Name: Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Öğrenin, farelerde solunum yolu hastalıklarını çalışmak için entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma yöntemini. Bu invaziv olmayan teknik, bakteri ve terapötik ajanların akciğerlere doğrudan, tekrarlanabilir ve hassas dağıtımını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Öngörüsel Tıp Hayvan Modelleri Merkezi (Carol Vanover, Ashley Biller ve Jennifer Kraenzle) ve Mikrobiyoloji (Daniel Cramer ve Julie Sotsky) Temel Tesisleri'nin desteği için minnettardır. Bu çalışma, NIH'den (HHSN272201000033I'den MBL ve JMYW'ye) sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

Not Burada açıklanan tüm işlemler gözden ve Louisville Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (protokol # 13-056) ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokol # 13-064) Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Boya hazırlanması 1. <ol><li> % 0.1 seyreltin (ağırlık / hacim) PBS içinde Coomassie Parlak Mavi ve 0.45 uM şırınga filtresi kullanılarak filtre ile sterilize. </li></ol> Pseudomonas aeruginosa Kültür 2. Hazırlık <ol><li> İlaçların uygulanmasından önce 15 saat, tek bir bakteri kolonisi ile sıvı kültürü içinde 3 ml inoküle. </li><li> Bir karıştırıcıda (200 rpm) ile 37 ° C&#39;de, kültür 15 saat büyütün. </li><li> Santrifüj 30 saniye için bir 1.5 ml mikrofüj tüpü 12.000 x g, kültürün 1 mi. </li><li> Ortamı çıkarın ve PBS içinde 1 ml pelletini. </li><li> PBS içinde bakteriyel stok süspansiyonu 01:10 bir kısım seyreltin ve belirlemek için seyreltilmiş bakteri süspansiyonu OD 600 ölçmekbakteri konsantrasyonu. </li><li> IMIT aşılama için 50 ul bir dağıtım hacmi kullanılarak bakteriyel inokulum istenen konsantrasyona getirilebilmesi için PBS içinde Bakteriyel stok süspansiyonu seyreltin. </li></ol> 3. IMIT damlatma <ol><li> Izofluran anestezi indüksiyon odasına farelerin bir grup yerleştirin ve 2 kullanarak uyutmak -% 3 izofluran / oksijen karışımı. </li><li> Sedasyon ilk başlangıcında, dik fareyi tutan, fare ense ve boğaz arkasına sonda iğne ile% 2 lidokain solüsyonu 10 ul yönetmek ve çözüm aşağı epiglot için süzülmesini bekleyin. Anestezi odasına fare dönün. <ol><li> Lokal anestezik olarak tam etkisini almaya lidokain izin vermek 5 dakika en az izin. </li></ol></li><li> Fareler sedasyon istenen seviyeye geldikten (60 bpm ~ oranı nefes), sedasyon korumak için% 2 izofluran azaltır. </li><li> 250 ul gaz geçirmez içine Önyükle&#39;nin boya veya bakteriyel aşı22 G, uzun künt iğne ile hassas şırınga uygun. <ol><li> İlk şırınga Teflon piston tarafından ölçülen havanın 150 ul kadar çizin. Daha sonra, şırınga gövdesi üzerindeki 200 ul işaretine 150 ul işaretinden Teflon® pistonu ilerletilmesiyle aşı 50 ul belirlemektedir. NOT: Örnek entübe fare içine çıktığında, 50 ul süspansiyon akciğerlerde inokülumu dağıtacak 150 ul hava yastığı ile, ilk teslim takip edilecektir. </li></ol></li><li> Indüksiyon odasından bir fareyi çıkarın ve entübasyon platformda sırtüstü yatıyordu. Velcro şerit bağlı bir O-ring ile kesicilerin çengel ve platforma Velcro sabitleyerek platforma fareyi sabitleyin. 45 ° eğim için fareyi kaldırın. </li><li> Bir mikro pamuk aplikatör kullanarak, Dominant eli kullanarak, bir dönme hareketi ile dilini çekin. </li><li> Nondominant yandan, her iki ma bir entübasyon spekülümleriyle bir faaliyet otoskop uyum kullanındil çekilmesini intain ve glottis görselleştirmek. </li><li> Baskın elinizle, (kateter maruz kateter 10 mm silikon kovanı ile uyum) fare trakea içine 10 mm derinliğe kadar kateteri oturma, fareyi entübe 20 G kateter aracılığıyla dişli bir kılavuz tel kullanın. Otoskop / speculum çıkarın. </li><li> Fare doğru kısaca renkli bir boya içeren 1/16 &quot;açık bir boru Luer bağlı uzunluğu takarken dominant olmayan elle kateter güvence entübe edildiğini onaylayın. NOT: boya hızla nefes cevaben ileri geri göç edecek. </li><li> Entübasyon onay Bu noktada kurulmuş değil eğer sonraki adımlara devam etmeyin. Entübasyon başarısız teşebbüs ederse, entübasyon bir ek girişimi için kateter ve kılavuz tel sıfırlayın. NOT: Bu fare travma olmaksızın tek oturumda fare ikiden fazla entübasyon girişimi önerilemez olduğunu. </li><li> Devamsıvı süspansiyon / hava yastığı içeren hassas şırınga / Künt iğne takarken dominant olmayan elle kateteri sabitleyin. </li><li> Doğrudan tek bir sıvı hareket akciğer içine, sıvı / hava dağıtın ve hemen fare iğne / kateter çekilir. </li><li> Bir kafes fare dönün ve anestezi kurtarma sağlar. </li></ol> IMT 4. Teslim Karakterizasyonu <ol><li> IMIT uygulamasından sonra, uygun bir zaman sonrası aşılamadan CO 2 havasızlık fare euthanize. </li><li> Bir diseksiyon gemide ötenazi fare Güvenli ve% 70 EtOH bücür şişe kullanarak göğüs ve karın ıslatın. </li><li> Akciğerlerde bir görüntüleme maddesi dağılımının değerlendirilmesi