Name: Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Öğrenin, embriyonik kemirgen ventral mezensefalondan primer dopaminerjik nöronların izolasyonu, kültürü ve uzun vadeli bakımı için optimize edilmiş protokolü. Bu yöntem, Parkinson hastalığında nörodejenerasyon mekanizmalarını in vitro ortamda araştırmak amacıyla değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Imperial College London Beyin Bilimleri Bölümü, Tıp Bölümü, K.N.A.'ya sağlanan başlangıç fonları kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: hayvanlar muhafaza ve onaylanan kurumsal kurallar ve tüm hayvan prosedürlere uygun ele Imperial College&#39;ın Hayvan Refahı tarafından edildi ve Etik İnceleme Vücut (AWERB) ve Ev Ofis ve Harvard Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), Federal ve eyalet yönetmeliklerine uygun olarak. 1. Reaktif ve Ekipmanları Kurulum <ol><li> Çözülme, kısım ve -80 ºC mağaza 1 mg / ml laminin çözümü. 1-2 ug / cm2 &#39;lik bir kaplama konsantrasyonunda elde edilen 1 ml DMEM / F12 içinde 2 ul çözülür. NOT: yavaşça buz üzerinde ve plakaları / lamelleri eklemek hemen soğuk DMEM / F12 çözülür ve çözülme laminin. </li><li> 4 ° C&#39;de 75 ml% 0.01 425 ml PBS Poly-ornitin L-ve mağaza içinde seyreltin. NOT: Çalışma çözümün raf ömrü bir ay kadardır. </li><li> Bir ye kadar 4 ° C&#39;de% 25 (ağırlık / hacim) PBS içinde BSA, pH 7.4, ve mağaza çözülürar. </li><li> (HBSS)% 50 FBS devre dışı bırakma ortamı hazırlayın. </li><li> (+) - - Glikoz (ağırlık / hacim),% 0.25 BSA (ağırlık / hacim), 50 U / ml penisilin ve streptomisin, 1 x N2 ek,% 5 (hacim / hacim) FBS,% 0.36 ilave edilmesi ile tam bir ortam hazırlama DMEM / F12 ve mağaza 4 ºC&#39;de. NOT: raf ömrü 10 gün kadardır. </li><li> En az 30 dakika boyunca% 70 (hacim / hacim) kaynayan etanol içinde yer lamelleri yağ ve otoklavın kalıntılarını gidermek için. </li><li> Talep 24 oyuklu plakalarda lamelleri ve her bir oyuğa 500 ul Poli-L-ornitin solüsyonunu ilave edin. Oda sıcaklığında doku kültürü başlık altında 1 saat inkübe ve daha sonra 500 ul su ile 3 kez yıkanır. Her plaka için 500 ul, laminin solüsyonu eklenir ve 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde, O / N inkübe edin. NOT: yıkamalar 24 saat kültürden sonra hücrelerin ölümü ile poli-L-ornitin en az üç kez yıkama sonuçlarını laminin tedaviden sonra gerekli olsa da. </li><li> Doğal gaz veya meşale f üzerinde cam pipetler ipuçları parlatmaktopal. NOT: Bu adımdan sonra ucu çapı normal boyutunun yaklaşık yarısı olmalıdır. </li><li> Bir otoklav makas ve otoklav kullanarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kapakları kesilir. </li></ol> Embriyonik ventral orta beyindeki 2. Diseksiyon <ol><li> Uyuşturmak zamanlanmış-gebe (E12.5) CO 2 inhalasyon yoluyla barajlar ve daha sonra servikal dislokasyon ile euthanize. </li><li> % 70 etanol ile karın Sprey ve rahim keseler tüm maruz kadar bir karın kesi yapmak. Forseps vajinal eki kesme ve rahim kaldırmak. 100 mm Petri kabındaki, buzla soğutulmuş HBSS rahim yerleştirin. </li><li> Forseps (Şekil 1C) kullanarak, rahim ve amniyon kesesi embriyolar çıkarın. Buzla soğutulmuş HBSS yer embriyolar. NOT: Şekil 1D dikdörtgen embriyonik ventral orta beyindeki yerini gösterir. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu (10x büyütme) altında embriyolar yerleştirin ve mezensefalik teşrih, berzah ve mezensefalik-diensefalik sınır bölgesinde beyin kesme bioscissor ve forseps kullanarak kemer (Şekil 1E, kesi hatları için 1A Şekil bakınız). </li><li> Tüm Ortabeyin dışarı aldıktan sonra, mediodorsal orta beyin (Şekil 1F) bir kesim yapmak. </li><li> İki forseps (Şekil 1 H) kullanarak, meninksler çıkarın. NOT: KRİTİK ADIM: Bu adım, optimum verim ve nöronal hayatta kalmak için gereklidir. Kültür şartları, beyin hücreleri için uygun olduğu için, çevreleyen dokudan hücrelerin en kaplamadan sonra ölür ve bu dokudan apoptotik sinyal kültürlerinin bütünlüğüne zarar verebilir. </li><li> Bir sterilize tıraş bıçağı (Şekil 1 