Um Guia para a geração e uso hiPSC NPCs derivados para o Estudo das Doenças Neurológicas

O objetivo geral deste procedimento é gerar células neuroprogenitoras ou NPCs a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou PSCs altas como uma plataforma para estudar os mecanismos celulares e moleculares que contribuem para doenças neurológicas. Isso é feito primeiro diferenciando PSCs altas usando inibidores de smad duplos em rosetas neurais. O segundo passo é colher essas rosetas neurais e permitir que elas cresçam em populações de N PC expansíveis.

Em seguida, transdução lentiviral com uma infecção por spin. Passo para melhorar a eficiência é usado para manipular a expressão gênica. A etapa final é fazer crescer os NPCs em suspensão para que formem espontaneamente neuroesferas.

Em última análise, esta plataforma pode ser usada para testar uma variedade de fenótipos celulares. Por exemplo, medindo o efeito da manipulação genética na neuromigração. Embora esse método possa fornecer informações sobre mecanismos celulares, como a migração.

Também pode ser aplicado para estudar outros processos biológicos, como replicação, estresse oxidativo, apoptose e crescimento de neuritos. A diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou PSCs altas leva à formação de rosetas neurais visíveis, que são caracterizadas como aglomerados redondos de células neuroepiteliais com polaridade basal aico para a seleção enzimática de rosetas neurais no dia 14. Aspire o meio dos corpos embrionários aderidos ou ebs e adicione um mililitro de reagente de seleção de roset neural por poço de uma placa de seis poços incubada a 37 graus Celsius por uma hora.

Depois de uma hora. Use uma pipeta P 1000 para remover suavemente a enzima de cada poço e adicione um mililitro de D-M-E-M-F 12 por poço. Para lavar as rosetas, colete o mililitro de D-M-E-M-F 12 e expulse-o rapidamente de volta para o poço, destacando assim as rosetas da placa.

Colete as rosetas em um tubo de falcão Pipete mais um mililitro de D-M-E-M-F 12 e expulse-o rapidamente para o mesmo poço para separar as rosetas restantes. Não tente e tente não quebrar os agregados de roseta. Colete as rosetas neurais no mesmo tubo de falcão.

Mais enzima pode ser adicionada e esse procedimento repetido se as rosetas não se desprenderem prontamente quando todas as rosetas neurais forem coletadas. Gire o tubo Falcon a 300 G por três minutos. Aspire a lavagem e resus.

Suspenda as rosetas em dois mililitros de meios de células progenitoras neurais. Transfira as células para uma placa de seis paredes revestida com laminado de poli L ornitina e cresça a 37 graus Celsius por uma semana. Neste laboratório, células progenitoras neurais ou NPCs são cultivadas em placas de matrigel, alimentadas a cada dois dias e mantidas em uma densidade muito alta.

Para dividir os NPCs, primeiro aspire o meio e, em seguida, adicione um mililitro de accutane quente por poço de uma placa de seis poços incubada a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Transfira suavemente as células destacadas para um tubo de 15 mililitros contendo DMEF 12 com o mínimo de estresse mecânico possível. Não tritra as células enquanto estiver na enzima, pulverize as células girando a 1000 G por cinco minutos após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda os NPCs.

Em cerca de um mililitro de meio NPC por poço original de uma placa de seis poços, esperam-se de cinco a 10 milhões de células por poço confluente de uma placa de seis poços após ressuspensão e contagem de células. Substitua os NPCs por aproximadamente um a 2 milhões de células por poço de uma placa de seis poços para manter os NPCs. A eficiência da formação de neuroesferas varia entre o experimento e as linhagens celulares, mas geralmente ocorre melhor se entre 200.000 e um milhão de células estiverem assentadas por poço de uma placa não aderente de seis paredes, se ocorrer aglomeração, reduzir o número de células assentadas Idealmente dentro de um a dois dias após a divisão.

Os NP NPCs devem ser transduzidos com vetores lentivirais ou retrovirais para aumentar a porcentagem de células transfectadas. Use infecção por spin. Aspirar o meio de cada alvéolo e substituir pela superexpressão ou controlo relevante lentivírus ou retrovírus titulados até à multiplicidade desejada de infecção diluída.