ise, steril bir teknik kullanılarak hayvandan ciğerleri çıkarın ve görüntüleme için uygun olarak akciğerlere görüntüler. NOT:. Akciğerler uygun fiksasyon veya kriyokorunmasında yoluyla ek histolojik boyama teknikleri için hazırlanabilir &lt;/ Li&gt; <li> Enfekte akciğer dokusunun bakteri yükünü değerlendirirken ise, steril tekniği kullanarak hayvandan akciğerleri kaldırmak. Yer akciğerler steril içine 1 oz örnek torba tartılır. Tartın ve numune kabına + akciğer ağırlığı kaydedin. <ol><li> Her bir numune, çanta + dokulara steril 1 x PBS&#39;de 1 ml ilave edilir. Örnek çanta kapatın. </li><li> Örnek çanta + doku üzerinde 25 ml serolojik pipet haddeleme nazik dokuları homojenize. </li><li> (Çalışılan LB veya bakteriyel türe uygun şekilde) agar plakası üzerine, akciğer, steril PBS içinde homojenat levha ve seri dilüsyonları oluşturmak: <ol><li> Daha sonra, agar plakası üzerinde çok kanallı göre, üçlü numuneler plaka çok kanallı pipet ile U tabanlı, 96 oyuklu bir plaka içerisinde altı kat seri seyreltme yapılması. </li></ol></li><li> Gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin agar ve ertesi gün koloni oluşturan birim numaralandırmak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reznik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy%2C+physiology%2C+and+function+of+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract.</a> Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).</li>
<li>Hoyt, R. F. J., Hawkins, J. V., St. Clair, M. B., Kennet, M. B., et al. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoyt%2C+RFJ+%22The+Mouse+in+Biomedical+Research%2C+Volume+2%2C+Second+Edition%3A+Diseases+%28American+College+of+Laboratory+Animal+Medicine%29%22">The Mouse in Biomedical Research, Volume 2, Second Edition: Diseases (American College of Laboratory Animal Medicine)</a>. Fox, J. G. 2, Academic Press. 23-90 (2007).</li>
<li>Visweswaraiah, A., Novotny, L. A., Hjemdahl-Monsen, E. J., Bakaletz, L. O., Thanavala, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+tissue+distribution+of+marker+dye+following+intranasal+delivery+in+mice+and+chinchillas%3A+a+multifactorial+analysis+of+parameters+affecting+nasal+retention%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Tracking the tissue distribution of marker dye following intranasal delivery in mice and chinchillas: a multifactorial analysis of parameters affecting nasal retention.</a> Vaccine. 20, 3209-3220 (2002).</li>
<li>Eyles, J. E., Spiers, I. D., Williamson, E. D., Alpar, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+radioactivity+following+intranasal+administration+of+radioactive+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of radioactivity following intranasal administration of radioactive microspheres.</a> J Pharm Pharmacol. 53, 601-607 (2001).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%2C+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 282, 833-839 (2002).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+murine+intranasal+dosing+efficiency+using+luminescent+Francisella+tularensis%3A+effect+of+instillation+volume+and+form+of+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Lathem, W. W., Crosby, S. D., Miller, V. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+primary+pneumonic+plague%3A+a+mouse+model+of+infection%2C+pathology%2C+and+bacterial+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Progression of primary pneumonic plague: a mouse model of infection, pathology, and bacterial transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17786-17791 (2005).</li>
<li>Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+diagnostic+imaging+to+characterize+altered+respiratory+tract+colonization+by+the+Burkholderia+pseudomallei+capsule+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent diagnostic imaging to characterize altered respiratory tract colonization by the Burkholderia pseudomallei capsule mutant.</a> Front Microbiol. 2, 133(2011).</li>
<li>Gutierrez, M., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+Secretion+System+cluster+3+is+a+critical+virulence+determinant+for+lung-specific+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Submitted%22%5BJournal%5D)">Type 3 Secretion System cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis.</a> Submitted. , (2014).</li>
<li>Fodah, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+Klebsiella+pneumoniae+comparative+genetic+analyses+with+virulence+profiles+in+a+murine+respiratory+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model.</a> PLoS ONE. In revision, (2014).</li>
<li>Soto-Montenegro, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+airway+distribution+of+transnasal+solutions+in+mice+by+PET%2FCT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging.</a> Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