H, I) kullanılarak, kelebek şekli gözlemlemek ve her kanat yaklaşık yarısını kesmek için Petri kabı orta beyin doku düzeltin. NOT: Şekil 1J izole ventral Ortabeyin göstermektedir. </li><li> Transferi15 ml konik tüp buz-soğuk HBSS içine ventral orta beyindeki parça ve bir sonraki embriyo devam edin. NOT: 2,1-2,8 fazla 1 saat almamalıdır adımlar. Buz üzerinde bu zaman dilimi dışında embriyolar tutulması önemli ölçüde hücre canlılığını azaltır. </li></ol> Ventral Orta beyin hücrelerinin 3. Ayrılma <ol><li> Laminer akış kaputun altında ventral orta beyindeki parçalarını aktarın. HBSS çıkarın ve (ventral orta beyindeki kadar 12 adet yeterli hacim) konik tüp içine önceden ısıtılmış, 1 ml (37 ° C),% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. 5-10 dakika süreyle 37 ° C&#39;de doku inkübe edin. </li><li> Kaputun altında tripsin-EDTA çıkarın ve doku 1 ml de-aktivasyon orta (serum tripsin devre dışı bırakır) ekleyin. </li><li> Devreden Ortamı çıkarın ve iki kez tam bir ortam 1 ml doku yıkayın. Not: ayrışmış hücreleri atmadan önlemek için, boru tüm orta çıkarılması ve doku pipetleme kaçının. </li><li> 1ml tam orta ve trit ekleBir yangın cilalı cam pipet ile doku ürat. Kabarcıkların oluşumunu önlemek ve tek hücre süspansiyonu elde edilinceye kadar triturating devam edin. NOT: Genellikle 8-10 tam ayrışması için gerekli olan kısıtlı ucu geçer. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve ortam maddesinin ayrılması. </li><li> Yeniden askıya yavaş yavaş pipetleme tam orta 1 ml pelet ve aşağı yukarı dört kez. </li></ol> 4. Kaplama Ventral Orta beyin Hücreler <ol><li> 90 ul Trypan mavi çözeltisi ile hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın ve bir hemositometre ile hücre sayısı. Not: Hücrelerin canlılığı, aynı zamanda, bu aşamada kontrol edilebilir. </li><li> Kapaklar üzerine her seferinde bir forseps, birini kullanarak, 100 mm Petri tabaklarda steril mikrosantrifüj tüpü kapaklar yerleştirin ve Poli-L-ornitin / laminin kaplanmış lamelleri aktarın. NOT: lamelleri yıkamayın ve bu uneve neden olabilir çünkü, laminin kurumasını önlemekN kültürleri ve hücre hayatta kalma azalma. </li><li> (Hacim harcanmadan, lamel yüzeyini kaplamak için uygun olan) tam orta eklenerek 1 ul başına 1500 hücre hacmini ayarlamak ve her bir lamel üzerine hücre süspansiyonu 100 ul (150,000 hücrelerin toplam) ekleyin. Nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde Petri kapları kapatın ve 1 saat süre ile inkübe (37 ° C,% 5 CO2). Not: KRİTİK ADIM: Bu adım, hücre eki ve canlılığını geliştirmek için ve her embriyo için lamelleri sayısının arttırılması için gereklidir. Seçenek olarak ise, hücreler direkt olarak oyuklara (ihtiva lamelleri), ancak hücre sayısı (yerine 150,000) oyuk başına 350,000 artırılmalıdır aktarılabilir. Doğrudan transferi nedeniyle (yanında veya lamelleri altında) plakaları takmak hücrelerin, yaklaşık 3-4 lamelleri verir iken, diğer bir deyişle, bu yöntemi kullanırken, 8-10 lamelleri, elde edilebilir. Ortalama viabiliBu yöntemi kullanarak, kültürlerin Ty, yaklaşık% 90 idi. </li></ol> 5. Kültür Büyüme ve Bakım <ol><li> Inkübasyondan 1 saat sonra, dikkatli bir şekilde 400 ul önceden ısıtılmış (37 ° C kadar) tam bir ortam ihtiva eden 24 oyuklu plakalar içinde ortam dahil olmak üzere lamelleri transferi (toplam hacim: 500 ul). 37 ºC hücreleri O / N inkübe. </li><li> Kuyular inkübasyonundan sonra, 24 saat içinde yavaşça, her bir oyuğa 500 ul komple ortam ekleyin. Not: ilk birkaç saat dopaminerjik nöronların hayatta kalma ve bu noktadan sonra önemli ölçüde değişmez hayatta kalan hücrelerin sayısı en kritik aşamadır. </li><li> İlk iki hafta için veya orta sarı olana kadar kültürlere ek ortam eklemeyin. Iki haftadan daha uzun veya taze tam önceden ısıtılmış medya (genellikle her iki hafta) sarı, medyanın değişim yarısı (500 ul) orta renk değişiklikleri için kültürleme edin. NOT: içinde dopaminerjik nöronlarkültürler bu koşullar altında daha 6 hafta boyunca hayatta olurdu. </li></ol>

