Name: Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: למד עריכת גנים ב-iPSCs אנושיים באמצעות TALEN לשילוב מכוון של GFP באתר AAVS1. הפרוטוקול כולל נוקלאופקציה, בחירה בפוארומיצין וקטיף מושבות ליצירת קווי תאים יציבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן המשותפת של ה-NIH ותוכנית המחקר התוך-מוראלית של המכון הלאומי לדלקת מפרקים, מחלות שרירים ושלד ועור.

1. הכנת ממברנה מטריקס מרתף וציפוי של Plasticware <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מניית מטריקס קרום במרתף הקפואה מ-20 ° C על קרח ולהפשיר לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפשרה, aliquots פיפטה 2 מ&quot;ג של מטריצת קרום במרתף לתוך צינורות eppendorf טרום צוננים. אחסן אלה ב -20 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף, להפשיר aliquot אחד על קרח עד החתיכה האחרונה של קרח בנעלם צינור Eppendorf (בדרך כלל תוך ~ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפשרה, להוסיף מטריצת קרום במרתף 12 מיליליטר של DMEM / F12 הקר (4 מעלות צלזיוס) כדי להפוך את פתרון ציפוי מטריצת קרום במרתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון מטריצת קרום במרתף לכלי התרבות המתאימים. לצלחת 6-היטב, לוותר 1 מ&quot;ל לכל טוב. לערבל את הצלחת לוודא פתרון מטריצת הקרום במרתף מכסה לחלוטין כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm לאטום את הצלחת / המנה מצופה מטריצת קרום במרתף, ולדגור על רוטמפרטורה מ &#39;במשך שעה 1 לפני השימוש. לחלופין, צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף חנות / מנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 2 שבועות של ציפוי. הערה: הוספת DMEM / F12 נוסף לצלחת / המנה מצופה מטריצת קרום במרתף כדי למנוע התייבשות. לפני שימוש 4 ° C צלחת / מנה מצופה מטריצת קרום במרתף מאוחסן, למקם אותו בארון בטיחות ביולוגי ולאפשר להם להגיע לטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטריצת קרום במרתף לשאוב לפני התוספת של מדיום ותאים לחלוטין. </li></ol> 2. הכנת בינונית E8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות E8 על ידי הפשרת תוספת E8 הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 מיליליטר של מדיום בסיס E8 מהמניות 500 מיליליטר וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה כל בקבוקון 10 מיליליטר של תוסף E8 ישירות לתוך 490 מיליליטר של מדיום בסיס E8. האם מדיום E8 מלא לא חם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, כמו תנודות טמפרטורה חוזרות ונשנות יכולות לבזות את bFGF במכלוליםבינוני te E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בינוני E8 מלא בתוך 2 שבועות של תוספת של התוספת. </li></ol> 3. הפשרה של iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של iPSCs הקפוא מהחנקן נוזלי ומניחים על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס; לערבל את הבקבוקון באמבט המים עד שבר זעיר בלבד של שרידי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס הבקבוקון עם 70% אתנול והעברה לארון בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של dropwise הבינוני טמפרטורת חדר E8 ישירות לבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 2 מיליליטר, להעביר את dropwise ההשעיה תא לתוך 9 מיליליטר של מדיום E8 בצינור חרוטי 15 מיליליטר. לערבל את הצינור לעתים קרובות כדי להבטיח שהתאים ובינוניים מערבבים היטב במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, וresuspend התא גלולה בנפח מתאים של E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את התאים למספר מתאים של מרתף membranמצופי מטריצת דואר בארות, ומקום ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה. מומלץ צלחת לפחות 0.2 x 10 6 iPSC לכל טוב של 6-גם צלחת כדי לאפשר התאוששות מהירה לאחר הפשרה. </li></ol> 4. תחזוקה וPassaging השגרתי של iPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן בינוני E8 יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על המורפולוגיה וconfluency של תאים עם מיקרוסקופ הפוכה. iPSCs באיכות גבוהה גדל במושבות שטוחות עם גבולות ברורים; מושבות בודדות להחזיק הופעה &quot;כמו מרוצפת-&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאי iPSCs כאשר הם מגיעים ~ confluency 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון passaging EDTA על ידי הוספת 0.9 g NaCl ו -500 EDTA μl 0.5 M 500 מיליליטר DPBS. מערבבים היטב כדי לפזר NaCl, ומסנן אבק לעקר. לחמם aliquot של פתרון passaging באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני passaging. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעבר, לשאוב בילה בינוני תרבות תאים לשטוף פעם אחת עם נפח שווה של pas החםsaging פתרון. לשאוב, ומספיק EDTA פיפטה פתרון passaging למעייל התאים (1 מיליליטר לכל טוב של 6-גם צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה ולבחון את מושבות iPSC. המראה של חורים בתוך מושבות וגבולות מורמים יתברר בתוך 2 עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב פתרון passaging EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, לוותר 4 מיליליטר של מדיום E8 (אם משתמש בצלחת 6-היטב) בלחץ גבוה ישירות לתוך זה גם להיות passaged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את גושי iPSC, ומחולק למספר מתאים של בארות בהתאם ליחס הפיצול בין 1: 8 ל01:12. לא, כמו פירוק של גושי תאים יגרום יתר פיפטה בכדאיות עניה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממה, ולטלטל את הצלחת בחזרה-ושוב וכמה פעמים מצד לצד כדי לפזר את התאים. </li></ol> 5. הכנת MEFs וiPSCs לTansfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לפני transfection, iPSCs המעבר ב ~ 1: 6 לארבע או יותר בארות צלחת 6-גם מצופי מטריצת קרום במרתף, כך שהם יהיו מחוברים% 70 יומיים ומכאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להפשיר MEFs DR4 לתוך מדיום MEF בהיקף של DMEM (גלוקוז גבוהה) בתוספת 10% FBS ו1x MEM-NEAA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת MEFs DR4 לשתי מנות של 10 סנטימטר ב ~ 2 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection, לשנות בינוני MEF לE8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 30 דקות לפני ביצוע transfection על iPSCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: אם ניתוח התזרים cytometric של לאחר transfection iPSCs הוא רצוי, להסיר את צלחת קרום במרתף מצופה מטריצה ​​מ4 ° C ומקום בטמפ &#39;החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: 4 שעות לפני transfection, מוסף תרבות iPSC מראש transfection עם Y-27632 בריכוז הסופי של 10 מיקרומטר. </li></ol> 6. עדין-תא דיסוציאציה מגיב לטיפולnd Transfection של iPSCs באמצעות מערכת Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון transfection התא ראשוני P3 מ4 ° C ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ~. להוסיף את תוספת 100 μl השלם לפתרון transfection לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב חם עדינים תאי ניתוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 וPZT-AAVS1-R1) תורם וAAVS1-CAG-EGFP מ-20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר iPSCs מן החממה ולשטוף פעם אחת עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מגיב ניתוק עדין תאים לכל טוב, ודגירת iPSCs על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, או עד שיותר מ -50% מהתאים ניתקו מכלי התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים בעזרת פיפטה p1000 לנתק את כל תאים שנותרו מספינת התרבות, וכדי לשבור את גושי iPSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של מדיום E8 היטב כל אחד, ופיפטה מספר פעמים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לפיורדאאה disaggregate גושי תאים לתאים בודדים הערה: יעילות Transfection יורדת באופן משמעותי אם גושי תא אינם מספיק מפוצלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף iPSCs בצינור חרוטי 15 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 3 דקות 100 XG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, ותאים גלולים בסכום מינימאלי של מדיום E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer לאחר היישום של כתם חיוני כמו 0.4% Trypan כחול. ודא כי תאים הם ניתקו מספיק תוך ספירת (1-3 תאים לכל &quot;גוש&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 3 x 10 6 תאים לכל אחד משני צינורות חרוטי 15 מיליליטר, וספין למטה שוב ב 100 XG במשך 3 דקות. הערה: צנטריפוגה במהירות נמוכה מפחיתה את מתח התא ומאפשרת מחדש השעיה קלה של iPSCs לפני electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת electroporation לתכנית הספציפית תאים מהסוג לקו העוברי האנושי בתאי גזע H9 (תכנית CB-150). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant מcelכדורי l. לגלולה אחת, להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR כמדגם שליטה. לגלולה אחרת להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR, יחד עם 5 מיקרוגרם של כל Talen (PZT-AAVS1-L1 וPZT-AAVS1-R1) כמדגם ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל תא גלולה בפתרון של transfection התא הראשוני P3 100 μl, ולהעביר לקובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את transfection ולהוסיף מייד 500 μl של מדיום E8 טמפרטורת חדר לכל קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את dropwise iPSCs transfected לצלחת 10 סנטימטרים אחד המכילה MEFs DR4 מוכן בשלב 5.