IMIT İnstilasyon tekrarlanabilir akciğere doğrudan reaktifleri aşılamak için yeteneği var olan solunum hastalığı modellerinde yönelik önemli geliştirmeler sunuyor. Bu IMIT tekniği gerçekleştirir ideal anestezi ve caging lojistik yöneten biri iki araştırmacı, bir takım için ideal bir hızlı yaklaşım ve diğeri. Fare başına 3 dakika - Büyük çalışmaları 2 ortalama süresi taahhüdü ile IMIT kullanılarak yapılabilir. Yaklaşım bir anestezik olarak izofluran kullanımını kolaylaştırır, çünkü, fareler geri kazanımı yoluyla hayvanları izleme hayvancılık süresini azaltarak, anestezi hızla iyileşir. IMIT yönteminin teknik açıdan en zor yönü fareler entübasyon ilk adımıdır. IMIT gerçekleştirmek için öğrenme Bireyler bu ilk kateter yerleştirilmesi aşamasında ve entübasyon sağlanması boya hareketin görsel onay yoluyla elde edilmiştir odaklanmak edebiliyoruz. Yaklaşımın faydası akciğer-spectüpte İnstilasyon yeni araştırmacı hem güvenini hem de zor bir hayvan entübe girişiminde uzman artar entübasyon teyidi kullanımı ile garanti edilmektedir. Başarılı entübasyon olasılığını optimize kilit unsurları şunlardır: Bir derin sedasyon elde i), ii) ağızda Spekül doğru yerleştirme iii) iyi derinlik yerleştirme, epiglot iyi görselleştirme izin için yeterli çalışma süresi sağlamak için aynaları dil işlem boyunca geri kalır, ve prosedür, rahat ve sürekli bir yaklaşım ile yapılır ve böylece, devirme platformun iv) kullanımı araştırmacının el destek böylece. IMIT prosedürün sınırlamalar biri IMIT instilasyon etkinlikleri frekansı ile ilişkilidir. Cevapsız entübasyon ile ilişkili potansiyel travma nedeniyle, ikiden fazla entübasyon girişimleri (iki isabetsizlik için) tek oturumda yapılan tavsiye edilmez. IMITkabiliyeti mükemmel bir potansiyel murin akciğer içine terapötik sağlamak için kullanılacak olan, akciğere reajanı çok sık teslimat yararlanabilir Ancak terapötik rejimler IMIT için uygun olmayabilir. Bu IMIT önemli bir travma olmaksızın bir murin akciğer içine reaktifleri teslim etmek için günlük olarak kullanılabilecek bu mümkün olabilir, ancak entübasyon bağlantılı travma çoğunda olduğu gibi, yüksek vasıflı bir araştırmacı tarafından yapılan yalnızca kaçırılmış entübasyon olayla ilişkili olduğu düşünülmektedir . Bu tür yüksek frekanslı IMIT yerel veteriner hekimler ve IACUC ile ele alınmalıdır. IMIT ek bir potansiyel bir sınırlama entübe olan fare boyutudur. 20 G kateter Bu aralıktaki değerlere sahip farelerin trakea için uygun bir boyutta olduğu bulunmuştur 22 g, - yukarıda tarif edilen IMIT prosedürü yaklaşık 17 fareleri kullanılarak geliştirilmiştir. Büyük kateterler başarılı yaşlı farelerin kullanılmıştır; IMIT m ilk geliştirme&gt; 20 gr arasındadır, BALB / c farelerinde bir 18 G kateter ade kullanımı. Alternatif bir kateter boyutlar kullanılıyorsa da önemlisi, küt iğne kateter lümeni uygun ve sadece kateter ucu ötesine 1 mm uzanan bir uzunluğa kesilmiş olan kaynaklı olmalıdır. 17 g&#39;dan küçük farelerin Entübasyon mümkün olabilir, fakat gerekli uzmanlık nedeniyle tavsiye edilmez, ve daha küçük kateter ve yukarıda tarif edilen daha Spekül kullanımını gerektirecektir. P. ek olarak birçok solunum patojenlerin verilmesi için IMIT kullandık B. dahil aeruginosa, pseudomallei 9 ve Klebsiella pneumoniae 10. IMIT Model B çalışmalarımız önemli ilerlemeler kaydetmiştir pseudomallei solunum hastalığı, burun aşılama yerine insan hastalığında 9 gözlenen sistemik hastalık bitiş daha farelerin erken, ÜRT-ilişkili morbiditeye neden olduğu tespit sahip. B. pseudomallei Tier 1 selec olduğunubiyosavunma etki t madde, ve, solunum hastalık modelleri Aerosol çıkarmasından için geliştirilmektedir gibi olan modeller silaha patojen için giriş potansiyel biyosavunma ilgili yol. Mevcut aerosol modelleri RBB ve lrt hem de enfeksiyona neden için, aynı potansiyel erken hastalık fenotipi, B. göre olan burun içi model belirledik pseudomallei solunum hastalığı aerosol model için geçerli olabilir. IMIT modelinin bir gelecek uyarlama farelerin sadece akciğer içine hedef Aerosol uygulaması için entübe edildiği entübasyon aracılı aerosol yoluyla (IMAD) olabilir. Mekanik fanlar aerosollaştınlmış, sıvı bazlı ziyade, patojen meydan sunmak için adapte olabilir izofluran anestezisi, korumak için şu anda kullanılabilir. IMIT akciğere bakterilerin iletimini optimize etmek için bir yöntem olarak, başlangıçta gelişmiş değil, aynı zamanda, fare akciğer içine, diğer reaktifler verilmesi için uygulama sahiptir. Dis olarakyukarıda ele alınan, düşük verimlilik farelerde terkiplerin burun içinden sağlanması, akciğerlerin hedef organı içine reaktiflerin son derece değişken teslimat. Biz IMIT olarak&gt;% 98 dağıtım etkinlik ve multilober dağılımına sahip yaklaşımları için diğer akciğere verilme için mükemmel bir alternatif olduğunu göstermiştir, oysa sıçangil akciğere Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) görüntüleme reaktifleri burun içinden sağlanması,% 40 iletim verimliliği 11 elde edildi. Akciğere hedeflenen bir gönderim bu gelişme solunum hastalığının tedavisi için terapötik teslimat tekrarlanabilirliğini artırma potansiyeline sahiptir. I) Çevre akciğer tahriş edici etkisi, ii) akciğer kanseri fenotipik çalışmalar, iii) akciğer özgü siRNA knock-down: IMIT benzer çalışmaları fayda sunabilir.