<ol><li>Prasad, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+immortalized+clonal+cell+lines+from+fetal+rat+mesencephalic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).</li>
<li>Fall, C. P., Bennett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+time+course+of+MPP%2B+-induced+apoptosis+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).</li>
<li>Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+modulation+of+dopamine+expression+in+neuronal+hybrid+cells+by+primary+cells+from+different+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).</li>
<li>Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+P75NTR+expression+causes+death+of+engrailed-deficient+midbrain+dopaminergic+neurons+by+Erk1%2F2+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression.</a> Neural Dev. 4, 11(2009).</li>
<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain. 133, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Animal models of Parkinson's disease.</a> Bioessays. 24, 308-318 (2002).</li>
<li>Schober, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classic+toxin-induced+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%3A+6-OHDA+and+MPTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP.</a> Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).</li>
<li>Chesselet, M. F., Richter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+Parkinson%27s+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Modelling of Parkinson's disease in mice.</a> Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).</li>
<li>Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+type+1+astrocytes+rescue+dopaminergic+neurons+from+death+induced+by+serum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation.</a> J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).</li>
<li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+progressive+degeneration+of+nigral+dopaminergic+neurons+in+postnatal+Engrailed+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice.</a> PNAS. 103, 15242-15247 (2006).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifelong+maintenance+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+Nurr1+and+engrailed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed.</a> J Biomed Sci. 21, 27(2014).</li>
<li>Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons%3A+determination+of+their+developmental+fate+by+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors.</a> Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).</li>
<li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+systems+in+the+brain%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li>
<li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39, 889-909 (2003).</li>
<li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%3A+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aetiopathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurology%22%5BJournal%5D)">Aetiopathogenesis of Parkinson's disease.</a> J Neurology. 258, S307-S310 (2011).</li>
<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+gene+expression+of+midbrain+dopaminergic+neurons+reveals+molecules+involved+in+their+vulnerability+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection.</a> Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması beyan edilmedi.

