Name: 评价的人卵巢癌细胞干细胞特性使用多和单细胞为基础的化验球 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习使用单细胞和多细胞球体形成实验评估人卵巢癌细胞干细胞特性。该方法通过SOX2报告基因筛选和荧光标记分离，准确计算肿瘤干细胞比例，为癌症干细胞研究提供可靠技术方案。

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本研究得到了巴登-符腾堡基金会（成体干细胞计划II）向C.L.提供的资助支持。我们感谢Martina Konantz博士对本文提出的宝贵意见和审阅。我们感谢巴塞尔大学医院DBM FACS设施的Emmanuel Traunecker和Toni Krebs在FACS分选方面的协助。

1. 利用含有SOX2调控区报告构建体的慢病毒稳定转导OVCAR-3人卵巢癌细胞系的建立
<ol>
	<li>通过将携带报告基因构建体的 HEK 293T 包装细胞系进行转染，以产生慢病毒颗粒，该报告基因构建体可识别 SOX2 调控区域，具体方法如文献10,21所述。 
	注意：该报告基因构建体还在 tdTomato 荧光蛋白前包含 ProteoTuner Shield 系统的降解结构域。Shield1 可结合该降解结构域，从而阻止蛋白酶体降解荧光蛋白22。</li>
	<li>用慢病毒颗粒转导 OVCAR-3 细胞，持续 24 小时。之后，移除病毒上清液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后在完全培养基（RPMI 添加 10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素）中培养。</li>
	<li>48 小时后，向培养物中加入 10 μg/ml 嘌呤霉素，并持续维持 5 天，以筛选成功转导的细胞。</li>
</ol>
2. 细胞分选与铺板的准备
<ol>
	<li>在细胞分选前24小时，以1:1,000稀释度加入Shield1。使用未用Shield1处理的稳定转导OVCAR-3细胞作为阴性对照（图1）。吸去培养瓶中的培养基，用1×PBS洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化3分钟。</li>
	<li>用完全培养基（见上文）终止胰酶消化，计数细胞数量，在室温（15–25 °C）下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，小心地将细胞重悬于0.5–1 mL无菌PBS中。</li>
	<li>使用带40 µm滤膜的细胞筛滤器获得单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞浓度调整至每毫升500万个细胞。</li>
	<li>准备超低吸附96孔板，每孔加入100 μL成球培养基（MEGM添加生长因子、细胞因子及补充物、B-27、肝素钠；或DMEM/F12添加生长因子、细胞因子及补充物、B-27、肝素钠，可选是否额外添加1%甲基纤维素，详见表1）。可选：在培养基中加入终浓度为100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的抗生素，以降低潜在污染风险。</li>
	<li>将RFP+和RFP-细胞分别分选至上述准备好的96孔板中，每孔1个细胞（单细胞成球实验）或每孔100个细胞（多细胞成球实验）。使用商用细胞分选仪（见材料）进行分选，设置为单细胞模式：100 μm喷嘴，鞘液压力20 psi，得率掩码0，纯度掩码32，相位掩码16。</li>