Fareler, solunum hastalıklarının bir sayısız da dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalık açıklamalarını modellemek için kullanılmıştır. Yedek hastalık modelleri genellikle tipik olarak önemli fizyolojik veya iki konak modellerinde immün farklılıklar nedeniyle, bir modellenen hastalığın tüm yönlerini özetlemek mümkün değildir. Böylece, model sistemlerinin iyileştirilmesi bir gol suretler daha yakından bir hastalık sürecini ayna veya özgün ana bilgisayar sisteminde görüldüğü gibi yanıt ev sahipliği yapmaya izin yaklaşımlar geliştirmektir. Onlar havasını hangi mekanizma fareler ve insanlar arasında birçok önemli fizyolojik farklılıklar vardır. URT ve LRT boyutları arasında anlamlı rasyometrik farklılıkların bu farklar bulunuyor. Bu fareler&gt; 100 toplam akciğer kapasitesi 1,2 karşı normalize insanlara ÜRT yüzey alanı, kat sahip olduğu tahmin edilmiştir. Bu durumda, fare konka breathi çok daha büyük bir oranını teşvik etmek için solunan havanın çok daha geniş bir filtreleme için izinburun boşluğunun enfeksiyon hastalığın ilerlemesinde önemli bir rol oynar eğer ng, pnömoni çalışmaları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Çeşitli yaklaşımlar insan gibi solunum yolu hastalığı araştırmak için, farelerin ciğerlerine bakterileri aşılamak için kullanılmıştır. Bu yaklaşımlardan en çok sıvı bir süspansiyon, bir fare, bir ya da her iki burun tatbik edildiği intranazal aşılama vardır. Nispeten basit iken, burundan aşılamadan 3-5 yoluyla lrt damlatma verimliliğini etkileyebilir kullanılan anestezinin damlatılması hacmi ve türü olarak uyarılar. Spesifik olarak, Miller ve diğ. en az 50 ul lrt 6 içine bakteri damlatma ile sonuçlanmadı hacimlerde, Francisella tularensis bu burun içi instilasyon göstermiştir. Anestezi için enjekte ketamin / ksilizin karşıt olarak inhale izofluran kullanırken Onlar daha iyi lrt instilasyonunu gözlendi. Ancak, ExperiencYersinia pestis, intranazal aşılama e izofluran (MBL, yayınlanmamış veriler) kıyasla daha tutarlı bir aşı, ketamin / ksilazin kullanılarak elde edilebilir gösterir. Bu farklılıklar kullanılan patojene veya laboratuar prosedürlerinde, çeşitlilikten dolayı, ama önemlisi bu teknikte olası değişkenliği vurgulamak atfedilebilir. Bundan başka, başlangıç ​​bakteriyel inokulum nispeten düşük bir yüzdesi ciğere erişmesi burun içi instilasyon göstermektedir kısa bir süre sonra hasat akciğerlere bakterilerin büyük sayıda düşündüren (Y. pestis durumunda, sadece% 10 instilasyon 7 1 saat sonra elde edildi) RBB olarak muhafaza edilir (veya mide-barsak kanalında Yutulan) olabilir. Organizma, insan hastalığı ile tutarlı bir şekilde, sıçangil burun boşluğunu kolonize edebilen ise, bazı hastalık modellerinde, ÜRT mukoza bakteri, bu önemli bir çökelme hastalığın ilerlemesinin anlamamıza karıştırıcı etki. Örneğin, in vivo kullanımı &lt;/ Em&gt; görüntüleme, bu burun içi instilasyon yöntemiyle 8 ile iletildikleri zaman, insan urt kolonize etmez Burkholderia pseudomallei, sıçangil burun boşluğunun ezici fırsatçı enfeksiyonlara neden olduğu gözlenmiştir. Farelerin ciğerlerine bakterilerin aşılanması için diğer yöntemler de enfeksiyonlu hastalık araştırmalarında kullanılmıştır. Transoral [sindirim sistemi ve LRT]; ancak, burun damlatılması ile karşılaştırıldığında bu yöntemler çoklu siteleri (örneğin, aerosol [URT ve LRT] enfeksiyon başlatılması için potansiyelini ortadan kaldıracak olmadan daha fazla teknik uzmanlık ve / veya pahalı ekipman gerektiren eğilimindedir ve cerrahi intratraşel [LRT ve kan akışı]). Enfeksiyonun ikincil siteleri ile ilişkili olabilecek olası komplikasyonları göz önüne alındığında, biz UrT atlar ve doğrudan anestezi farelerin ciğerlerine patojeni sunan bir intratraşel yaklaşım geliştirmeye çalıştılar, ama aynı zamanda yanlışlıkla inoculat sınırlarKan akımı veya GI kanalı içine iyon. Bu amaçla, entübasyon-aracılı intratraşel (IMIT) damlatılması önce damlatılmasını uygun kateter yerleştirme doğrulamak için bir ara adım ekleyerek inokulum lrt instilasyonunu garanti cerrahi olmayan bir prosedür olarak geliştirilmiştir. Görsel akciğerlerde inokulum geniş dağılımını göstermektedir, ve P. Bu yöntem, boya instilasyonunu kullanılarak tarif edilmektedir aeruginosa, instilasyon akciğere Bu yöntemin oldukça etkili teslimatı (&gt; aşı% 98) gösterdi. Önemli olarak başlangıçta bakteriyel verilmesi için geliştirilmiş olup, IMIT de için etkin bir araç sunmaktadır: diğer solunum yolu hastalığı modellerinde ii) &#39;ın özel terapötik teslimat çalışma için çeşitli moleküllerin i) damlatma ve iii) bazik akciğer fonksiyon testleri, hedef dahil akciğere siRNA teslimat.

