possible. </li><li> Sections perméabilisent <ol><li> Utilisez soit un non-protéolytique, basée saponine-réactif commercial ou 0,5% de Tween 20 et 0,05% de Triton X100 dans du PBS. </li><li> Placer la lame dans une chambre humide. Une chambre d&#39;humidité est simple: une boîte de pointe de la pipette vide avec un couvercle étanche, avec juste assez d&#39;eau ajoutée pour couvrir le fond de la boîte. </li><li> Pipette assez réactif sur la diapositive pour couvrir la section (50 pi est suffisante pour les membres de la souris néonatales). Ne pas pipette directement sur la section, que l&#39;agitation répétée peut provoquer la section de soulever hors de la diapositive. </li><li> En utilisant une pince à bout mousse, placez un petit rectangle de parafilm sur le dessus de la section d&#39;étaler la goutte de réactif et couvrir complètement la section. Si des bulles se forment sous la parafilm, soulevez doucement le tout, sec, et réappliquer. </li><li> Incuber les lames avec permeabiliréactif tion pendant 1 heure dans une chambre d&#39;humidité couverte. Si sections commencent à décoller de la diapositive, le temps de perméabilisation peut être réduite à 30 min. </li><li> Laver les lames dans du PBS dans une jarre de Coplin 2 x 5 min. Les rectangles de parafilm devraient flotter à la surface et peuvent ensuite être enlevé et jeté. </li><li> Utiliser un laboratoire lingette, sécher autant de liquide autour des sections que possible. </li></ol></li><li> TdT médiation étiquetage de cassure de l&#39;ADN <ol><li> Suivez les instructions du kit pour faire 1x tampon de l&#39;étiquetage TdT, tampon d&#39;étiquetage suffisamment de pipette sur la lame pour couvrir coupe de tissu (50 pi est suffisante pour les membres de la souris néonatales). Incuber dans la chambre humide pendant 5 min. Alternativement, immerger la lame dans du tampon de l&#39;étiquetage TdT dans un bocal de Coplin. </li><li> Suivez les instructions du kit pour faire TdT étiquetage mélange. Le kit comprend le cobalt, le magnésium, le manganèse et des cations; le cation manganèse fonctionne bien sur une variété de tissus, y compris le muscle squelettique, le système nerveux tissUES, le foie, la peau et les os. </li><li> Pour un contrôle positif, ajouter DNase (étiqueté «nucléase&quot; dans le kit) à l&#39;étiquetage mélange TdT. Alternativement, pré-traiter une section de contrôle positif à la DNase dans un tampon de nucléase pendant 1 heure à 37 ° C, selon les instructions du kit. Conserver la solution de DNase et les articles de DNase traité loin des autres sections expérimentales pour prévenir la contamination croisée. </li><li> Pour un contrôle négatif, omettre TdT enzyme de la composition de l&#39;étiquetage. </li><li> Utiliser un laboratoire pour effacer d&#39;un tampon d&#39;étiquetage autant TdT de la diapositive que possible. Pipette TdT étiquetage mélange sur la lame (50 pi par section), couvrir avec un nouveau rectangle de parafilm et incuber dans la chambre d&#39;humidité à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Suivez les instructions du kit pour faire tampon d&#39;arrêt 1x. Utilisez un laboratoire pour effacer d&#39;TdT étiquetage mélange de la diapositive, et ajouter 200-300 tampon d&#39;arrêt ul pour couvrir la section de tissu et incuber dans la chambre de l&#39;humidité pendant 5 min. Al<html> variante, immerger la lame dans du tampon d&#39;arrêt dans une jarre de Coplin. </li><li> Laver la glissière 2 x 2 min dans du PBS. Utiliser un laboratoire pour effacer d&#39;autant PBS de la diapositive que possible. </li></ol></li><li> Le marquage fluorescent <ol><li> Suivez les instructions du kit pour préparer une solution d&#39;étiquetage pour étiqueter fluorescéine dNTP au cassures de l&#39;ADN. solution de pipette sur la lame (50 ul par section), couvrir avec un nouveau rectangle de parafilm, et incuber dans la chambre humide pendant 20 minutes. </li><li> Laver la lame pendant 2 min dans du PBS dans une jarre de Coplin. Utiliser un laboratoire pour effacer d&#39;autant PBS que possible de la diapositive. </li><li> Diluer Hoechst 33258 colorant nucléaire à 1 pg / ml dans PBS et la pipette sur la lame (100-200 pi est suffisant pour couvrir la section). Incuber dans la chambre humide pendant 5 min. </li><li> Laver 3x pendant 5 min dans du PBS. </li><li> Lamelle avec Antifade milieux de montage de fluorescence et de sceller les bords avec du vernis à ongles. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5 Acquisition d&#39;images numériques. <ol><li> Acquérir des images en utilisant un microscope à fluorescence conventionnelle avec DAPI, FITC, et des filtres rouge Texas (ou équivalent). Utilisation d&#39;un objectif de grossissement supérieur (20X ou 40X) pour vérifier que l&#39;étiquette a été un succès et noyaux (intacts ou fragmentées) ont été marquées. Un objectif 10X est suffisante pour la quantification des points lacrymaux TUNEL positif. </li><li> Recueillir des images de la coloration Hoechst, coloration TUNEL, et le signal de autofluorescente que trois canaux en fausses couleurs distinctes combinées en une seule image. Si l&#39;étiquette de fluorophore TUNEL est vert, le signal image autofluorescente dans le filtre rouge, et vice versa. <ol><li> Conservez tous les paramètres d&#39;imagerie équivalent entre les diapositives pour seuil et la quantification ultérieure. Pour chaque filtre, des heures prédéfinies et d&#39;exposition d&#39;enregistrement, le gain et binning (pas binning est le meilleur); ne pas utiliser les réglages d&#39;exposition ou de gain automatique. </li><li> Utilisez essais et erreurs pour trouver exposition et de gain paramètres qui répondra le mieux capturer la gamme de intensités dans toutes les lames colorées. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas pixels saturés dans les images acquises, que cette volonté biais quantification. </li></ol></li><li> Prenez des photos du groupe d&#39;intérêt musculaire entière. Cela peut nécessiter plusieurs images à &quot;cousu&quot; ensemble. </li></ol> Analyse 6. Image <ol><li> Utilisez disponibles dans le commerce des programmes d&#39;analyse d&#39;images pour analyser les images numériques de coloration TUNEL. Analyse utilisant un logiciel commercial est montré ici. Alternativement, le ImageJ du logiciel libre du NIH peut être utilisé pour analyser la coloration TUNEL. </li><li> Colorer une section adjacente à la section de TUNEL-colorées à l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E) et prendre une image numérique à pleine section avec un microscope à fond clair conventionnel. Utilisez cette image H &amp; E en combinaison avec un atlas d&#39;anatomie 5,18,19 pour tracer les structures anatomiques être quantifiés. </li><li> Avec le canal TUNEL éteint, tracer manuellement le contour de la zone à quantifier, en utilisantHoechst et canaux de autofluorescence d&#39;orientation. Convertir la zone tracée dans un masque (un ensemble de pixel sélectionné coordonne à analyser). </li><li> Tournez sur le canal TUNEL. Utilisation de la fonction d&#39;un seuil d&#39;intensité dans le programme d&#39;analyse d&#39;image, réglez le seuil inférieur à exclure tous les signaux d&#39;autofluorescence. </li><li> Appliquer les mêmes paramètres de seuil pour toutes les images dans l&#39;ensemble de l&#39;étude. Convertir sélections seuillées en masques. </li><li> Pour chaque image, mélanger le masque de zone du muscle et le masque TUNEL. Le nouveau masque de combinaison représentera le signal TUNEL dans la zone musculaire tracée seulement. </li><li> Effectuer quantification masque sur le masque de combinaison pour déterminer le nombre d&#39;objets et de la zone du signal TUNEL dans la zone musculaire tracé opposer. Effectuez cette aide de la fonction analyseur de particules dans ImageJ. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une méthode pour détecter et analyser quantitativement dommages à l&#39;ADN associée apoptose dans le muscle squelettique de souris est décrit. La procédure comprend la récolte des tissus, coloration TUNEL, l&#39;acquisition d&#39;image numérique, et l&#39;analyse d&#39;image. Fournitures et des outils histologiques communes sont nécessaires, et un kit spécial commerciale TUNEL est nécessaire. Les grands éléments essentiels de l&#39;équipement nécessaires sont un cryostat, un microscope à épifluorescence avec une capaci...