	<li>通过显微镜观察含细胞的孔数（单细胞成球实验）或计数各孔中的细胞数（多细胞成球实验）来评估接种效率（图2）。</li>
	<li>将细胞在成球培养基中（成分见步骤2.6）于37 °C、5% CO2条件下培养。每天补充bFGF（20 ng/mL）和EGF（20 ng/mL）。</li>
	<li>一周后，使用标准显微镜（4×或10×放大倍数）和荧光显微镜检测整合报告系统发出的荧光信号，计数形成的肿瘤球数量。将直径超过100 μm的记为“大球体”，直径在50–100 μm之间的记为“小球体”（图3）。注意区分真正的球体与细胞团簇。 
	注意：在单细胞成球实验中，培养10天（而非7天）后更易于通过显微镜进行准确评分。</li>
	<li>根据Shaw 等16所述方法，计算单细胞成球实验（每次独立实验使用一个96孔板）或多细胞成球实验（每次独立实验使用一个孔）中RFP+和RFP-细胞的成球细胞比例。 
	注意：成球细胞比例（%）=（球体数量）/（接种细胞数量）× 100</li>
</ol>
3. 类球体的连续传代
<ol>
	<li>将每个孔中的内容物转移至适当的无菌离心管中，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。对于多细胞来源的类球体实验，收集一个孔中的所有类球体，用 PBS 洗涤 3–5 次，每次离心时间延长 2 分钟。对于单细胞来源的类球体实验，需分别收集单个类球体。由于细胞数量较少，离心和洗涤步骤应使用 1.5 ml 离心管。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 200 µl 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中。</li>
	<li>为实现最佳的细胞分离效果，将细胞悬液在 37 °C 条件下于轻柔摇床上孵育 5 分钟。根据所用细胞系优化胰蛋白酶消化时间，以降低细胞死亡率：若无明显的大类球体存在，可使用 100 μl 移液枪头轻轻吹打。若仍存在较大类球体，则继续孵育胰蛋白酶 3 分钟后再进行吹打操作。对于单细胞来源的实验，需优化胰蛋白酶消化时间，以在消化步骤中获得最佳的活细胞得率。</li>
	<li>加入 500 µl 完全培养基以终止胰蛋白酶活性，并在 300 × g 条件下离心 10 分钟；对于单细胞实验，额外延长离心时间 2 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，小心地将细胞沉淀重悬于类球体培养基中。</li>
	<li>使用带有 40 µm 细胞滤网帽的滤器，获得单细胞悬液。</li>
	<li>若在多细胞来源的实验中使用 RFP+ 和 RFP- 细胞，在重悬后通过流式细胞术分析各孔中荧光阳性细胞的比例。</li>
	<li>对于单细胞的连续传代实验，将 1 个细胞接种至一个新制备的超低吸附 96 孔板的每个孔中（制备方法如上所述）。从单个类球体出发，大约接种 20 个独立孔。对于多细胞来源的初级类球体的传代实验，将一个孔初级类球体获得的细胞接种至新的 96 孔板中，并于次日通过显微镜计数细胞数量。</li>
	<li>使用 步骤 2.11 中所述公式评估次级类球体实验中成球细胞的比例。</li>
</ol>
4. 结果分析
<ol>
	<li>对独立重复三次的实验结果进行分析，对于正态分布的数据采用双侧 Student t 检验进行统计分析，非正态分布数据则使用 Mann-Whitney 检验。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