<table><tbody><tr><td>Kemirgen, Devirme Çalışma Standı</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>Bir BSC'de çalışırken taban çıkarılmalıdır</td></tr><tr><td>Ameliyat Otoskop Kafası</td><td>Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoskop 3.5 V Li Pil</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Fare Entübasyon Spekülasyonu Kısa, Otoklavlanabilir</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>Kesici Makas Halkaları</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk ince uçlu aplikatör</td><td>Püriten</td><td>871-PC DBL&nbsp;</td><td>Dil retraksiyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>I.V. Kateter, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>İsteğe bağlı: 10 mm açıkta kalan kateter yüzeyine sahip bir silikon manşon takın</td></tr><tr><td>Gaz geçirmez şırınga, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td> IMIT Künt İğne <td>ile sıvı aşılama için kullanılır</td></tr><tr><td>, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>20 G kateterden 1 mm çıkıntı yapacak şekilde uzunlamasına kesin</td></tr><tr><td>Kılavuz tel (Fiber optik tel, 0,5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>6 "uzunluğa kadar kesin: entübasyon için kılavuz tel olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Tüberkülin şırıngası, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Kılavuz tel olarak fiber optik tel ile birleştirin</td></tr><tr><td>Brilliant Blue R (Coomassie)</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon boru, 1/16"</td> <td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Erkek Luer 1/16 "diken</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Dişi Luer 1/16" diken</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidokain, USP</td><td>Spektrumu</td><td>LI102</td><td>pH lidokain% 2 (a / h) pH 7.0'da çözeltiye</td></tr><tr><td>Numune torbası, 1 oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>U-tabanlı 96 kuyulu plaka, steril</td><td>Greiner</td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

entübasyon-aracılı intratrakeal (imit) damlatma: a noninvaziv, lung-özel dağıtım sistemi

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Solunum hastalığı çalışmalar tipik vekil sistemleri gibi fare modellerinin kullanımını içerir. Bununla birlikte, özellikle üst solunum yollarının (ÜRT) &#39;de murin ve insan solunum yolu şekli bir çok fizyolojik farklılıklar vardır. Potansiyel olarak, bu hastalıklar çalışma fare modeli olan faydalılığı sınırlandırmakta, burun içi instilasyon teknikler kullanılarak Bazı modellerde, murin burun boşluğunda bu farklılıklar, alt solunum yolunun (MDT), hastalığın ilerlemesi ve sunum üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenlerden dolayı, RBB tutulumu yokluğunda lrt hastalığı araştırmak amacıyla, farenin akciğerlerinde doğrudan bakteri aşılamak için bir tekniğin geliştirilmesi de avantajlı olacaktır. Biz bu akciğer özel uygulama tekniği entübasyon-aracılı intratraşel (IMIT) instilasyonunu tabirinin. Bu yöntem ile daha invaziv nda geleneksel sırasında oluşabilecek kan, damlatma için potansiyeli en aza indirirÖnal cerrahi intratrakeal enfeksiyon yaklaşımlar ve arızi sindirim sistemi teslim olasılığını sınırlar. IMIT farelerin akciğerine bakterilerin doğrudan dağıtım aracılık katetere, kör bir iğne sokulması ile, soluk borusu içine doğru bir kateter yerleştirme sağlamak için bir ara adım, entübe takip edildiği, bir, iki aşamalı bir işlemdir. Bu yaklaşım, akciğerlerde reaktifi mükemmel dağılımı ile akciğerlere, bir teslimat&gt; 98% etki kolaylaştırır. Bu nedenle, IMIT insan solunum yolu hastalığı araştırmak için belirteci olarak fareler kullanma yeteneği üzerine iyileştirilmesi, doğrudan akciğere lrt hastalık ve tedavi teslim incelemek için yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir. Ayrıca, bu iletim sisteminin doğru ve tekrarlanabilirliği de Good Laboratory Practice Standartları (LU) için uygun, hem de akciğer yüksek verim gerçekleştirilmesini gerektiren reaktifler geniş bir iletim yapar.