Orta beyin dopaminerjik nöronları, merkezi sinir sisteminde dopamin ana kaynağıdır. Üç gruba ayrılır, substantia nigra pars compacta (SNpc), ventral tegmental alan (VTA) ve retrorubral alanı (RRF), 10, 11. SNpc ve VTA&#39;da nöronlar gibi duygu, motivasyon ve motor davranışlarının kontrolü gibi işlevleri dahil, mezokortikal mezolimbik ve nigro-striatum büyük dopaminerjik yollar, yol. SNpc ve nigrostriatal sistemi fonksiyonel bozulma nöronların ölümü, ikinci en önemli nörodejeneratif bozukluk, Parkinson hastal...

Substantia nigra gelen dopaminerjik nöronların kaybı compacta Parkinson Hastalığı (PH), ikinci en yaygın nörodejeneratif bozukluk kardinal motor belirtiler neden pars. Bu mezensefalik nöronal nüfusun ölümü yatan nedeni bilinmemektedir. Kullanılmıştır geliştirilmesi ve nörofizyolojik özellikleri ve mesDA nöron, bir kaç hücre kültürü ve hayvan modeli sistemlerinde hayatta modüle edilmesi için sorumlu biyokimyasal yollar incelenmesi. Sıçan dopaminerjik hücre çizgisi 1RB 3, 27 (N27), insan dopaminerjik nöroblastoma hücre çizgisi SH-SY5Y, MN9D ve insan mezensefalik hücreleri LUHMES fare dopaminerjik melez hücre hattı olmak üzere ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri, biyokimyasal ve sınırlı mekanik çalışmalar 1 kullanılmaktadır -5. MesDA nöronların spesifik kaybı çalışmada, birkaç nörotoksin bazlı ve genetik modeller 6-8 geliştirilmiştir. Primer ventral orta beyin kültürlerDopaminerjik nöronlarının nöronal ve sinaptik özellikleri ve bu ortak hastalık patojenezinde rol yolları çalışmak için vazgeçilmez bir araç sağlar. Burada daha yüksek yaşama şansına sahiptir her embriyo için lamelleri verim artışı ile sonuçlanan değişiklikleri içeren mezensefalik dopaminerjik nöronların izolasyonu için detaylı bir protokol mevcut. Önceden olgun E12.5 fare mezensefalona (sıçan E14.5) kullanımı beka geliştirir. Bu yaşta nöronlar diseksiyonu sırasında sağlam hücreleri bırakır, henüz akson geliştirilen ve böylece önemli ölçüde canlılığını arttırarak stresi en aza indirir değil. Ayrıca, bu protokolün 2. bölümünde açıklandığı gibi ventral orta beyindeki dikkatli diseksiyon, daha beka geliştirir. Embriyo başına lamelleri sayısını artırmak için, alternatif bir kaplama yöntemi, bu protokolün 4. bölümde sunulmuştur. Bu altında 4 lamelleri ile karşılaştırıldığında embriyo başına en fazla 10 lamelleri bir ürün verimine yol açarStandart kaplama koşulları dolayısıyla deney başına hayvan miktarını azaltarak. Akson ve dentrites kültür sergi akıbet nöronlar, sinaptik bağlantıları oluşturmak ve canlı hücre görüntüleme, İmmünositokimya&#39;da ve elektrofizyolojik çalışmalar için bu kültürlerin uygun hale nöronal ve sinaptik belirteçlerinin varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, sinir hücresi kültürlerinde kullanılması genetik ve farmakolojik manipülasyonunu daha da kolaylaştırır. In vitro olarak 2 gün itibaren dışa doğru büyümesini geliştirme çalışmaları sağlar. Ayrıca, kültür uzun dönem hayatta kalmaları (en fazla altı hafta) bu nöronların yavaş ilerleyici dejenerasyonu çalışma için uygun hale getirmektedir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle orta besin karışımı F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (1X), sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu, ısıyla inaktive edilmiş (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 Takviyesi (100X), sıvı</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz su içinde çözelti (ağırlıkça %45 (ağırlıkça/hacim)</td><td>) Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm murin sarkomu bazal membranından Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin (% 0.05 (wt / vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serumu albümin (BSA) hücre kültürü test edildi</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tirozin hidroksilaz (Th) antikoru</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitin,% 0.01 çözelti</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2 (Mikrotübül ile ilişkili protein-2A ve -2B) antikoru</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sinapsin-1 antikoru</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan IgG ve nbsp; &nbsp; antikor</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 eşek anti-tavşan IgG & nbsp; &nbsp; antikor</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 eşek anti-koyun IgG & nbsp; &nbsp; antikor</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 eşek anti-koyun IgG & nbsp; &nbsp; antikor</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 eşek anti-fare IgG & nbsp; &nbsp; antikor</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi (ağırlıkça% 0.4 (hacimçe / hacim))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Ters faz kontrast mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forseps</td><td>İnce Bilimsel Araçlar</td><td>Mayıs-45</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Kaymalı Forseps &ndash; Dumoxel</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>İki Dumont #45 Forseps &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>Bıçak Tutucu/Kırıcı Düz Kavrama - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Öğrenci İris Makası - Düz 11,5 cm</td><td>İnce Bilimsel Aletler</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optik halojen aydınlatıcı</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Pastör Pipetleri</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & m steril filtre üniteleri</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm Petri</td><td>kapları BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Kapak Kayma # 1 Kalınlık Alman Camı 12 mm</td><td>Bellco Cam</td><td>1943-10012&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik kemirgen brain itibaren İlköğretim mesensefalik dopaminerjik nöronlar İzolasyonu, kültür ve uzun vadeli bakım