类球体培养是一种广泛使用的方法，用于检测多种人类肿瘤细胞中肿瘤干细胞的潜能，并富集具有干细胞样特性的细胞15,25,26。在此类培养条件下，缺乏自我更新能力的癌细胞会分化并最终发生细胞死亡。尽管它们在初期可能形成细胞簇，甚至在初次检测中形成肿瘤球体，但由于不具备自我更新能力，在连续传代培养后无法维持成球能力。因此，类球体形成实验被用作替代性检测手段，以鉴定肿瘤干细胞（CSCs）并评估其在整个肿瘤细胞群体中的频率。
然而，遵循不同已发表方案进行的成球实验之间可观察到显著的变异性5,10,27-35（表1）。在本实验室，我们此前曾报道使用添加了B-27、bFGF、肝素和SingleQuotTM（含胰岛素、rEGF和氢化可的松）的MEGM培养基培养人卵巢癌细胞形成细胞球。其他实验室则使用完整的DMEM/F12培养基，而有些仅添加B-27和rEGF。因此在本研究中，OVCAR-3细胞的多细胞成球实验在不同条件下进行。在MEGM或DMEM/F12培养基中添加全部补充成分时，这些细胞的成球能力未...

越来越多的证据表明，卵巢癌由多种不同类型的细胞混合而成，并含有所谓的“癌症干细胞”（CSCs），这些细胞负责疾病的发生、维持以及在传统细胞毒性治疗后的复发1-3。因此，开发靶向卵巢癌干细胞的分子策略是一个重要的目标，有望改善卵巢癌患者的治疗效果。
要理解肿瘤干细胞（CSCs）的分子特征，前提是能够从非肿瘤干细胞中可靠地分离出CSCs。然而，卵巢肿瘤干细胞的鉴定仍具有挑战性。尽管已有研究报道CD133的表达和醛脱氢酶（ALDH）活性4,5可作为标记卵巢肿瘤干细胞的指标，但部分数据表明这些标记物具有不稳定性6。与此一致的是，在卵巢癌中，与例如乳腺癌7不同，ALDH1的表达与较好的临床预后相关8，而被认为具有干细胞标记作用的CD44变异体的表达则无预测预后的价值9。最近，我们已证实胚胎干细胞蛋白SOX2的表达可赋予卵巢癌细胞干性特征10，且高水平的SOX2表达与临床上侵袭性强的卵巢癌和乳腺癌相关11,12。因此，在本报告中，我们采用一种含有红色荧光蛋白（RFP）的慢病毒报告系统，其表达由SOX2调控区控制，以此作为分离潜在卵巢肿瘤干细胞的方法。
根据定义，肿瘤干细胞（CSCs）既能自我更新，又能分化产生所有类型的肿瘤细胞。假定的CSC群体需要通过功能实验进行分析，以验证其特性。 体内出于显而易见的原因，在人类细胞中，此类功能检测仅限于异种移植实验，主要包括将人类肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠体内10,13.
一种替代方法 体外 该方法由Brent Reynolds和Sam Weiss提供，他们首次报道了所谓的神经球实验，作为一种评估神经细胞干性潜能的替代实验。14Dontu 及其同事随后证实了该检测方法可用于评估乳腺细胞的干细胞潜能15,16将不同数量的人类乳腺细胞接种于添加表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、B-27 和肝素的无血清培养基中，在非黏附条件下培养 7 至 10 天，随后通过显微镜观察评估细胞成球情况。在此方案基础上，多个研究团队通过调整细胞数量、培养基成分及补充因子，对此进行了进一步探索 体外 多种癌症类型的干细胞潜能，例如乳腺癌17, 脑18胰腺19 和结肠20 肿瘤。在卵巢癌中，我们近期报道了球体形成实验的可行性，并将其结果与所收集的数据进行了比较 体内 小鼠异种移植模型10我们发现，干细胞蛋白 SOX2 的过表达增强了两者 体外 成球形成以及 体内 人卵巢癌细胞的致瘤性10然而，成球细胞的频率高于所测得的肿瘤起始细胞频率 体内10 表明球体实验可能因技术原因导致假阳性结果，或者另一种可能是 体内 检测可能效率低下，并导致假阴性结果。
在本报告中，我们更详细地分析了基于多细胞的卵巢球体实验，回顾了文献中现有的不同实验方案，并将其与基于单细胞的实验进行比较。结果表明，与基于多细胞的实验相比，基于单细胞的实验能够提供更准确且可重复的结果；而多细胞实验的结果极易受到接种细胞密度的影响，除非在培养体系中添加甲基纤维素以固定细胞。然而，即使在基于单细胞的实验中， 体外 成球潜能的出现频率更高 体内 肿瘤起始潜能

<table><tbody><tr><td>低吸附培养板</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&amp;trade; 试剂盒</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&amp;trade; 试剂盒</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&amp;trade; 试剂盒</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>终浓度：20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>终浓度：20 ng/mL</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>17504-044</td><td>终浓度：1X</td></tr><tr><td>肝素钠-25000 IU</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>稀释比例：1:1,000</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td>632189</td><td>稀释比例：1:1,000</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12（粉末）</td><td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>Applichem</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>细胞分选仪</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III 细胞分选仪</td></tr><tr><td>FACS 分析仪</td><td>BD</td><td></td><td>Accuri c6 流式细胞仪</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