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להוסיף כמה טיפות מכל ניסוי ולאחת מצלחת 6-היטב מצופה מטריצת קרום במרתף אם זרימת cytometry anaylsis של יעילות transfection היא רצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.15-6.17 לסיים שתי הדגימות. למחרת, לשטוף תאים עם DPBS פעמיים ולעבור מדיום התרבות NutriStem, המופיע לתמוך תרבות iPSC על מתקני האכלה טובות יותר מאשר E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trפסגות ביטוי EGFP ansient ב48 עד 72 שעות לאחר transfection; להעריך את יעילות transfection כרצוי. </li></ol> 7. puromycin בחירה של iPSCs הממוקד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין בחירת puromycin 72 שעות לאחר transfection כאשר iPSCs להגיע 70% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לNCRM5 iPSCs, יתחיל בחירת puromycin ברמה של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin (1/2 מנה המלאה) המדולל למדיום תרבות NutriStem. ריכוז puromycin האופטימלי עשוי להשתנות מ0.25 ל1 מיקרוגרם / MLL לכמה קווי iPSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs תרבות ב0.5 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin NutriStem + במשך 3 ימים, מרענן הבינוני יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 ימים, להגדיל את הריכוז של puromycin ל1 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs תרבות תחת 1 מיקרוגרם / בחירת puromycin מיליליטר במשך 7 עד 8 ימים נוספים, או עד מושבות שונות מופיעים גדולה מספיק למסיק מושבה. </li></ol> 8. מושבה קטיף והרחבה של iPSCs הממוקד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום במרתף שימושמטריצה ​​למעייל צלחת 96-היטב על ידי מחלק 50 μl של פתרון ציפוי מטריצת קרום במרתף (מטריצת קרום במרתף 2 מ&quot;ג המדולל ל -12 מיליליטר DMEM / F12) לתוך כל טוב. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שאפשר את הצלחת מצופה מטריצת הקרום במרתף כדי להגיע לטמפרטורת חדר, לשאוב את מטריצת הקרום במרתף ולוותר 100 μl E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מיקרוסקופ הפוכה לארון בטיחות ביולוגי, ולרסס קל עם 70% EtOH לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך זכוכית פיפטה פסטר מעל מבער בונזן להשיג כלי המושבה קטיף אידיאלי שיש לו &quot;וו&quot; זעיר בקצה. לעקר עם 70% EtOH, ואת המקום במכסת המנוע לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת המכילה מושבות iPSC ממוקדות מהחממה, ואת המקום לתוך מכסה המנוע מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר iPSCs על ידי התחקות מעגל סביב גבול המושבה עם כלי קטיף המושבה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב&quot; הוו &quot;של כלי המושבה הקטיף כדי לגרד בעדינות ולהסיר את המושבה iPSC מפני שטח של הצלחת. למושבות גדולות יותר, ציור X עם כלי קטיף המושבה לרבעון המושבה תקל תא צמיחה לאחר מחדש ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגושי תאים מנותקים וצפים בחופשיות, להשתמש פיפטה p200 מוגדרת ~ 30 μl לאסוף iPSCs. פלייט תאים ישירות לתוך צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להשתמש פיפטה P20 מוגדרת ~ 5 μl לאסוף iPSCs לתוך צינור eppendorf, ולאחר מכן להוסיף 50 μl מגיב ניתוק עדין תאים לעכל במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר עיכול, להוסיף בינוני E8 500 μl לתוך צינור eppendorf לדלל מגיב ניתוק העדין-תא ולסובב את התאים ב XG 200 בmicrocentrifuge טבלה העליון סטנדרטי למשך 5 דקות. אז לשאוב ביותר של המדיום ולהשאיר ~ 30 μl לresuspend ולהעביר את התאים לתוך הצלחת 96-היטב. הערה: זוגישה תקל על הניתוק של גוש התא והתרחבות מהירה של מושבה הרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך קטיף מושבה עד מספר מספיק של מושבות iPSC נאספו (בערך 20-30 מושבות לכל ניסוי מומלץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קטיף מושבה, למקם את צלחת 96-היטב באינקובטור במשך לילה. רענן עם מדיום מלא E8 למחרת, ותרבות ומחוברות עד ~ 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר מ96-היטב לתוך 24 גם, אז ל6-גם, כפי שמתוארים בשלבי 4.5-4.10. הערה: הכרכים של פתרון EDTA ובינוני E8 צריכים להיות מופחתים באופן יחסי בעת שימוש בבארות קטנות יותר מצלחת 6-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך הצלחת מיקוד בצומת PCR וניתוח כתם דרום כדי לאשר שילוב ממוקד קלטת והעדר וקטורים הוכנסו באופן אקראי 16. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust%2C+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li>
<li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+insulator+in+AAVS1%2C+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+by+AAVS1+Transcription+Activator-Like+Effector+Nucleases.+Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells%3A+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li>
<li>Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.stembook.org/node/1438">http://www.stembook.org/node/1438</a> (2008-2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר עבור הדור המוצלח של נמל בטוח AAVS1 ממוקד iPSCs האנושי: (1) ביעילות מספק פלסמידים Talen ותורם לiPSCs ידי transfection; (2) אופטימיזציה של הניתוק של iPSCs לתוך תאים בודדים לפני transfection וציפוי צפיפות לאחר transfection; (3) אופטימיזציה של מינון וזמן של סמים-בחירה מבוססת על הצמיחה של קו iPSC; (4) לנתח בזהירות ולקטוף מושבות ממוקדות והעברה לצלחת חדשה / טוב. בהשוואה לשיטות דומות בשימוש בנייר של Hockemeyer 10, פרוטוקול זה משמש זוג קוד הפתוח AAVS1-TALEN...

היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לתאים כמו תאי גזע עוברי הנגרמים גזע pluripotent (iPSCs) התגלה לראשונה על ידי et al טקהאשי. בשנת 2007 1. Fibroblasts עורי אדם transduced עם רטרווירוסים להביע ארבעה גורמי שעתוק (יאמאנאקה מה שזכה לכינוי גורמי Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, וKlf4) הוצג להיות דומה מאוד לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) המבוססים על מורפולוגיה, הפצה, ביטוי גנים, ומעמד אפיגנטיים; באופן מכריע, iPSCs גם מסוגל להבדיל לתאים של כל שלוש השכבות הנבט 1. הקיבולת הפוטנציאלית ובידול השגשוג של iPSCs גורמת להם כלים מאוד אטרקטיביים; על ידי תכנות מחדש של תאים מחולים הסובלים ממחלות מסוימות, יכול לשמש גם כiPSCs מערכות במבחנה מודל מחלה וכמו הרפוי פוטנציאלי. לצורך האחרון, כמה בעיות יש לטפל לפני את מלוא הפוטנציאל של iPSCsבסביבה קלינית יכול להתממש; הפוטנציאל הסרטני במבחנה של hESCs התרבותי וiPSCs, השימוש בנגזרי xenogenic במהלך תכנות מחדש ותחזוקת תא, והצורך לעקוב אחר תאים מושתלים in vivo כל המכשולים הקריטיים ליישום הקליני בתאי גזע pluripotent (נבדק על ידי et Hentze ב. 2). פתרון אידיאלי לצורך מעקב אחר תאים מובחנים לאחר ההשתלה יהיה כרוך סמן חזותי לגילוי שמתנגד השתקה ואת הגיוונים ללא תלות ביישום. ביטוי חזק ומתמשך של transgenes המשולב הוא הכי בקלות להשגה כאשר DNA אקסוגני מוחדר לוקוסים בטוח נמל; כלומר, אתרים הגנומי המאפשרים שעתוק מספק של וקטור משולב ובו בזמן מיתון הפרעות ביטוי בגנים 3 שכנים. אתר אחד כזה שהתאפיין גם מאוד מאז גילויו הוא integr וירוס adeno הקשוריםאתר ation 1 (AAVS1), באינטרון הראשון של 1 12C מקטע הרגולציה גן phosphatase החלבון (PPP1R12C). מוקד זה הוכח לא רק כדי לאפשר ספג וביטוי חזק של transgenes המשולב בזמן הוארך בתרבות ובבידול המבחנה 3, אלא גם כדי להגן מקיפים גנים מהפרעות תעתיק 4; שני התכונות נחשבות בשל נוכחותם של אלמנטים המבודדים הכרומטין אנדוגני איגוף אתר AAVS1 5. התקדמות בכלים הנדסי הגנום מעל רק בעשור האחרון הקלה באופן משמעותי את קלות ויעילות שבה ניתן להשיג מניפולציות גנטיות בכל סוג תא. בעוד ניסויים מוצלחים מוקדמים הסתמכו על רמות נמוכות ביותר של רקומבינציה אנדוגני ההומולוגית (HR) עם תורם הציג להשיג גן המיקוד בESCs 6,7, השימוש בnucleases אתר ספציפי, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs), שsignificantly לגרום רקומבינציה ההומולוגית באמצעות הדור של הפסקת פעמיים תקועים DNA גדל היעילות של ניסויים כאלה 8,9 מאוד. Repurposing של שתי effectors כמו activator-השעתוק (הסיפורים) של סוגי Xanthomonas פתוגניים צמח וחוזר פרוקריוטים התקבץ interspaced באופן קבוע הקצר palindromic / מערכת Cas9 לnucleases מעצב אתר ספציפי יעיל (CRISPR) הפך גן מיקוד בתאי גזע pluripotent ונגיש מתודולוגיה מעשית 10-13. מאמר האחרון שתואר שיטה יעילה לשילוב היציב של קלטת כתב ניאון ירוקה למוקד בטוח נמל AAVS1 בiPSCs האנושי באמצעות nucleases TALE (TALENs) 14. iPSCs הממוקד אלו שומרים על הקרינה שלהם גם לאחר התמיינות מכוונת לשריר לב והשתלה לתוך מודל עכבר של אוטם שריר לב (MI), מתן ראיות חזקות לשירות כזהיציבות בתאי גזע pluripotent ניאון 14. כדי להשיג מושבות ממוקדות, שיטת גן-מלכודת שימשה בי שחבור-acceptor (SA), רצף הפפטיד ביקוע עצמי 2A מציב את puromycin N-אצטיל-transferase הגן (PAC) תחת השליטה של אמרגן PPP1R12C אנדוגני; כך, רק iPSCs ששלב תורם DNA במוקד AAVS1 להביע PAC, טיוח אותם לבחירה המבוסס על puromycin התנגדות; (איור 1, 15). פרוטוקול זה מפרט את הנהלים של יצירת AAVS1-GFP iPSCs דיווח בעיתון האחרון 14, כולל התהליך של transfecting iPSCs עם TALENs ותורם 9.8 kb לשלב קטע DNA 4.2kb למוקד AAVS1 בטוח-הנמל, בחירת iPSCs המבוססים על puromycin-התנגדות, ומושבות קטיף להרחבה משובט. הטכניקות המתוארות במסמך זה יכול להיות מיושם על ניסויי הנדסה גנטית רבים.

