Name: Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Lernen Sie ein humanes Knochengewebemodell zur Untersuchung von Brustkrebszellmigration, -proliferation und -besiedlung im metastatischen Nische. Diese Methode nutzt Biolumineszenz- und Fluoreszenzmikroskopie.

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Diese Studien wurden finanziert zum Teil durch Zuschüsse aus dem Alternative Forschungs- und Entwicklungsgemeinschaft (107.588), das National Institute of Health (1U54CA136465-04S1) und dem California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Wir danken Drs. Andrew Wilber und R. Scott McIvor für die großzügige Spende ihrer <pkt2 lubig=""> transponson und pK / hUbiC-SB11 Transposase Plasmide. Wir danken John Tamaresis, Ph.D. Rat der statistischen Methoden, Timothy Brown für die Durchführung der Durchflusszytometrie, Georgette Henrich für die Beratung über Migrationen Assays und Nancy Gamba zur Erleichterung der Sammlung von THR Proben. </pkt2>

Kugelköpfe wurden von Patienten nach elektiven THR Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Alle Gewebe wurden als de-identifizierte Proben in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Stanford University Research Compliance Office gesammelt. 1. Auswählen einer Brustkrebszelllinie (n) <ol><li> Erhalten oder Transfektion die gewünschte Brustkrebszelllinie (n) mit einem Luciferase-GFP-Reporterkonstrukt. Die folgenden Versuche wurden durch Transfektion mit dem Transposon Sleeping Beauty Plasmid PKT2 / Lubig unter Verwendung der MDA-MB-231 und MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien für die stabile Expression von Firefly Luziferase entwickelt (Fluc) und enhanced green fluorescent protein (EGFP) und die Transposase Plasmid pK / hUbiC-SB11 45,46. HINWEIS: Die transfizierten Zelllinien werden als MDA-MB-231-FluC-EGFP und MCF-7-FluC-EGFP bezeichnet. </li></ol> 2. Isolieren Tissue Fragments von Hüftköpfe <ol><li> Nach THR Chirurgie, sammeln die verworfen Hüftkopf in einem sterilen Behälter mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Die Probe wird im Labor und verarbeiten es in 1-3 Stunden nach der Operation. Hinweis: wenn es eine Verzögerung in der Verarbeitung, Man gibt die Probe bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie einen Arbeitsbereich, indem Sie die folgenden Elemente auf einem saugfähigen Matte in einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube: sterile Handschuhe, chirurgische Zange, Zangen, Becherglas mit 70% igem Isopropanol, Instrumente und Gewebekulturgefäße gründlich wie unten für jede Art von Experiment festgelegt . </li><li> Das Tragen eines sterilen OP-Handschuh, um die Runde Femurkopf in einer Hand zu halten, verwenden Sie die Zange in der anderen Hand, um Trabekelknochen Fragmente gewünschter Größe (~ 2-5 mm) von der freiliegenden oberen Welle des Oberschenkelknochens zu extrahieren. Übertragen Knochenfragmente in das Kulturgefäß (beispielsweise 6, 12 oder 24-Well-Gewebekulturplatte oder Migration Kammer), abhängig von der Art der Proliferation, colonization oder Migration Experiment wie in den Schritten 3, 4 oder 5 beschrieben. HINWEIS: Knochengewebefragmenten sollte wie oben, nachdem Sie die ersten Schritte für jede spezifische Proliferation, Kolonisierung oder Migrationsassay beschrieben geerntet werden. Fragmente in einem Größenbereich, wie in Abbildung 2 dargestellt. Fragmente können vor oder nach Versuchen zum Zwecke der Standardisierung abzuwägen. </li></ol> 3. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen Angrenzend an Knochenfragmente zu Brustzellproliferation messen Mit BLI <ol><li> Vor dem Experiment Eine Suspension, die 2 x 10 5 Brustkrebszellen / 50 ul, und bereiten Stopfen aus Knochenwachs zur Immobilisierung von Knochenfragmenten in Kultur. Schneiden Sie ein P200 Mikropipettenspitze in 3 Teile, verwenden Sie das schmale Ende der größte Stück in einem &quot;Cookie-Cutter&quot; Art und Weise, um kleine (~ 35 mg) Knochenstücke Wachs geschnitten. Verwenden Sie das breite Ende der kleinste Stück, um die Knochenwachs Stecker in eine Petrischale ausgeworfenfür die Lagerung. </li><li> Legen Sie ein Stück Knochenwachs auf der 12-Uhr-Position jeder Vertiefung und drücken Sie leicht mit einem sterilen Handschuhen Zeigefinger. </li><li> Je 50 ul der Zellsuspension mit 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in der Mitte jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. (Alternativ Samenzellen in einem verteilten Muster, falls gewünscht.) Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. </li><li> Zeigen 1 Knochenfragment auf 1 Stück Knochen Wachs für jeden experimentellen gut und sanften Druck mit der Knochenzange, um sie zu sichern. Führen Experimenten in dreifacher Ausfertigung, dass 3 Knochenfragmente von einem bestimmten THR Probe werden in den ersten drei Vertiefungen gegeben, während die unteren drei Brunnen enthalten Knochenwachs nur als Kontrolle. </li><li> Unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam zu liefern 5 ml DMEM-10% FBS zu der Seite jeder Vertiefung zu vermeiden Verdrängen der Brustzellen oder Knochenfragmenten. Die Platte wird in eine 3776; C Gewebekultur-Inkubator für 20-24 Std. </li><li> Um Biolumineszenz-Bildgebung durchzuführen (BLI) entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Luciferinsubstrat (um eine Konzentration von 300 ug / ml zu erreichen) in jede Vertiefung. Bild die Platte sofort in einem IVIS Imaging Platform mit den folgenden Parametern: Blende von 1, kleine Binning, Belichtungszeit von 1 Sekunde, Ebene D. Messen Sie die Signalintensität der einzelnen sowie durchschnittliche Strahldichte (Photonen / Sekunde / Quadratzentimeter / Steradiant). </li><li> Verwenden Sie Imaging-Software zu definieren, Regions of Interest (ROI), die durchschnittliche Strahlung für alle experimentellen und Kontrollvertiefungen zu quantifizieren. Export durchschnittliche Strahlungswerte in ein Excel-Blatt, Statistiken führen und Grafiken erstellen. </li></ol> 4. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen direkt Gesetzte Auf Knochenfragmente zur Kolonisation und Cell Number Studieren <ol><li> Verwenden einer Pinzette, um Knochenfragmente direkt in die leeren Wells einer 24-Well-Gewebekulturplatte (1 Fragment / Vertiefung) zu platzieren. </li><li> Pipette 50 ul Zellsuspension Tröpfchen aus DMEM-10% FBS mit 1 X 3-6 Oktober Brustkrebszellen direkt aufeinander Knochenfragment. Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. Hinzuzufügen sanft 1-2 ml DMEM-10% FBS in die Seite jeder Vertiefung, so daß das Fragment wird vollständig in einem Medium eingetaucht ist. Inkubieren der Platte in einem 37 ° C Brutschrank für 20-24 Std. </li><li> Nach der Inkubation verwenden Pinzette jedes Knochengewebefragment in ein frisches 24-Well-Platte mit 1 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung zu übertragen. Um BLI durchzuführen, führen Sie die Schritte 3,6-3,7 oben. Zusätzlich können Fragmente mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, oder gespült, um den Markpopulation für Analysen der Brustkrebs-Zellzahlen und den Eigenschaften wie in Schritt 6 beschrieben, erhalten. </li><li> Um die intakten Fragmente zur qualitativen Bewertung durch Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet folgenden BLI, Pipette 5 ul von fluoreszierenden Bisphosphonat Markierungslösung (preVergleich nach den Anweisungen des Herstellers) in jede Vertiefung, um die mineralisierte spicules der Knochenfragmente zu markieren. Die Platte in der Gewebekultur-Inkubator für weitere 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden der Kultur in der Leuchtstoff Bisphosphonat Etikettierungslösung Verwenden einer Pinzette, um die Fragmente zu Gewebekulturplatten mit Phenolrot-freiem Medium und Ausblick