利用多细胞和单细胞成球实验评估人卵巢癌细胞中的干细胞特性

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

多年研究表明，卵巢癌包含多种异质性细胞，其中存在一个被称为“癌症干细胞”（CSCs）的亚群，该亚群负责肿瘤的起始、维持以及在常规化疗后复发。因此，鉴定卵巢癌干细胞具有重要意义。一种常用于评估CSC潜能的方法 体外 是一种球体形成实验，即将细胞接种于无血清培养基中，在非黏附性培养条件下并添加生长因子，数天后对球体形成情况进行评分。本文综述了目前可用于人卵巢癌球体实验的方案，并对常用的多细胞接种实验方法与基于单细胞接种的更精确系统进行了并列分析。结果表明，多细胞接种和单细胞接种的球体形成实验均可用于研究球体形成能力 体外基于单细胞的检测方法虽然更为耗时且成本较高，但更适合对单个细胞的功能进行评估，整体结果也更为准确；而基于多细胞的检测方法则易受铺板细胞密度的影响，且需要预先进行滴定实验。在基于多细胞的检测中添加甲基纤维素可有效减少机械干扰因素。

在传统的成球实验中，RFP+ OVCAR-3细胞在初次成球实验中形成单个肿瘤球的比例约为40%，而RFP-细胞的比例为20%（图4A）。此外，RFP+细胞形成的球体体积大于RFP-细胞形成的球体。
在单细胞为基础的实验中，RFP+细胞形成的球体也多于RFP-细胞，证实了上述结果。然而，与多细胞为基础的实验相比，单细胞实验中每个接种细胞形成的球体数量有减少的趋势（图4A,B），表明在此实验中，球体形成可能受到技术性假象的影响，例如在非黏附培养基中发生机械性球体融合或解离。
为了进一步探讨这些方面，我们比较了细胞接种密度对成球形成的影响。我们采用有限稀释法，将细胞以每孔1,000个至1个的密度接种于96孔板中，发现形成的球体数量高度依赖于初始接种的细胞数量。令人意外的是，在MGEM和基于DMEM/F12的培养基中，接种细胞数量越少，形成的球体数量反而越多，表明接种方式确实会显著影响本实验的结果（图5）。相比之下，当在基于DMEM/...

体外成球实验常用于鉴定肿瘤干细胞。本文比较了基于单细胞与多细胞的成球实验方法。基于单细胞的实验方法或添加甲基纤维素的方法虽然更为耗时，但结果更为准确；而在液体培养基中进行的基于多细胞的成球实验则可能受到细胞密度的显著影响。