Désoxynucléotidyl transférase (TdT) dUTP nick Terminal étiquetage final (TUNEL) est le processus d&#39;utilisation de l&#39;enzyme TdT pour fixer dUTP à 3 &#39;extrémités de double et l&#39;ADN simple brin casse 12,23. La méthode TUNEL pour la détection de l&#39;apoptose et dommages à l&#39;ADN a été signalée il ya plus de 20 ans par Gavrieli et al. 1,12,24. Depuis, il a été évalué et optimisé dans les différentes préparations de tissu 7,23,27,40. TUNEL a été utilisée pour étudier la mort cellulaire induite par l&#39;ischémie des neurones et des cardiomyocytes 43,44 6,14,29, excitotoxique mort des cellules neuronales 30,31, et en tant que biomarqueur pour le traitement de l&#39;arthrite 39. Il a également été utilisé en tant que facteur de pronostic et le marqueur de cellules tumorales dans divers cancers humains 2,3,15,32,37,38,42. Des méthodes alternatives existent pour dommages à l&#39;ADN et la détection de la mort cellulaire, mais ils ont des défis techniques et mises en garde. Southern blot peut être utilisée pour QUANTIFdommages à l&#39;ADN dans les lysats y tissus entiers 7,9-11, mais cette méthode ne fournit pas la résolution au niveau cellulaire et est difficile à quantifier. Le dosage comète est une méthode à base de cellules de remplacement qui nécessite l&#39;extraction des noyaux de cellules conservées 4,20,28,36. Bien que le test des comètes fonctionne bien sur des cellules isolées en culture, il est beaucoup plus difficile de préparer des noyaux intacts à partir de tissu musculaire squelettique 8,21. Comme Southern blot, le dosage comète ne fournit pas d&#39;informations de type cellule-spécifique de tout un homogénat du tissu musculaire. Une autre alternative à la méthode TUNEL est immunohistochimie utilisant des anticorps contre l&#39;ADN simple brin 25,33,41 ou contre des protéines qui participent dans les voies dommages à l&#39;ADN d&#39;intervention et de mort cellulaire (par exemple p53, H2AX et caspases) 13,17,22,40. De telles méthodes à base d&#39;anticorps nécessite la caractérisation d&#39;anticorps complète et une excellente spécificité de l&#39;anticorps pour donner un rapport signal à bruit de fond. Même lorsque specific anticorps existent, ils peuvent nécessiter une dénaturation de la protéine cible par des procédures de récupération de l&#39;antigène 34,35. Comme nous le verrons ici, la récupération d&#39;antigène dans les résultats de tissu musculaire dans inacceptablement élevé autofluorescence. Contrairement aux autres méthodes, TUNEL atteint dommages détection de l&#39;ADN avec un signal élevé et faible bruit de fond, une excellente spécificité qui peut être testée avec des contrôles simples positifs et négatifs, une bonne pénétration de tissu qui ne nécessitent pas de récupération d&#39;antigène, et la résolution de niveau cellulaire. En outre, la méthode TUNEL faut environ quatre heures pour terminer, alors que les méthodes alternatives nécessitent généralement incubations nuit. Nous étudions squelettique mort des cellules musculaires dans un modèle murin de l&#39;atrophie musculaire spinale (SMA) 10 qui a été généré par Hsieh-Li et ses collègues 16. Pour quantifier les cellules apoptotiques dans le muscle, nous avons développé une méthode de préparation des tissus, la coloration, et la quantification robuste qui fonctionne à travers skele différenteTal groupes musculaires à différents points de temps de développement chez la souris. Nous utilisons un kit TUNEL d&#39;étiquetage disponible dans le commerce et commercialisés logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Nous avons également utilisé avec succès l&#39;essai TUNEL en combinaison avec coloration immunofluorescente dans la 10 moelle épinière. Les méthodes décrites ici sont utiles pour les enquêteurs qui veulent évaluer la pathologie des tissus, des mécanismes de la maladie, les mécanismes du vieillissement et de développement (pré et post-natal) la mort cellulaire dans le muscle squelettique. La technique TUNEL est particulièrement utile pour l&#39;étude des lésions de l&#39;ADN et la réparation et la mort cellulaire dans des systèmes modèles où seul un sous-ensemble de cellules est affecté résolution au niveau cellulaire et ne est nécessaire. Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement, et basé sur la fluorescence étiquetage TUNEL du muscle squelettique de souris. Il décrit également un procédé de semi-automatisé TUNEL signal de quantification.