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Mezensefalik dopaminerjik (mesDA) nöronların dejenerasyonu, Parkinson hastalığının patolojik özelliğidir. Fizyolojik işlevlerde yer alan biyolojik süreçlerin ve bu nöronların savunmasızlığının ve ölümünün incelenmesi, altta yatan nedenleri anlamak ve bu yaygın nörodejeneratif bozukluğun tedavisini çözmek için önemlidir. MesDA nöronlarının birincil kültürleri, hastalığın seyri sırasında bu nöronların gelişimini, uzun süreli sağkalımını ve dejenerasyonunu anlamak için moleküler, biyokimyasal ve elektrofizyolojik özelliklerin araştırılması için bir araç sağlar. Burada, E12.5 fare (veya E14.5 sıçan) embriyolarından orta beyin dopaminerjik nöronlarının izolasyonu, kültürü ve bakımı için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu protokoldeki optimize edilmiş hücre kültürü koşulları, aksonal ve dendritik projeksiyonların, sinaptik bağlantıların ve diğer nöronal morfolojik özelliklerin varlığına neden olur, bu da kültürleri bu nöronal popülasyonun fizyolojik, hücre biyolojisi ve moleküler özelliklerinin incelenmesi için uygun hale getirir.

Tirozin hidroksilaz (TH) karşı İmmünohistokimya kültürdeki hücre 0.5-1 arasında,% dopaminerjik olduğunu göstermektedir. Tirozin hidroksilaz (TH) ve mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) antikorları (Şekil 3) kullanılarak, nöronal projeksiyonları kaplama sonra 2 saat içinde ortaya çıkar ve ilk gün, akson ve dendritler ayırt (Şekil 2). nöronlar fazla altı hafta boyunca hayatta ve kapsamlı akıbet göstermektedir. daha önce gösterildiği gibi kültürler nöron-glia oranı doğrudan ortam içinde se...