<table><tbody><tr><td>מטריצת ממברנת הבסיס של Matrigel Growth Factor Reduced (GFR), *ללא LDEV, 10 מ"ל</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>חנות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>חנות ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear TC-Treated TC Multiple Well Lights</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>לאחסן את המדיום הבסיסי ב-4 מעלות</td></tr> צלזיוס.<tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>חנות בטמפרטורת החדר. לאחר המסה ב-H2O, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 מ' EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ קורנינג תרבית מטופל</td><td></td> TC <td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR -</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>אקדמי אחסון בחנקן נוזלי.</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>חנות ב -4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מוגדר,</td><td>HyClone</td> ממקור ארה"ב <td>SH30070.03</td><td>חנות ב -20 & מעלות צלזיוס הפשרה ב -4 מעלות; C לילה ו-aliquot. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד הצורך.</td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)</td> <td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>יחידת ליבת נוקלאופקטור 4D&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>חלק ממערכת האלקטרופורציה</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X unit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>חלק ממערכת האלקטרופורציה</td></tr><tr><td>P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>עם ההגעה, הסר את תמיסת התא הראשוני והשלם ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>חנות ב -20 מעלות צלזיוס הפשרה למשך הלילה ב -4 מעלות; C ולחמם aliquot ב -37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF Culture Medium</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>חנות ב-20 מעלות צלזיוס. C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 ו-pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 ו-52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP תורם רקומבינציה הומולוגית</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>אחסן ב-20 &deg;C. הכן ציטוטי עבודה של 1 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O.</td></tr><tr><td>חד פעמי בורוסיליקט זכוכית פסטר פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (מקורר), 120 V 60 הרץ</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 & פעמים; 750 מ"ל דלי מתנדנד רוטור</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent talen-ממוקד עם גן gfp לsafe harbor aavs1