<table><tbody><tr><td>4 % Paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>19202</td><td>Pour les procédures décrites ici, une solution à 4 % a été préparée fraîche à partir de poudre. Le paraformaldéhyde de n’importe quel fournisseur peut être utilisé. La solution de formaldéhyde préparée doit être conservée à 4 &deg ; C et ne doit pas être utilisé après sa date de péremption (jusqu’à plusieurs mois). Le paraformaldéhyde est un cancérigène et une toxine par inhalation et par contact avec la peau. Veuillez suivre les précautions spécifiées dans la fiche signalétique lors de la manipulation du paraformaldéhyde.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Utilisé pour la cryoprotection des tissus avant la congélation. Le saccharose de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Composé O.C.T.</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Milieu d’enrobage pour la cryosection.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>Un cryostat Leica CM3050S a été utilisé pour les préparations décrites ici. Tout cryostat capable de couper 10 &mu ; Des sections M peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Diapositives en verre, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Des diapositives de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>La gélatine est utilisée pour favoriser l’adhérence des sections tissulaires aux lames de verre. Pour enduire les lames de verre de gélatine, dissoudre 2,75 g de gélatine et 0,275 g d’alun chromé dans 500 ml d’eau distillée, tiède à 60 °C C, trempez les lames pendant plusieurs secondes et laissez sécher. La gélatine de n’importe quel fournisseur peut être utilisée. Des lames pré-revêtues de gélatine peuvent également être achetées.</td></tr><tr><td>Sulfate de potassium de chrome (III) dodécahydrate (alun de chrome)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>L’alun de chrome est ajouté à une solution de gélatine pour favoriser l’adhérence tissulaire sur les lames de verre. C’est un cancérogène possible et une toxine par inhalation et contact cutané. Veuillez suivre les précautions spécifiées dans la fiche signalétique lors de la manipulation de l’alun chromé.</td></tr><tr><td>Réactif d’adhérence tissulaire Vectabond</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Substrat en option pour une meilleure adhérence tissulaire aux lames de verre ; des lames recouvertes de gélatine peuvent être utilisées à la place.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Un détergent utilisé pour perméabiliser les tissus. Tween20 de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Un détergent utilisé pour perméabiliser les tissus. Triton X100 de n’importe quel fournisseur peut être utilisé.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescéine in situ kit de détection de l’apoptose</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Kit commercial pour le marquage TUNEL basé sur la fluorescence.</td></tr><tr><td>DNase/nucléase</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(inclus avec le kit)</td></tr><tr><td>DNase/nucléase</td><td>tampon Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(inclus avec le kit)</td></tr><tr><td>10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS pour les lavages et les dilutions. Les PBS de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Eau sans DNase</td><td>Qualité Produits biologiques</td><td>351-029-131</td><td>L’eau de n’importe quel fournisseur peut être utilisée.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Colorant nucléaire. Tout colorant nucléaire fluorescent bleu peut être utilisé. En tant que colorant de liaison à l’ADN, Hoechst est un cancérogène suspecté et doit être manipulé avec un équipement de protection pour minimiser le contact avec la peau.</td></tr><tr><td>Parafilm M multiple</td><td></td><td>807</td><td>Tout autre film hydrophobe ou lamelle de recouvrement peut être utilisé. Disponible auprès de plusieurs fournisseurs.</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent avec appareil photo numérique</td><td>&nbsp ;--</td><td>&nbsp ;--</td><td>Tout microscope fluorescent capable de capturer numériquement la fluorescence rouge, verte et bleue dans des canaux séparés peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Les supports anti-fondu Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>peuvent être utilisés auprès de n’importe quel fournisseur.</td></tr><tr><td>lamelles en verre, épaisseur n° 1</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Des lamelles de protection de n’importe quel fournisseur peuvent être utilisées. La plus petite taille de 22 x 22 mm est suffisante pour les sections de pattes de souris néonatales.</td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Utilisé pour sceller les lamelles. Il est possible d’utiliser du vernis à ongles de n’importe quel fournisseur (y compris les détaillants habituels). Évitez d’utiliser du vernis à ongles avec de la couleur ou des additifs qui peuvent refléter la lumière pendant l’imagerie fluorescente.</td></tr></tbody></table>