IMIT yöntemi ile aşılanan maddenin dağılımını görselleştirmek için,% 0.1 Coomassie Parlak Mavisi 50 ul bir anestezi fare akciğerlerine damla damla akıtıldı. Fare hemen kurban edilmiş ve akciğerleri steril otopsiden yoluyla uzaklaştırılmıştır. Boyanın tüm akciğer lobları teslim edilmiş olduğu 1 göstermektedir. IMIT yöntemi ile akciğerlere verilen bakteri miktarının, fareler üç gruba (n = 3), P. üç farklı konsantrasyonları ile akıtıldı belirlemek için aeruginosa (1.21 x 10 8, 1.21x10 7, ve 1.21 x 10 6 koloni oluşturan birim [CFU] 50 ul başına). Hemen IMIT damlatma sonrası, fareler akciğerleri çıkartılmıştır ötenazi uygulandı, ve bakteri sayıları mikroorganizma (Şekil 2) ile numaralandırılır ve karşılaştırıldı. Akıtıldı ve inokulum teslim akciğerinden kazanılan inokulum&gt;% 98 olan, bu yöntem ile son derece verimlidirHayvanlar. Ayrıca, IMIT instilasyon bağımsız olarak aşı (= 0,9951 R2) konsantrasyonunun yüksek oranda tekrar. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Resim 1: IMIT instilasyon akciğerlere inokulum dağıtır her loblarda dağıtılmış% 0.1, Coomassie Parlak Mavisi göster mavi boya, 50 ul ile aşılanan farelerden Akciğerler.. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. Akciğerler Bakterilerin farelere IMIT instilasyon P. ile akıtıldı aeruginosa ve akciğerlerin içine telkin bakteri sayısı (10 CFU Log - iyileşti) tahmin Aşılama karşılaştırıldı (10 CFU Log - teslim). Her bir halka bir tek farenin (CFU / akciğer her biri için n = 3 temsil ederbakteriyel doz).

Reaktiflerin Entübasyon aracılı intratrakeal (IMIT) instilasyon solunum yolu hastalıkları, hem de akciğer içine doğrudan tedavi reaktifler aşılamak için bir yöntem incelenmesi için mükemmel, invazif olmayan bir yöntemdir. Bu klinik öncesi test için uygun bir hızlı ve yüksek oranda çoğaltılabilir bir yöntemdir.

Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Bu prosedürün genel amacı, bakterileri noninvaziv olarak doğrudan farelerin akciğerlerine iletmektir. Bu, önce 150 mikrolitrelik bir hava yastığının gaz geçirmez bir şırıngaya yüklenmesi ve ardından hazırlanan bakteri süspansiyonunun 50 mikrolitresi ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, anestezi uygulanmış bir fare, yerleştirmeye yardımcı olmak için bir kılavuz tel kullanılarak 20 gauge bir kateter ile entübe edilir.Daha sonra basit bir akış ölçer kullanılarak entübasyonun başarısı onaylandıktan sonra, bakteri aşısı kateter yoluyla 22 gauge uzunluğunda künt bir iğne ile doğrudan akciğere verilir. Sonuç olarak, entübasyon aracılı intratrakeal veya atlan aşılama, farelerde alt solunum yolu hastalığını incelemek için kullanılabilir ve üst solunum yolunun eşzamanlı tutulumunu önler. Imit'in internazal aşılama yöntemlerine göre en büyük avantajı, bu tekniğin bir aşının doğrudan akciğerlere doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde verilmesine izin vermesidir.HTE cerrahi olmayan bir teknik olduğundan, cerrahi intratrakeal prosedürlerle ilişkili komplikasyon potansiyelini de azaltır. Bu yöntem, patogenezi incelemek için bakterileri akciğere iletmek için güvenilir bir mekanizma sağlayabilse de, IMA, akciğer hasarını incelemek için çevresel bileşikler, tedavi için terapötiklerin hedef verilmesi ve görüntüleme problarının verilmesi gibi diğer reaktiflerin verilmesine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, entübasyon adımıyla mücadele edeceklerdir, çünkü adım, hayvanın dikkatli bir şekilde konumlandırılmasını ve kılavuz tel yerleştirilmesi için otomatik dürbünü gerektirir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi yararlıdır, çünkü kılavuz telin trakeaya ilk yerleştirilmesinin yeni araştırmacılara kavramsal olarak tanımlanması zordur. Kurulumdan 15 saat önce, üç mililitre et suyu kültürünü tek bir bakteri kolonisi ile aşılayın ve kültürü 37 santigrat derecede ve 200 RPM'de bir çalkalayıcıda büyütün. 15 saat sonra, 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde hücrelerin bir mililitresini döndürün ve damağı bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın.Daha sonra, bakteri konsantrasyonunu belirlemek için bir OD 600'de bakteri stok süspansiyonunun bir ila 10 seyreltmesini ölçün. Daha sonra PBS'deki bakteri hücrelerini 50 mikrolitre inokülum başına istenen bakteri konsantrasyonuna seyreltin. HTE kurulumu için fareler, gavaj iğneli fareler tarafından hafifçe anestezi uygulanmış bir fareye% 2'lik bir lidokain çözeltisi uygulanarak IIT için hazırlanır.Lidokain etkisini gösterirken anesteziye dönüş. Şimdi 150 mikrolitre havayı, 22 gauge uzunluğunda künt bir iğne ile donatılmış 250 mikrolitrelik gaz tipi bir iptal şırıngasına çekin. Ardından, şırınga yüklendiğinde 50 mikrolitre bakteri aşısını çekmek için Teflon pistonu şırınga gövdesi üzerindeki 150 mikrolitre işaretinden 200 mikrolitre işaretine ilerletin.LA, bir entübasyon platformunda sırtüstü yatıştırılmış bir fare, platforma bağlı bir Velcro şeridine bağlı olmayan bir halka üzerinde hayvanı kesici dişlerden sabitler. Fareyi 45 derecelik bir eğime kaldırın ve ardından baskın elinizle yuvarlanma hareketiyle dili geri çekmek için bir mikro pamuk aplikatörü kullanın. Daha sonra, baskın olmayan el ile, hem dil retraksiyonunu sürdürmek hem de epiglotusu görselleştirmek için speküler bir entübasyon ile uyumlu bir ameliyat otoskopu kullanın.Daha sonra, baskın elinde 20 gauge kateterden geçirilmiş bir kılavuz tel tutarak, fareyi trakea içinde 10 milimetre derinliğe kadar entübe edin ve otoskopu çıkarın. Kateteri baskın olmayan el ile sabitleyin. Ardından, katetere renkli bir boya içeren 16. şeffaf borunun yem bağlantılı bir uzunluğunu kısaca takın.Boya, hayvan başarılı bir şekilde entübe edildiğinde hayvanın nefes almasına yanıt olarak hızla ileri geri hareket etmelidir. 22 gauge künt iğneyi katetere yerleştirin ve aşıyı tek bir sıvı hareketiyle doğrudan akciğere dağıtın. Daha sonra iğneyi ve kateteri hemen hayvandan çıkarın ve hayvan anesteziden tamamen iyileşene kadar fareyi izleme ile kafesine geri koyun.Enfekte akciğer dokusunun bakteri yükünü değerlendirmek için, steril teknik kullanarak akciğerleri çıkarın ve dokuyu steril önceden tartılmış bir ons numune torbasına yerleştirin. Numune torbasını ve akciğerleri tarttıktan sonra, dokuya bir mililitre steril PBS ekleyin ve numune torbasını yeniden satın. Ardından, dokuyu homojenize etmek için 25 mililitrelik serolojik bir pipeti numune torbasının üzerine yavaşça yuvarlayın.Bağlı dokuyu steril bir polyester duvar tabakası filtresinden çıkarın ve homojenatı bakterileri serbest bırakmak için tritton X 100 ile %1'lik bir son konsantrasyonda işlemden geçirin. Daha sonra, bir UBO 96 oyuklu plakada homojenatın altı kat seri seyreltilmesini gerçekleştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Ardından, homojenat üçlü 10 mikrolitrelik alikotları bir LBA agar plakasına kaplamak için sekiz kuyulu çok kanallı bir plaka kullanın.Son olarak, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve ertesi gün koloni oluşturan birimleri numaralandırın. Bu temsili deneyde aşılanan hayvanların akciğerlerinden geri kazanılan pseudomonas aerogen inoculum'un% 98'inden fazlası ile bakterilerin verilmesi bu yöntemle oldukça verimlidir. Ayrıca, HTE kurulumu, uygulanan aşının konsantrasyonundan bağımsız olarak yüksek oranda tekrarlanabilir.Damıtılan materyalin IIT yöntemi ile dağılımını görselleştirmek için, aşılama için gösterildiği gibi 50 mikrolitre% 0.1 Kumasi parlak mavi boya akciğerlere verilebilir. Not: Boyanın akciğerin tüm loblarına dağılımı bir kez ustalaştıktan sonra. Bu yöntem iki araştırmacıdan oluşan bir ekiple anestezi, IMA aşılaması ve anesteziden kurtarma dahil olmak üzere ortalama iki ila üç dakikalık bir sürede hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir.Bu prosedürü denerken, fareyi entübe etmek için ikiden fazla başarısız girişimde bulunmamak önemlidir. Başarısız entübasyon, kateterin trakea yerine yemek borusuna yerleştirilmesinden kaynaklanan potansiyel travmaya neden olabilir. Abs L üç muhafazası gerektirenler de dahil olmak üzere birçok solunum yolu patojeni, bu prosedür güvenlik kabinleri ve ayrıca bir yüz siperi de dahil olmak üzere tam solunum koruması giyen araştırmacılar tarafından gösterildiği gibi gerçekleştirilebildiğinden, imed tarafından etkili bir şekilde verilebilir.Imit'in, malzemelerin doğrudan farelerin akciğerlerine verilmesi için çok doğru ve verimli bir yöntem olduğunu gösterdik. Bu özellikler, imit'i yüksek oranda tekrarlanabilir model sistemleri gerektiren GLP tipi çalışmalar için çok uygun hale getirir.

intubation-mediated-intratracheal-imit-instillation-noninvasive-lung

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Intratrakeal instilasyonlar doğrudan ciğerlerine çözünenlerin sağlar. Bu prosedür, akciğer distal bölgeye instillate teslim hedefler ve bu nedenle sık sık alveoller okuyan yönelik çalışmalar dahil edilmiştir. Biz farelerde intratrakeal instilasyonlar gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yaşam protokolü sağlar.