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

תוספת טרנסגנים ממוקדת יכולה לספק ביטוי גנים מתמשך תוך עקיפת השתקת הגנים ומוטגנזה הנגרמת על ידי אינטגרציה אקראית בתיווך וקטור ויראלי. פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת הוספה ממוקדת טרנסגנים אוניברסלית ויעילה ב-iPSCs אנושיים המבוססת על שימוש ב-TALENs מאומתים בקוד פתוח ותורם דמוי מלכודת גנים כדי להעביר טרנסגנים למקום נמל מבטחים. חשוב לציין, עריכת גנים יעילה מוגבלת בקצב על ידי יעילות המסירה של וקטורים לעריכת גנים. לכן, פרוטוקול זה מתמקד תחילה בהכנת iPSCs לטרנספקציה כדי להשיג יעילות שיגור גרעינית גבוהה. כאשר iPSCs מפורקים לתאים בודדים באמצעות ריאגנט דיסוציאציה עדין של תאים ומועברים באמצעות תוכנית אופטימלית, ניתן לגרום ל->50% מהתאים לקלוט את הווקטורים הגדולים לעריכת גנים. מכיוון שלוקוס AAVS1 ממוקם באינטרון של גן פעיל (PPP1R12C), נעשה שימוש בגן עמיד לפורומיצין (PAC) המקושר לשחבור (SA) לבחירת iPSCs ממוקדים תוך אי הכללת תאים אקראיים לאינטגרציה בלבד ולא מועברים. אסטרטגיה זו מגדילה מאוד את הסיכוי להשיג שיבוטים ממוקדים, וניתן להשתמש בה גם בניסויים אחרים של מיקוד גנים פעילים. שבועיים לאחר בחירת הפורומיצין במינון המותאם לקו ה-iPSC הספציפי, שיבוטים מוכנים לאיסוף על ידי חיתוך ידני של מושבות גדולות ומבודדות לחתיכות קטנות יותר המועברות למדיום טרי בבאר קטנה יותר להרחבה נוספת ובדיקה גנטית ותפקודית. ניתן לעקוב אחר פרוטוקול זה כדי להשיג בקלות קווי iPSC מרובים של מדווח GFP שימושיים להדמיה in vivo ו-in vitro ובידוד תאים.

הדמיה של הפרוטוקול מסופקת באיור 2, עם תקופות בי iPSCs בתרבית בינונית שונה מודגש על ידי שני ירוקים לE8 או הכחול לNutriStem. חשוב transfect רק iPSCs באיכות גבוהה; לבחון מנות תרבות ברחבי תחזוקה שוטפת ולוודא שתרבויות iPSC מכילות מושבות בעיקר ברורות נושאות מורפולוגיה כמו מרוצפת (איור 3 א); תאים מובחנים לא צריכים לכבוש יותר מ -10% מהתרבות. Transfectability של iPSCs מוערך ומותאם באמצעות הווקטור הקטן Pmax-GFP (איור 4 א-B), כtransfection ע...

עריכת גנים בתיווך TALEN בלוקוס AAVS1 בנמל המבטחים מאפשרת הוספת טרנסגנים ביעילות גבוהה ב-iPSCs אנושיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת iPSCs להעברת TALEN וקטור תורם, טרנספקציה של iPSCs ובחירה ובידוד של שיבוטי iPSC כדי להשיג אינטגרציה ממוקדת של גן GFP ליצירת קווי דיווח.