détection et analyse de l'adn dommages souris muscle squelettique in situ utilisation de la méthode tunel

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

<classe p='jove_content'>Le marquage final de la désoxynucléotidyl transférase (TdT) et de la désoxyuridine triphosphate (dUTP) (TUNEL) est la méthode d’utilisation de l’enzyme TdT pour attacher de manière covalente une forme marquée de dUTP aux extrémités 3' des cassures d’ADN double et simple brin dans les cellules. Il s’agit d’une méthode fiable et utile pour détecter les dommages à l’ADN et la mort cellulaire in situ. Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement et le marquage TUNEL basé sur la fluorescence du muscle squelettique de la souris. Il décrit également une méthode de quantification semi-automatisée du signal TUNEL. Les caractéristiques normales inhérentes des tissus et les conditions de traitement des tissus affectent la capacité de l’enzyme TdT à marquer efficacement l’ADN. Le traitement des tissus peut également ajouter une autofluorescence indésirable qui interférera avec la détection du signal TUNEL. Par conséquent, il est important de déterminer empiriquement les méthodes de traitement des tissus et de marquage TUNEL qui permettront d’obtenir le rapport signal/bruit optimal pour la quantification ultérieure. Le test basé sur la fluorescence décrit ici fournit un moyen d’exclure le signal autofluorescent par soustraction de canal numérique. Le test TUNEL, utilisé avec des techniques et des contrôles appropriés de traitement des tissus, est une méthode quantitative relativement rapide et reproductible pour détecter l’apoptose dans les tissus. Il peut être utilisé pour confirmer les dommages à l’ADN et l’apoptose en tant que mécanismes pathologiques, pour identifier les types de cellules affectées et pour évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques in vivo.

Avec coloration réussie, signal de TUNEL positif doit être assez brillant pour isoler autofluorescence en fixant des seuils d'intensité. Objets TUNEL-positives à faible grossissement peuvent apparaître fragments irréguliers brillants dans le muscle squelettique (Figure 1A). Toutefois, à plus fort grossissement, certains objets TUNEL positif avec la morphologie apoptotique classique doivent être respectées, si le type de mort cellulaire impliquée est l'apoptose (figure 1B). Le contrôle p...

Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement et le marquage TUNEL par fluorescence du muscle squelettique de la souris. Il décrit également une méthode d’analyse semi-automatisée de l’étiquetage TUNEL.