Parkinson hastalığı sırasında orta beyin dopaminerjik nöronlarının dejenerasyonunun nedenleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel kültür sistemleri, bu nöronların nörofizyolojik özelliklerinin incelenmesi için önemli bir araç sağlar. Burada, nörodejenerasyonun in vitro modellemesi için kullanılabilecek optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Bu prosedürün amacı, kemirgen ventral orta beyninden primer nöronları verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle kemirgen embriyolarının orta beyninin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise ventral orta beynin dikkatlice izole edilmesidir.Sıradaki adımda, tek hücre süspansiyonu elde etmek için nöronal dokunun disosiye edilmesi gerekir. Son adım, tutunmuş hücreler daha sonra 24 kuyucuklu plakaya aktarılmadan önce primer nöronların küçük bir hacimde lamel üzerine ekilmesidir. Nihayetinde, kültür içindeki dopaminerjik nöronları tanımlamak için antikor ve immunfloresan mikroskopi kullanılır.Orta beyindeki dopaminerjik nöronlar, bilişte hareket ve duygu kontrolü ile beynin ödül salgılaması dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonlarda yer alır. Ayrıca Parkinson hastalığı, bağımlılık ve şizofreni dahil olmak üzere nörolojik ve nöropsikiyatrik durumlarda da rol oynarlar. Ventral orta beynin onarılma yöntemi.Nöronal kültürler, dopaminerjik nöronların fizyolojisini ve hücresel özelliklerini incelemenin yanı sıra, Parkinson hastalığı gibi bozukluklar sırasında meydana gelen dejenerasyonlarının nedenini anlamak için kullanılabilir. İlk olarak, lamel camlarını hazırlayın.Herhangi bir yağ kalıntısını gidermek için bunları en az 30 dakika boyunca %70 ethanol içinde kaynatın. Ardından lamel camları otoklavlayın. Lamel camlarını 24 kuyucuklu plakalara aktarın ve her birine yarım mililitre polyol all athene ekleyin.Plakaları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe etmeye bırakın. Çalışma poliolü veya Athene çözeltisinin raf ömrünün bir ay olduğunu not edin. Ardından, lamel kapaklarını her yıkamada yarım mililitre su kullanarak üç kez yıkayın.Üç yıkama işleminin tamamı yapılmadığında, kültürlenen hücreler 24 saat boyunca hayatta kalamaz. Ardından, laminin çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi öncelikle buz üzerinde yavaşça çözdüğünden emin olun.Ardından laminini soğuk D-M-E-M-F 12 içinde çözün ve hemen kullanın. Şimdi her bir kuyucuğa taze hazırlanmış yarım mililitre çalışmaya hazır laminin çözeltisi ekleyin ve plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Son olarak, cam pipetleri hazırlarken uçlarını normal boyutlarının yarısına gelene kadar cilalıyorum.Uterin keseleri açığa çıkarmak için abdominal bir insizyon yapın ve forseps kullanarak uterusu serbestçe kesin. Uterusu 100 milimetrelik bir kap içindeki buz gibi soğuk HBSS'ye aktarın ve forseps ile embriyoları çıkarmaya başlayın. İzole edilen embriyoları soğuk HBSS içeren yeni bir kaba aktarın.Şimdi bir diseksiyon mikroskobu altında, ventral orta beynin bu bölgesine 10x büyütmede erişmeye hazırlanın. Biyo makaslar veya pensler kullanarak, beyni istmustan ve meas ve sefalik di sefalik sınır bölgesinden keserek meas ve sefalik arkı diseke edin. Tüm orta beyni çıkardıktan sonra, medial dorsal orta beyinde bir kesi yapın.Penset kullanarak meningesleri uzaklaştırın. Bu adım, nöronal kültürlemedeki başarının kritik bir noktasıdır. Nöronal olmayan hücreler kültür koşulları altında ölecek ve komşu nöronlara olumsuz sinyaller gönderecektir.