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להפיק שיבוטי תאי גזע רב-עוצמה מושריים (iPSC) בודדים, המבטאים GFP, באופן ממוקד ב-safe harbor אחד מסוג AA vs one. דבר זה מושג תחילה על ידי העברה יעילה של AAVs one talons ושל פלסמידי תורם A VS one C-A-G-E-G-F-P לתוך תאי IPC באמצעות נוקלאופקציה. בשלב השני, התאים הממוקדים מסוג A a vs one נבחרים באמצעות pur mycin על תאי מזיני עובר של עכבר.בשלב הבא, קלונים בודדים המבטאים GFP ומכוונים ל-AAVS1 מועברים לצלחת 96 בארות מצופה ב-matrigel. בשלב הסופי, קלוני AAVS1 GFP-iPSC מורחבים באמצעות מצע E8 וטכניקות סטנדרטיות לתרבית iPSC. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ובציטומטריה עם זרימה כדי להראות ביטוי אחיד וחזק של GFP בקלוני iPSC אנושיים המכוונים ל-AAVS1.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי בידוד המושבות כוללים מיקרו-דיסקציה של שיבוטים מטרתיים באמצעות כלי בידוד מושבות מיוחדים תחת מיקרוסקופ, דבר שקשה ללמוד במהלך הדרכה צמודה. התחל בשטיפה של תרביות ה-IPSC פעם אחת בכל פעם עם PBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של reagent לפירוק תאים עדין בטמפרטורה של 37 °C לכל באר, והדגר את התאים ב-37 °C למשך כחמש דקות, עד שיותר מ-50% מהתאים יתנתקו מכלי התרבית.השתמשו בפיפט P 1000 כדי לפרק באופן מכני גושי תאים שנותרו או תאים דבוקים. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מצע E eight לכל באר והשתמשו בפיפט של 10 מיליליטר כדי לפרק עוד יותר את התרביות לתליות של תאים בודדים. כעת, רכזו את התאים שנאספו לשפופרת קונית של 15 מיליליטר והסמירו אותם בצנטריפוגה.יש להשעות מחדש את המשקע בכמות מינימלית של מצע E8 לצורך ספירה. לאחר אישור חיות התרביות באמצעות דחיית trypan blue, וכן אישור דיסוציאציה מספקת, העבר 3 מיליון תאים לכל אחד משני מבחנות קוניות של 15 מיליליטר. בזמן סבב התאים בצנטריפוגה, הגדר את מערכת האלקטרופורציה לתוכנית הספציפית לסוג התאים של קו תאי הגזע העובריים האנושיים H9. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוגרם של התור לרקומינציה הומולוגית לבדו למשקע אחד עבור דגימת הביקורת, ו-10 מיקרוגרם של פלסמיד התור לרקומינציה הומולוגית, יחד עם 5 מיקרוגרם מכל פלסמיד talen, עבור הדגימה הניסויית.בשלב הבא, הוסף 100 µL של תמיסת P three להעברה של תאים ראשוניים (complete P three primary cell transfection solution) בטמפרטורת החדר לכל אחת מהמשקעים של הביקורת ושל הניסוי, וערבב מחדש את התאים. העבר את הדגימות לקובטות נפרדות ובצע את ההעברה (electroporation) של הדגימות מיד לאחר הטרנספקציה. הוסף 500 µL של מצע E eight בטמפרטורת החדר לכל קובטה, ולאחר מכן העבר את דגימות ה-iPSC שעברו טרנספקציה בטפטוף לצלוחיות נפרדות של 10 cm המכילות DR four mouse embryonic fibroblasts. לפני בידוד המושבות, ציפ את כל באער של פלטת 96 באערים עם 50 µL של תמיסת basement membrane matrix, ואחסן את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עד למחרת בבוקר.כאשר הפלטה תגיע לטמפרטורת החדר, שאבו את עודפי התמיסה ומלאו כל באר ב-100 µL של מצע E eight מועשר ב-10 µM של Y 2 7 6 3 2. לאחר מכן, הניחו מיקרוסקופ הפוך בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית ועקרו אותו בעזרת ריסוס קל של 70% ethanol. לאחר מכן, החזיקו פיפטת פסטור מזכוכית מעל מבער בונסן כדי ליצור כלי לבחירת מושבות עם וו קטן בקצה, לאחר עיקור ב-70% ethanol.הניחו את וו התלייה במנדף לייבוש, ולאחר מכן הניחו את תרבית ה-IPSE על במת המיקרוסקופ לצורך בידוד של קלונים. אתרו מושבה מתאימה תחת הגדלה נמוכה והשתמשו בכלי לבחירת מושבות כדי לסמן אותה ולחלק אותה לרבעים. לאחר מכן, גרדו בעדינות את רבע המושבה מכלי התרבית והשתמשו בפיפט P 200 המכוון לכ-30 microliters כדי לאסוף את תאי ה-IPCs הצפים בחופשיות, והעבירו את התאים ישירות אל מטריצת ממבס הבסיס (basement membrane matrix).בזמן קצירתם, ה-iPSCs צריכים להיקשר תוך שעתיים עד ארבע שעות מההזרעה. לבסוף, דגרו את המושבות שנבחרו למשך לילה ב-37 °C ורעננו את התאים עם מצע E8 מלא למחרת בבוקר. חשוב לבצע טרנספקציה רק ל-iPSCs באיכות גבוהה לאורך כל הניסוי.תרביות ה-IPSC צריכות להכיל בעיקר מושבות נפרדות בעלות מורפולוגיה דמוית cobblestone כפי שנראה בתאים כאן, והתאים המובחנים לא צריכים להוות יותר מ-10% מהתרבית; ניתן להעריך ולבצע אופטימיזציה ליכולת הטרנספקציה של ה-IPCs באמצעות וקטור PAX GFP קטן, שכן טרנספקציה עם PAX GFP מייצגת בדרך כלל את היעילות המקסימלית שניתן להשיג הודות לגודלו הקטן. הביטוי הזמני של A VS one C-A-G-E-G-F-P intel ב-IPCs שעברו טרנספקציה מגיע לשיאו 48 עד 72 שעות לאחר הטרנספקציה, דבר שניתן לאשש באמצעות חלק קטן מהתאים שעברו טרנספקציה על ידי ציטומטריית זרימה. יעילות הטרנספקציה עשויה להשתנות במידה ניכרת.אפילו בניסויים עם A, רק 10% מהfraciton חיובית ל-GFP. שיבוטים בודדים המראים פלואורסצנציה אחידה צריכים להיות גדולים מספיק לבחירת מושבות לאחר סלקציה של pure mycin. יתרה מכך, ברגע שהם בפורמט של 96 בארות, שיבוטי ה-iPSC המותירים שהורחבו צריכים להפגין ביטוי יציב ואחיד של GFP. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע טרנספקציה של iPSCs ביעילות באמצעות nuclear affection וכיצד לבודד AV one safe harbor.בידוד ממוקד של שיבוטי IPSE באמצעות כלי בחירת מושבות.