Détection et analyse de l'ADN dommages souris muscle squelettique In Situ Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

L’objectif global de cette procédure est de détecter les cassures de l’ADN et la mort cellulaire dans C deux. Ceci est accompli par des coupes de tissu au premier perme pour permettre aux réactifs tunnel de pénétrer dans le noyau cellulaire. Ensuite, l’enzyme TDT est utilisée pour attacher de manière covalente les DTP à trois extrémités premières des cassures de l’ADN dans ces cellules.Ensuite, le DUTP est marqué à l’aide d’une sonde fluorescente. En fin de compte, le signal positif tunnel est quantifié dans des coupes de tissus reflétant la fréquence relative des cassures de l’ADN dans les cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le transfert de Southern ou l’immunohistochimie, est qu’elle est relativement rapide et qu’elle permet d’éliminer le bruit et l’autofluorescence.Commencez par fixer les membres postérieurs isolés dans 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS dans un tube de 15 millilitres pour permettre la fixation pendant quatre à au maximum 24 heures à quatre degrés Celsius. Seulement deux heures sont nécessaires si le tissu est embryonnaire. Cependant, après la fixation, remplacez la solution par 10 % de saccharose pour cryoprotéger le tissu et l’incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, changez la solution pour du saccharose stérile filtré à 30 % et continuez l’incubation pendant la nuit ou jusqu’à ce que les membres postérieurs coulent au fond du tube. Lors de l’encastrement, il est important que les membres postérieurs soient complètement immergés dans le milieu d’encastrement. Les moules d’enrobage peuvent être placés directement sur de la glace carbonique ou en isop pentane sur de la glace carbonique pour congeler le support.Lors de la cryosection. Les blocs coupent des sections de transfert de 10 microns d’épaisseur ou plus fines, les sections plus épaisses ne seront pas pénétrées par les réactifs de marquage en tunnel. Collectez ces sections minces sur des lames de verre à revêtement de gélatine ou de liaison vectorielle à température ambiante.Très rapidement, transférez les lames sur de la glace sèche pour les ranger. Décongelez d’abord une lame de section de tissu congelé à température ambiante et laissez-la sécher pendant 16 à 64 heures. Une fois la lame à température ambiante, réhydratez la section dans un bocal d’accouplement rempli de PBS pendant 10 minutes.Répétez cette étape de réhydratation une fois, puis séchez soigneusement la lame avec une lingette de laboratoire sans perturber la section de tissu pour perméer la section, placez la lame dans une chambre d’humidité et pipetez 50 microlitres de réactifs commerciaux à base de saponine non protéolytique sur la section. Ne pipetez pas directement sur les sections car elles pourraient se détacher ou être endommagées. Placez ensuite un petit morceau de film para sur la section pour étaler le réactif.Si des bulles se forment, réappliquez le film para. Laissez la diapositive incuber pendant une heure après une heure. Retirez les réactifs à l’aide de deux lavages de cinq minutes dans du PBS et séchez-le soigneusement.À côté de l’étiquette des cassures d’ADN par TDT, utilisez un kit disponible dans le commerce. Tout d’abord, créez le tampon XTDT et pipetez sur la section. Ensuite, incubez la lame pendant cinq minutes dans la chambre d’humidification.Deuxièmement, préparez un mélange d’étiquetage TDT selon les instructions du kit ou une diapositive de contrôle positif. Ajoutez de l’ADN au mélange d’étiquetage TDT. Pour une lame de contrôle négative, omettez l’enzyme TDT du mélange.Maintenant, à l’aide d’une lingette, retirez autant de tampon que possible de la lame et pipetez-la sur le mélange d’étiquetage. 