多年的研究表明，卵巢癌包含多种异质性细胞，其中包括一类所谓的“癌症干细胞”亚群。

本实验的总体目标是利用多细胞和单细胞成球实验，评估人卵巢癌细胞的干细胞特性。首先，通过嘌呤霉素处理，筛选出携带SOX2报告基因RFP慢病毒的转导细胞；第二步，分离RFP阳性与RFP阴性细胞，并以每孔单细胞或多细胞的形式进行分选接种。随后，在显微镜下观察初次成球情况，接着将初次形成的球状结构解离后重新接种，以分析二次成球能力。最终，这些成球实验可用于计算具有成球能力的卵巢癌干细胞亚群的比例。该方法有助于回答肿瘤干细胞研究领域中的关键问题，例如哪些可能是潜在的肿瘤干细胞群体，以及它们在整体肿瘤组织中的出现频率。尽管该方法可为卵巢癌干细胞的鉴定提供依据，也可用于分离其他实体瘤（如乳腺癌）中的肿瘤干细胞。用慢病毒颗粒转导人卵巢癌细胞24小时后，移除病毒上清液，并用PBS培养液洗涤细胞。将细胞置于完全培养基中培养48小时。然后更换培养基，并在第五天加入浓度为10微克/毫升的嘌呤霉素。第二天用防护剂以1:1000的稀释度处理培养物。用PBS洗涤细胞，然后用0.05%胰蛋白酶EDTA消化细胞使其脱离。孵育3分钟后，加入完全培养基终止反应。计数细胞，并在室温下以300 × g离心5分钟。将细胞小心重悬于0.5至1毫升无菌PBS中，然后通过40 µm滤器过滤细胞悬液。将细胞调整至5 × 10⁶ 个细胞/毫升的浓度，随后在超低吸附96孔板的每个孔中加入100 µL成球培养基，用于单细胞成球实验。使用单细胞模式将单个细胞分选至培养板的每个孔中。随后在显微镜下对细胞进行计数，以评估铺板效率。将细胞在新鲜的成球培养基中孵育，条件为37摄氏度、5% CO2，并每天补充基础成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。一周后，通过光学显微镜确定新生肿瘤球的数量，并通过荧光显微镜检测整合报告系统产生的荧光信号。将直径超过 100 微米的肿瘤球计为大球，将直径在 50 至 100 微米之间的肿瘤球计为小球。计数时需注意区分真实的肿瘤球与细胞团簇。然后根据公式计算成球的RFP阳性或RFP阴性细胞的比例，并进行传代。开始成球时，将每个孔中的内容物转移至各自的1.5毫升微量离心管中。随后用PBS洗涤每个孔三到五次，以确保收集所有细胞球，并在300 × g、室温条件下离心10分钟，使细胞沉淀。离心后，弃去上清液，将沉淀物在 37 摄氏度下用 200 微升含 0.05% 胰蛋白酶和 EDTA 的溶液在温和摇床上重悬 5 分钟。若 5 分钟后未见明显的大细胞球，则用 100 微升移液器枪头轻轻吹打细胞悬液，并加入 500 微升完全培养基以中和胰蛋白酶活性。离心细胞，小心地将沉淀物重悬于成球培养基中，并将所得细胞悬液通过 40 微米滤膜过滤，如前所述。最后，对于单细胞的连续传代培养，将一个原代细胞球中的单细胞以每孔100微升细胞球培养基的体积，接种至新的超低吸附96孔板中。然后使用与原代细胞球实验相同的公式，评估继代细胞球中形成细胞球的细胞比例。在基于多细胞的细胞球实验中，约40%的RFP阳性人卵巢癌细胞在原代细胞球实验中能够形成单个肿瘤细胞球，而RFP阴性细胞仅占20%。令人意外的是，在基于 MGEM 和 D-M-E-M-F 12 的培养基中，接种较少数量的细胞反而计数到更多的类球体，表明接种方式对该实验结果具有显著偏差。相比之下，当通过添加 1% 甲基纤维素使细胞固定后，多细胞类球体培养中类球体形成效率在很大程度上不受细胞密度的影响。约 35% 来自 RFP 阳性类球体的细胞在培养七天后失去红色荧光信号，提示这些细胞已发生分化；而超过 65% 的细胞仍保留 RFP 信号，提示其具有自我更新能力。相比之下，由初始RFP阴性细胞形成的细胞球中的细胞仍保持RFP阴性，表明在这些条件下它们无法重新获得干细胞潜能。对由单个细胞生成的细胞球进行荧光显微镜观察，进一步证实了这些结果，显示来自RFP阳性细胞的单个细胞球中同时包含RFP阳性与RFP阴性细胞；而来自RFP阴性细胞的细胞球则在该操作后仍保持无红色信号。还可以通过定量 PCR 进行抗体、染色或基因表达分析等其他检测，以进一步表征具有强成球能力的细胞。在进行该实验操作时，需要注意的是，必须在免疫缺陷小鼠体内进行体内移植实验，以验证成球起始细胞的肿瘤干细胞特性。

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