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

למרות הפיתוחים אחרונים בהתאמה גנטית, transfection של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נותר תהליך גחמני. למיטב ידיעתנו, שיטות שיטתיות ויעילות לתאי אדם transfect מושרים pluripotent גזע (iPSCs) לא דווחה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עמידים ביעילות transfect וnucleofect iPSCs אדם.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

סרטון זה מתאר טכניקת עריכת גנום מדויקת בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, או hiPSCs, תוך שימוש ב- TALENs כדי ליצור שברים דו-גדיליים בלוקוס ממוקד, ולגרום לתיקון מכוון הומולוגיה לשילוב גנים של חלבון פלואורסצנטי.

שילוב גנים ממוקד בתיווך TALEN: שימוש בנוקלאזות ספציפיות לרצף מהונדס להחדרה מדויקת של גן חלבון פלואורסצנטי לתוך hiPSCs

אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתוכנתים מחדש ומאופיינים ללא גורמים והמרה למצבים קליניים משוערים.

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

כאן אנו מדווחים על שיטת עריכת גן מהירה ויעילה מבוססת על RMCE שעבר על מקורות AAVS1 של תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) המשפרת על מערכות שתוארו לעיל. באמצעות טכניקה זו, קווי isogenic יכולים להיוצר במהירות ובאמינות ללימודים השוואתיים נכונים, הקלת מחקר בתיווך transgenesis עם hPSCs.

הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב<em&gt; AAVS1</em&gt; לוקוס

המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור תיוג endogenously לידי ביטוי חלבונים עם תגי פלורסנט בתאי גזע pluripotent המושרה האנושי באמצעות CRISPR/Cas9. תאים putatively הערוך מועשרים ידי קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא, שורות תאים המשובטים נוצרים.

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

אסטרטגיות חדשניות למודל נאמן של מוטציות סומטיות בתאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) נחוצות כדי לחקור טוב יותר ביולוגיה של תאי גזע המטופויאטיים וממאירויות המטולוגיות. כאן מתואר פרוטוקול למודל מוטציות רווח הטרוזיגוטיות ב-HSPCs על ידי שילוב השימוש ב-CRISPR/Cas9 והתמרה כפולה של תורמי rAAV.

הנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות אונקוגניות בתאי גזע המטופויאטיים אנושיים ובתאי אב

למד עריכת גנים ב-iPSCs אנושיים באמצעות TALEN לשילוב מכוון של GFP באתר AAVS1. הפרוטוקול כולל נוקלאופקציה, בחירה בפוארומיצין וקטיף מושבות ליצירת קווי תאים יציבים.

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

גלה סרטונים נוספים