Şimdi orta beyin dokusunu kelebek şeklinde düzleştirin. Ventral orta beyni bırakacak şekilde, her bir kanadın yaklaşık yarısını steril bir bıçakla kesin. Ventral orta beyni 15 mililitrelik konik bir tüp içindeki buz soğukluğundaki HBSS'ye aktarın.Ardından, bir saat içerisinde mümkün olduğunca çok embriyoyu diseke etme işlemine geçin. Bir saatten fazla buz üzerinde tutulan embriyolarda hücre canlılığı düşük olur. Dopaminerjik nöronların yüksek canlılığını sağlamak için, diseksiyon ile ekim arasındaki süre bir saati geçmemelidir.Ek olarak, meninglerin uzaklaştırılması, kapak altındaki nöronların sağkalımı için kritik öneme sahiptir. Ventral orta beyin toplama kabındaki HBSS'yi uzaklaştırın. Ardından, 12 parça doku için yeterli olacak miktarda, bir mililitre ılık 0.05%tripsin A DTA ekleyin.Dokuyu 37 °C'de beş ila 10 dakika inkübe edin. Çeker ocak altında, tripsin A DTA'yı 1 mL deaktivasyon ortamı ile değiştirin. Karıştırmak için nazikçe şişirin ve ardından, ayrışmış hücrelerin atılmaması için yeterli miktarda ortam bırakarak deaktivasyon ortamını uzaklaştırın.Ardından, hücreleri kaybetmemeye dikkat ederek dokuları iki kez tam besiyeri ile yıkayın. Şimdi bir mililitre tam besiyeri ekleyin. Daha sonra, tek hücreli süspansiyon elde edilene kadar dokuyu, kabarcık oluşturmadan, alevle uçları düzeltilmiş pipetle triture edin.Yaklaşık sekiz ila 10 pasaj yeterli olacaktır. Bu sürenin sonunda, hücreleri 400 Gs'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre tam besiyeri içinde yeniden süspande edin.Süspansiyon elde etmek için hücreleri pipetle dört kez kadar karıştırın. Süspansiyondaki hücrelerin sayımını yaparak sağlık durumlarını değerlendirmeye başlayın. Bunun için hemostatuar sayım hücresi (hemositometre) ile trypan mavisi dışlama yöntemini kullanın.Şimdi hücre süspansiyonunu mikrolitre başına 1500 hücre olacak şekilde ayarlayın. Ardından sterilize edilmiş mikro santrifüj tüp kapaklarını 100 milimetrelik kaplara aktarın. Hazırlanan lamelleri pens yardımıyla kapakların üzerine yerleştirin.Lamelleri yıkamayın ve kurumamasına dikkat edin. Her lamelin üzerine 100 µL süspansiyon yükleyin. Bu biraz alışılmadık yöntem %90 kültür canlılığı sağlar ve başarının kritik bir adımıdır.Ardından Petri kabını kapatın ve bir saat boyunca inkübatöre yerleştirin. İnkübasyon sonrası, lamine camları ortamla birlikte, her kuyucuğunda 37 °C'ye ısıtılmış 400 µL komplet ortam içeren 24 kuyucuklu plakalara dikkatlice aktarın ve hücreleri gece boyunca inkübe edin. İlk birkaç saat, 24 saat içindeki hücre sağkalımı için en kritik süredir. Her kuyucuğa nazikçe 0,5 mL komplet ortam ekleyin.İki haftada bir. Besiyerinin yarısını değiştirin. Eğer kültür sararırsa, besiyeri değişimi daha erken yapılabilir ancak değişimler yine de seyrek tutulmalıdır.Dopaminerjik nöronlar bu koşullar altında altı haftadan fazla hayatta kalacaktır. İki haftalık kültürün ardından, tirozin, hidroksilaz ve nöronal markerlara karşı yapılan immünohistokimya, hücrelerin %1'inin dopaminerjik olduğunu göstermektedir. Nöronal projeksiyonlar, ekimden sonraki iki saat içinde ortaya çıkar.Kültürdeki ilk günün sonunda, aksonlar ve dendritler ayırt edilebilir hale gelir. Bu prosedürü takiben, nöronlar nihayetinde altı haftadan fazla hayatta kalır ve kapsamlı bir uzama gösterir. Dopaminerjik nöronlardaki mekanistik soruları yanıtlamak için viral transdüksiyon, immünofloresan veya elektrofizyoloji gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