mit einem Fluoreszenzmikroskop für Bild GFP (485 nm) und Bisphosphonat-Etikett (680 nm) konfiguriert übertragen. </li></ol> 5. Mess Migration von Brustkrebszellen zu Knochengewebe Fragmente und kultivierten Knochenfragment Stände <ol><li> Migration in Richtung Knochengewebekulturüberstand. HINWEIS: Führen Experimenten in dreifacher Ausführung, so daß 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe verwendet werden, um 3-Überstände zu erzeugen. Für jedes Experiment wird die Migration auf drei Vertiefungen, die Knochenüberständen gegen drei Brunnen, die nur Steuermedium verglichen. <ol><li> Geneknochen tisklagen Ständen indem Knochenfragmente in die Wells einer 12-Well-Platte mit 2,2 ml DMEM-10% FBS pro Mulde. Kultur in einem 37 ° C Brutschrank für 24 Stunden. Ziehen Sie das Medium nach 24 Stunden und ersetzen mit 2,2 ml frischem DMEM-10% FBS. Treat Kontrollvertiefungen enthaltenden DMEM-10% FBS in der gleichen Weise. HINWEIS: Das Medium wird nach 24 Stunden geändert, um Faktoren als Reaktion auf Gewebetrauma nach einer Operation erfolgen abgesondert zu entfernen. Weil Knochengewebe Überstände werden in generierten FBS enthaltenden Medium, Vertiefungen, die FBS enthaltenden Medium nur enthalten, um für die Beiträge der FBS, um Brustkrebs-Zellmigration steuern. </li><li> Nach 48 Stunden, sammeln 0,9 ml jedes Überstands / Steuermedium und Pipette in die Vertiefungen einer Aufnahmeplatte. Die Einsätze werden später in diese Vertiefungen gelegt werden. Inkubieren Sie die Aufnahmeplatte in der Gewebekultur-Inkubator während der Aussaat der Einsätze. Hinweis: Der verbleibende Überstand (~ 1 ml nach dem Eindampfen) können für die Analyse von Sekretom facto gesammeltrs auf Wunsch 44. </li><li> Um die Transwell-Einsätze Saatgut, legen Sie sie in ein Standard, leere 24-Well-Gewebekulturplatte. Pipette 350 ul Zellsuspension, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS auf das obere, innere Membranoberfläche jedes Einsatzes, wie in 1A gezeigt. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die die gesetzten Einsätze in den 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Befestigung zu fördern. </li><li> Sobald die Zellen an den Einsätzen befestigt sind, verwenden Zange, um die Einsätze an der Aufnahmeplatte nach den Anweisungen des Herstellers übertragen. Angle jeder Einsatz, wenn Sie diese in den Receiver auch um eine Blasenbildung zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch Überstand zu verhindern. Inkubieren des Empfängerplatte mit Einlagen für 20 h in einem 37 ° C Brutschrank. HINWEIS: Blasen zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch supernatan Überprüfen Sie die Unterseite der Aufnahmeplattet. Sind Blasen sichtbar, entfernen Sie die spezifische Einsätze und legen Sie sie wieder in den Empfänger gut, bis keine Luftblasen vorhanden sind. </li><li> Nach 20 h Verwendung einer Pinzette, um die Einsätze von der Aufnahmeplatte zu entfernen. Unter Verwendung der Verfahren in Schritten von 3,6 bis 3,7 durchgeführt BLI für Bild in die Zellen, die in migriert und auf den Boden der Aufnahmeplatte Brunnen angeschlossen haben. </li></ol></li><li> Migration in Richtung Knochengewebefragmenten. HINWEIS: Führen Sie Versuche in dreifacher Ausfertigung, dass 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe werden in 3 verschiedene Inserts platziert und 3 Glasperlen werden in 3 verschiedene Einsätze als Kontrollen gelegt. <ol><li> Bereiten Sie die Aufnahmeplatte durch Pipettieren von 0,9 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung. Legen Sie sie in den Brutschrank, während der Vorbereitung der Einsätze. </li><li> Um die Einsätze Saatgut, kehren sie auf der Oberfläche eines Kunststoffmikrozentrifugenröhrchen Box, die einen Deckel hat. Pipettieren Sie 50 ul Zellsuspension Tropfen DMEM-10% FBS, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen direkt auf die äußere, untere