50 microlitres devraient suffire. Encore une fois, étalez la solution avec du paraform sans faire de bulles.Laissez la lame incuber dans la chambre pendant une heure maintenant à 37 degrés Celsius. Troisièmement, faites le tampon un x stop selon les instructions du kit. Après avoir retiré le mélange d’étiquetage avec la lingette de laboratoire, ajoutez entre deux et 300 microlitres de mélange stop pour couvrir complètement la section.Ensuite, incubez la lame pendant cinq minutes dans la chambre. Aucun film para n’est utilisé dans cette étape. Pour retirer le tampon d’arrêt, utilisez deux lavages de deux minutes dans PBS.Maintenant, pipetez 50 microlitres de solution d’étiquetage à la fluorescéine fraîchement préparée. Sur la lame, appliquez du perfil et incubez pendant 20 minutes dans la chambre, mais maintenant dans l’obscurité. Retirez la solution d’étiquetage en un seul lavage de deux minutes dans du PBS pendant le lavage, diluez quelques crochets.3, 3, 3, 2, 5, 8 à un microgramme par millilitre en PBS. Après les lavages, couvrez les sections dans un à 200 microlitres de la solution de crochets diluée. Ensuite, incubez la lame pendant cinq minutes, à l’abri de la lumière pour retirer les crochets à tacher, utilisez trois lavages de cinq minutes en PBS.Ensuite, séchez soigneusement la lame avec une lingette de laboratoire et appliquez une lamelle pour l’imagerie. Imagez la section à l’aide de filtres dpi, fitzy et Texas red pour séparer les signaux de coloration des crochets, de coloration tunnel et d’autofluorescence en trois canaux de fausses couleurs en une seule image. Normalisez et conservez les mêmes paramètres d’imagerie entre toutes les lames afin qu’elles puissent être facilement comparées.N’utilisez pas de paramètres d’exposition ou de gain automatiques pour la référence anatomique. Utilisez une image en fond clair d’une section adjacente d’un membre postérieur colorée par h et e dans le logiciel d’analyse d’image. Fermez le canal du tunnel.Tracez ensuite manuellement le contour de la zone musculaire à quantifier à l’aide des autres canaux. Convertissez la zone tracée en masque. Ensuite, rallumez le canal du tunnel et ajustez le seuil d’intensité minimum pour exclure le signal autofluorescent.Utilisez la même limite de seuil sur toutes les sections analysées dans l’étude. Ensuite, convertissez les pixels de seuil en masque. Dans chaque image, combinez le masque de zone musculaire et le masque tunnel de seuil.Cela fait une représentation du signal du tunnel dans la zone musculaire tracée. Quantifiez maintenant le masque combiné pour déterminer le nombre d’objets positifs en tunnel et la surface totale des pixels du signal tunnel dans le muscle. Utilisez ces valeurs pour l’analyse statistique.Les objets positifs en tunnel à faible grossissement peuvent apparaître comme des fragments irréguliers brillants dans le muscle squelettique. Cependant, à un grossissement plus élevé, certains objets positifs en tunnel avec la morphologie apoptotique classique devraient être observés si le type de mort cellulaire impliquait cette apoptose. Le témoin positif avec des ADNs D ajoutés doit présenter un signal positif tunnel abondant et distribué uniformément dans tous les tissus.Dans la section. Le témoin négatif sans enzyme TDT doit avoir un bruit de fond de faible intensité et ne montrer qu’une autofluorescence. Avec le protocole décrit, il a été constaté que les globules rouges osseux et les cellules endothéliales contribuaient au signal autofluorescent dans les sections préparées des membres supérieurs.Le signal positif du véritable tunnel était beaucoup plus intense. Il pourrait être isolé du signal autofluorescent à l’aide d’un seuil d’intensité de pixel. Une autre option pour isoler le signal tunnel consistait à soustraire numériquement le canal d’autofluorescence rouge du canal tunnel.En utilisant cette technique, la mort des cellules musculaires squelettiques. Dans un modèle murin d’AS a été évalué, le marquage tunnel a révélé plus de cellules apoptotiques chez les souris AS âgées de cinq jours que chez les témoins. En quantifiant la coloration en tunnel, cette observation s’est avérée statistiquement significative pour plusieurs groupes musculaires du membre postérieur.Une fois maîtrisée, la technique du tunnel peut être réalisée en quatre heures environ pour générer des résultats quantitatifs fiables.