Em mídia NPC Use 1,5 mililitros por poço de uma rotação de placa de seis poços a 1000 G e temperatura ambiente por uma hora em uma centrífuga de placa. Após a centrifugação, coloque a placa de volta na incubadora para reduzir a morte celular. Substitua a mídia dentro de oito horas após a infecção por spin.

Comece este procedimento lavando as NEUROESFERAS derivadas de NPC uma vez em meios NPC para remover detritos celulares. Incline a placa em um ângulo de 45 graus e deixe as neuroesferas assentarem e, em seguida, remova o máximo de mídia possível sem aspirar as neuroesferas. Substitua por mídia nova.

Em seguida, escolha manualmente as NEUROESFERAS derivadas de NPC sob um microscópio usando uma pipeta P 200 para transferir uma esfera de neuros para cada poço de uma placa de 96 poços revestida com matrigel. É importante escolher neuroesferas de tamanhos semelhantes para reduzir a variabilidade nos resultados. Adicione mais 0,5 miligramas de gel matri diluído em meio NPC frio às neuroesferas em cada placa de 96 poços.

Usando uma ponta de pipeta, centralize manualmente cada esfera neurosférica individual no meio do poço Permita que a migração da esfera neurosférica ocorra por 48 horas. Depois de fixar e colorir as células com os marcadores imuno-histoquímicos desejados, fotografe as neuroesferas em sua totalidade usando uma objetiva de microscópio Forex. Para medir a migração radial, use o software de imagem J.

Use a ferramenta de seleção à mão livre para traçar manualmente a borda das células migratórias mais distantes. Certifique-se de que a área esteja marcada na janela de medidas definidas encontrada na guia de análise. Em seguida, use a função de medida para calcular a área da forma resultante.

Use o valor da medida da área e a equação da área de um círculo para determinar o raio externo da mesma maneira, trace a borda da neuroesfera original. Meça a área e calcule o raio interno. Calcule a migração radial total como a diferença entre os raios externo e interno.

Essas imagens mostram os estágios de alta diferenciação neural de PSC de PSCs altas para corpos embrionários, rosetas neurais, NPCs e neurônios validados NPCs expressos, o aninhamento do marcador NPC e o fator de transcrição de células-tronco neurais SOX dois na maioria das células. A coloração de beta-três tubulinas também é visível em todas as populações de NPCs. Os NPCs também expressam o fator de transcrição de células-tronco neurais PAC seis e o marcador progenitor de quatro cérebros.

TBR dois, mas não marcadores do mesencéfalo, como LMX um A e FOX A dois NPCs podem se diferenciar em 70 a 80% de neurônios positivos para beta três tubulinas mostrados em verde e 20 a 30% de astrócitos positivos para proteínas ácidas fibrilares gliais mostrados em vermelho, PSC alto de alta qualidade. Os NPCs expressam neston e SOX dois na maioria das células, enquanto os NPCs de baixa qualidade têm manchas de SOX dois negativos e aninham-se apenas em células negativas. Os neurônios de quatro semanas de idade diferenciados de NPCs de alta qualidade expressam o mapa dois AB e beta três turbulentos.

Após transdução bem-sucedida com um vetor lentiviral ou retroviral de alto título. Mais de 80% das células são marcadas pelo repórter fluorescente. Incluída na geração de neuroesferas vetoriais produz uma população de neuroesferas de tamanho relativamente homogêneo, que podem permanecer saudáveis em cultura por aproximadamente uma semana.

Com alimentação regular, a migração de neuroesferas ocorre de forma robusta em neuroesferas saudáveis, conforme ilustrado por essas imagens de campo claro antes e depois de 48 horas de migração em matrigel após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da esquizofrenia explorarem a neuromigração em NPCs derivados de células-tronco LP induzidas por humanos. Não se esqueça de que trabalhar com um retrovírus pode ser potencialmente perigoso e todo o trabalho de cultura de tecidos deve ser feito em BL dois mais condições quando o vírus está potencialmente presente.