Fläche jedes Einsatzes Membran (zugewandte auf der invertierten Einsätze). Bedecken Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Box mit dem Deckel aufgeschlagen und übertragen sie an die 37 ° C-Inkubator Gewebe für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. </li><li> Übertragen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Feld, um die Gewebekultur Kapuze, und verwenden Sie Pinzette, um die gesetzten Einsätze rechten Seite nach oben drehen und sie in die Vertiefungen der Aufnahmeplatte. Pipette 0,450 ml DMEM-10% FBS in jede Einsatzschale. Mit einer Pinzette, übertragen Sie einen Knochengewebe Fragment (ca. 3 mm) in jede vorbereitete Einsatzschale. Optional können Sie mit Glasperlen als negative Kontrollen in weitere Bohrungen. Die Platte wird in einem Gewebekultur-Inkubator für 20 Stunden. </li><li> Um die Migration zu messen, bereiten Sie einen Standard-24-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml DMEM-10% FBS pro Vertiefung. Entfernen Sie die Aufnahmeplatte aus dem Inkubator und verwenden Pinzette, um die Knochenfragmente und Perlen aus jeweils in separate Vertiefungen der Standardplatte übertragen einfügen. Luciferin hinzufügenSubstrat in jede Vertiefung (um eine Endkonzentration von 300 ug / ml zu erreichen) und führen BLI unter Verwendung der Verfahren in den Schritten 3,6-3,7. </li></ol></li></ol> 6. Zusätzliche Pre- und Post-experimentellen Analysen <ol><li> Analyse gespült Mark. <ol><li> Übertragen einer Knochenfragment in eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb an der Spitze einer konischen 50 ml-Röhrchen gegeben. Verwenden einer 10 ml-Spritze mit einer 25 G Nadel, um kräftig zu spülen das Fragment mit 10 ml PBS, um eine Suspension von Knochenmarkzellen in der konischen Röhre zu erhalten. Zentrifuge wurde die Zellsuspension 3 Minuten bei 300 × g und 21 ° C, saugt den Überstand und Resuspendieren der pelletierten Zellen in PBS oder andere gewünschte Lösung für die Durchflusszytometrie. HINWEIS: Resuspension Volumen wird in Abhängigkeit von der Größe der Zellpellet nach der Zentrifugation und der Anwendung variieren. </li><li> Für Lebensfähigkeitstests ~ 75-300 ul-Volumina von PBS angemessen sind, und diese Suspensionen können analysiert werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen fluorescence basierend Lebensfähigkeitstests nach den Anweisungen des Herstellers, pipettiert in einen herkömmlichen Hämozytometer und mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop gezählt. </li><li> Für die Durchflusszytometrie oder Sortierung basierend auf der Erfassung GFP-positiven Brustkrebszellen, Zellpellet in 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS, 2 mM EDTA und 10 mM HEPES, so dass die Konzentration 1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E-Färbung und Immunhistochemie. <ol><li> Um die Fragmente für Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung und / oder Immunhistochemie Dabei legen die Fragmente in Plastikkassetten mit einer Nummer 2 Bleistift markiert, und tauchen in einen Behälter mit 10% gepuffertem Formalin für 24 Stunden aufgefüllt. </li><li> Prozess-Gewebe für Paraffineinbettung, Schneiden und Färben Verwendung von Routineprotokollen, die eine Entkalkung Schritt für die mineralisierten Nadeln in jedem Fragment Konto gehören. </li></ol></li></ol>

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Mehra et al. Wurden bereits beschrieben die Obduktion Sammlung und Analyse von Knochenproben von metastasierendem Prostatakrebs-Patienten zum Zeitpunkt der Autopsie entnommen und enthüllt hochwertigen Gewebe und Validierung der Verwendung von menschlichen Knochenproben, um die metastatischen Prozess 47 zu studieren. Hier haben wir Protokolle zur Erhebung, Verarbeitung und Nutzung von menschlichen verworfen Femurköpfe folgenden THR Operation in einer kurzfristigen Co-Kultursystem, um Brustzellmigratio...