Fare Akciğer içine çözünenlerin Doğrudan Trakeal damlatma

Biz anestezi farelerin trakea yoluyla ciğerlerine test malzemelerin cerrahi olmayan teslimat göstermektedir. Bu yöntem, bakteriyel ve viral patojenler, sitokinler, antikorlar, boncuk, kimyasallar, ya da boyalar akciğer maruz izin verir. Daha hasat ve flow sitometri akciğer ve akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) işlenmesi açıklanmaktadır.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Bu videoda, deneysel bir ajanın distal sağ ve sol akciğere seçici olarak uygulanması için intrabronşiyal bir yaklaşım açıklanmaktadır. Öne çıkan protokolde, pulmoner fibroz için daha iyi bir model elde etmek için bleomisini intrabronşikal olarak bir fareye uygulayacağız.

İntrabronşiyal Doğum: Deneysel bir ajanı seçici olarak bir fare akciğerine uygulamak için bir teknik

Insanlarda akciğer hastalıklarının durumunu taklit eden bir modelinin kullanılması, belirli bir hastalığın patofizyolojisi ve / veya etyolojisinin araştırılması için ve terapötik müdahale geliştirmek için çok önemlidir. Burada doğrudan fare akciğerlere eksojen malzemeleri teslim noninvazif bir entübasyon yöntemi sunulmuştur.

Noninvaziv Entübasyon Fare Akciğer Patolojisi ve Fizyolojisi Eğitim için

Bu makalede, entübasyon yoluyla fare trakea içine doğrudan bleomisin yönetmek için hızlı ve basit bir yöntem sunar. Bu yöntemin en önemli avantajları usta son derece tekrarlanabilir kolay ve özel ekipman ya da uzun iyileşme süreleri gerektirmez vardır.

Farelerde Trakea hızlı intübasyon için geliştirilmiş bir yöntem

Farelerde deneysel ajanlar intratracheal (It) yönetimi genellikle distal akciğerlere asimetrik teslim sonuçlanır.  Bu raporda, her akciğeri operatif olmayan canlı fareler içinde cannulate için doğrudan intrabronchial (ıB) yaklaşımı açıklanmaktadır.  Bu yaklaşım, bir akciğer için seçici olarak ajanlar yönetmek için kullanılabilir ya da her iki akciğerde simetrik Ajan teslim geliştirmek için adapte olabilir.

Fare akciğer Içinde seçici Ajan biriktirme geliştirmek için doğrudan Intrabronchial yönetim

Soluma için kuru toz formülasyonları solunum yolu hastalıklarının tedavisinde büyük potansiyele sahiptir. İnsan çalışmalarına girmeden önce, preklinik çalışmalarda kuru toz formülasyonunun etkinliğini değerlendirmek gerekir. Farelerde intratrakiel yoldan kuru tozun yönetiminin basit ve invaziv bir yöntemi sunulmuştur.

Farelerde Kuru Toz Formülasyonunun Intratrakial Yönetimi

İlaçların doğrudan yenidoğan kemirgenlerinin trakeasına damlatılması tekniği, lokal olarak uygulanan ilaçların veya biyolojiklerin yenidoğan akciğer hastalıkları üzerindeki etkisini incelemede önemlidir. Ek olarak, bu yöntem hayvan modellerinde akciğer hasarını indüklemek için de kullanılabilir.

Yenidoğan Kemirgenlerinde Akciğer Hastalığını Tedavi Etmek İçin İlaçların İntratrakeal İnstilasyonu İçin Minimal İnvaziv Bir Yöntem

Burada, noninvaziv orofaringeal endotrakeal entübasyon yoluyla intratrakeal lipopolisakkarit (LPS) doğumu için bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, hayvan için cerrahi prosedürün travmasını en aza indirir ve LPS'yi trakeaya ve daha sonra akciğerlere doğru bir şekilde iletir.

Farelerde Noninvaziv İntratrakeal Lipopolisakkarit Damlatma

Bu protokol, bir farenin en uygun şekilde konumlandırılmasının ve kamera tabanlı bir otoskopun transoral olarak yerleştirilmesinin glotisin görselleştirilmesini, minimal doku travması ile hızlı entübasyonu ve akciğerlere tutarlı sıvı verilmesini nasıl sağladığını gösterir.

Fare Akciğerine Sıvı İletimi için Geliştirilmiş Metodoloji: Tüketici Otoskopu Kullanılarak Entübasyon

Hücre tedavisi, hasarlı dokuyu onarmak ve akciğer fonksiyonunu iyileştirmek için progenitör hücreleri kullanarak pulmoner fibroz için umut verici bir müdahale sunar. Görüntüleme, hücre entegrasyonunun izlenmesinde çok önemli bir rol oynadığından, burada, bir fare modelinde pulmoner fibroz için hücre tedavisinin manyetik parçacık görüntüleme kılavuzluğunda in vivo takibini açıklıyoruz.

Manyetik Parçacık Görüntüleme Kullanılarak Pulmoner Fibroz için Nakledilen Distal Akciğer Epitelyal Progenitör Hücrelerinin Görüntü Kılavuzluğunda In Vivo İzlenmesi

Öğrenin, farelerde solunum yolu hastalıklarını çalışmak için entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma yöntemini. Bu invaziv olmayan teknik, bakteri ve terapötik ajanların akciğerlere doğrudan, tekrarlanabilir ve hassas dağıtımını sağlar.

Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi

Daha fazla video keşfet