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Décrites ici sont des protocoles utilisés pour visualiser le processus dynamique de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire chez les animaux entiers et au niveau cellulaire. Ces méthodes peuvent être appliquées pour étudier la biologie cellulaire de refermeture membrane plasmique et la médecine régénérative.

Visualisation de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire utilisant In vivo Et In vitro Systèmes

Dans cette vidéo, le test TUNEL est effectué pour détecter la présence de cellules apoptotiques dans un échantillon. L'étude consiste à utiliser une ADN polymérase spéciale - la désoxynucléotidyl transférase terminale - qui catalyse l'ajout de dUTP marqués à l'extrémité 3' de l'ADN fragmenté, qui peut être observé et identifié au microscope à fluorescence.

Marquage dUTP Nick médié par la transférase terminale - Essai TUNEL : une méthode in situ pour détecter la fragmentation de l’ADN dans les cellules apoptotiques

L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l'enrichissement de l'ARN pour la mesure de l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 - 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

Cryosectioning de contigües Les régions d&#39;un muscle squelettique de souris unique pour l&#39;expression génique et analyses histologiques

Nous présentons ici un protocole détaillé pour détecter toutes deux de sénescence des cellules souches pluripotentes dans le muscle squelettique sur blessure tout en induisant en vivo reprogrammation. Cette méthode convient pour évaluer le rôle de la sénescence cellulaire au cours de la régénération tissulaire et reprogrammation in vivo.

Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

Décrit ici est un protocole pour l'immunoétiquetage direct des myofibres nécrotiques dans les cryosections de muscle. Les cellules nécrotiques sont perméables aux protéines sériques, y compris l'immunoglobuline G (IgG). Révéler l'apport d'IgG par les myofibres permet l'identification et la quantification des myofibres qui subissent une nécrose indépendamment de l'état musculaire.

Immunolabelling Myofiber Dégénérescence dans les biopsies musculaires

Ici, nous proposons une méthode pour obtenir efficacement des fibres musculaires simples aux premiers stades post-natals du développement de l’homozygote mutant Lamin Δ8-11 modèle de souris, un modèle très sévère pour Emery-Dreifuss dystrophie musculaire (EDMD).

Isolement et culture myofiber uniques à partir d’un modèle murin de la dystrophie musculaire Emery-Dreifuss dans le développement post-natal précoce

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique est une méthode viable pour moduler l’expression des gènes sans compromettre la contractilité musculaire chez la souris.

Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

Le maintien de l’intégrité du génome de l’ovocyte est nécessaire pour assurer la fidélité génétique de l’embryon résultant. Nous présentons ici un protocole précis pour détecter les cassures double brin de l’ADN dans les cellules germinales femelles de mammifères.

Détection de cassures double brin de l’ADN dans des ovocytes de souris

Le protocole présenté ici permet l’identification et l’analyse de haute dimension des cellules souches musculaires et progénitrices par cytométrie de masse unicellulaire et leur purification par FACS pour des études approfondies de leur fonction. Cette approche peut être appliquée pour étudier la dynamique de régénération dans des modèles de maladies et tester l’efficacité d’interventions pharmacologiques.

Identification et analyse de progéniteurs myogéniques in vivo au cours d’une lésion aiguë des muscles squelettiques par cytométrie de masse unicellulaire de grande dimension

Injections locales d’une cellule de Schwann terminale marquante mitochondriale in vivo pour microscopie confocale. Cette méthode utilise des preuves de concept démontrées dans le tissu musculaire squelettique de souris avec un muscle sain ou malade pour fournir une visualisation mitochondriale à haute résolution.

Méthodes pour la quantification in situ de la morphologie mitochondriale dans les cellules musculaires et terminales de Schwann de souris

Découvrez la détection des cassures d'ADN et de la mort cellulaire dans le muscle squelettique de souris par marquage TUNEL. Cette méthode rapide et spécifique permet une analyse semi-automatisée quantitative.

Détection et analyse de l'ADN dommages souris muscle squelettique In Situ Utilisation de la méthode TUNEL

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