isolation-culture-long-term-maintenance-primary-mesencephalic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

İlköğretim ayrışmış orta beyin dopamin hücre kültürleri dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için izin verir. Onlar gerçek zamanlı dopamin salınımını kinetik ve dopamin ekzositoz düzenleyicilerin protein / mRNA seviyeleri izlemek için kullanılabilir. Burada, biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin nasıl oluşturmak göstermektedir.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

Bu yüksek bir besleyici hücre glial tabakanın kullanımı olmaksızın prenatal fare beyinlerinden hipokampal nöronlar saflaştırılmış kültürü için bir protokolü sağlar.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri...

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Bu video, fare embriyonik beyin dokusundan dopaminerjik nöronların yetiştirilmesi için bir yöntemi özetlemektedir. İşlem, orta beynin proteolitik bir enzim ile tedavi edilmesini, hücrelerin ayrılmasını ve büyümeleri ve uzun süreli yaşayabilirlikleri için antibiyotiklerle besin açısından zengin bir ortamda polimer kaplı lameller üzerinde kültürlenmesini içerir.

Fare Embriyonik Beyin Dokusundan Dopaminerjik Nöronların Kültürlenmesi ve Bakımı

Video, transgenik bir fare embriyosundan okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların izolasyonunu göstermektedir. Embriyo, kolay görselleştirme ve tanımlama için yeşil bir floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş motor nöronları eksprese eder. Motor nöronlar bir floresan mikroskobu altında cerrahi olarak izole edilir ve bir kültür ortamında tutulur.

Bir Fare Embriyosundan Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü

Video, fare embriyolarının orta beyninden dopamin nöronlarını izole etme ve kültürleme sürecini göstermektedir. İzole edilmiş ventral orta beyin tabanları enzimler kullanılarak ayrıştırılır. Elde edilen dopamin nöronları toplanır ve çok kuyulu plakalar içindeki mikro adalara aktarılır. Hücreler, mikro adaların içinde yüksek yoğunlukta tutmak için bir dopamin nöron ortamı ile inkübe edilir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Dopaminerjik nöronlar beyinde hayati bir düzenleyici rol oynar. Kayıpları Parkinson hastalığı ile ilişkilidir. Bu videoda, embriyonik fare mezensefalondan merkezi dopaminerjik nöronların birincil kültürlerinin nasıl oluşturulacağını gösteriyoruz. Bu tür kültürler, bu nöronların çeşitli streslere karşı aşırı savunmasızlığını incelemek için yararlıdır.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Kullanıma hazır dondurulmuş bir nöron stoğu, sinaptik fonksiyonları değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Burada, 96 delikli bir plaka kullanarak dondurulmuş stoktan kolay, düşük yoğunluklu bir birincil kültürü tanıtıyoruz.

Embriyonik Hipokampal Nöronların Dondurulmuş Stoğunu Kullanarak Kolay ve Tekrarlanabilir Düşük Yoğunluklu Birincil Kültür

Öğrenin, embriyonik kemirgen ventral mezensefalondan primer dopaminerjik nöronların izolasyonu, kültürü ve uzun vadeli bakımı için optimize edilmiş protokolü. Bu yöntem, Parkinson hastalığında nörodejenerasyon mekanizmalarını in vitro ortamda araştırmak amacıyla değerli bir araç sunar.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Daha fazla video keşfet