Die Tumor-Mikroumgebung wird weithin als ein kritischer Faktor für die Krebszelle Verhalten bei Brustkrebs Progression und Metastasen erkannt verteilt 1-3. Das Ziel der hier vorgestellten Verfahren ist die Untersuchung von Brustkrebs-Zellen in der Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe, die häufigste Stelle der Brustkrebsmetastase 4-6 erleichtern. Knochen von mineralisierten und Mark Fächer 7-9, die beide beherbergen Zellen sezerniert Faktoren bei metastasierendem Progression 10,11 verwickelt zusammen. Obwohl weit verbreitet in vivo Mausmodellen zu erleichtern systemische Studien des metastatischen Prozesses 12-15, Zell-Wechselwirkungen innerhalb des Skeletts sind nicht für die Beobachtung und direkten Störung leicht zugänglich. Modellsysteme für die Untersuchung und Kultivierung von Maus-Knochengewebe und Knochenmarkzellen der Maus einen besseren Zugang und haben viele Erkenntnisse über Sprechen und Mechanismen, die Brustkrebs-Zell m ergabetastasis der murinen Gerüst 16-22. Studien haben jedoch ergeben, dass es artspezifische Muster osteotropism für Knochengewebe 23,24 sein. Diese Muster inhärent speziesspezifische Unterschiede in der Knochengewebeeigenschaften, von Differenzen aus veränderten Knochenmarkspopulationen in immundefizienten Mäusen 11 und / oder der relativ jungen Alter der Mäuse in Experimenten verwendet, von denen alle voraussichtlich Determinanten des Knochens beziehen könnte Mikroumgebung. In vitro-Ansätzen zur Untersuchung Brustkrebszellen in menschlichen Knochen Kokulturen wurden typischerweise auf bestimmten Knochenzelltypen wie Mark abgeleiteten Osteoblasten oder Stromazellen als Monolayer kultiviert oder in konstruierte 3-dimensionale Modellsysteme 25-35 konzentriert. Obwohl 2-dimensionalen Zellkulturmodellen haben die Hauptstütze der in vitro gebildeten Ansätze für die Krebsforschung ist seit langem bekannt, dass das Zellverhalten ist grundsätzlich in m verändertonolayer Kultursystemen 18,36,37. Dies hat zur Entwicklung von technisch Mikroumgebungen, die die Komplexität von 3-dimensionalen lebenden Geweben, einschließlich Matrix- und Gerüst basierende Modelle von natürlichen Materialien wie Collagen nachahmen geführt, oder synthetische Polymere geimpft mit spezifischen Zelltypen, die gewebeartige Mikroumgebungen zu schaffen 36-41. Engineered Ansätze haben auch die Verwendung von Bioreaktor Plattformen zu kontrollieren und zu untersuchen das hormonelle Milieu der Mikro 18,19,41-43. Obwohl biomimetische Modelle und Bioreaktoren bieten viele Elemente eines komplexen Gewebemikroumgebung, in einer kontrollierten Umgebung und wurden erfolgreich angewendet, um die Studie von Brustkrebs Metastasen in Knochen 18,19,35,42,43 voranzubringen, müssen entwickelt Modellsysteme in der Regel nicht übernehmen das gesamte Spektrum von Zelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten innerhalb der nativen Knochen Umwelt vorhanden. Bis vor kurzem BrustkrebsZellen wurden nicht innerhalb der nativen intakten, 3-dimensional-Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe untersucht worden. Vor kurzem berichteten wir die Entwicklung eines Co-Kultur-Modell mit menschlichen Knochengewebefragmenten aus Hüft isoliert (THR) Chirurgie Proben 44. Diese Proben bergen sowohl die Mineralisierung und Knochenmark Fächer notwendig, Mechanismen Mikrometastasen in Kurzzeitkultur zugrunde zu studieren. In früheren Arbeiten haben wir Proof-of-Prinzip für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), die Proliferation von Luciferase-exprimierenden Brustkrebszellen (MDA-MB-231-Fluc) co-kultiviert mit Knochenfragmente 44 zu überwachen. Hier haben wir für das Studium der Brust Zellkrebs Proliferation, Kolonisierung und Migration im Rahmen der nativen Mikroumgebung mit menschlichen Knochen Gewebeexplantaten Gehende bestehende experimentelle Protokolle. Zuerst ein Protokoll für Co-Kultivierung Brustkrebszellen neben Knochenfragmenten an Brust messen präsentieren wirZellproliferation mit BLI. In diesem Abschnitt werden die Brustzellsuspensionen Zellflecken in 6-well Platten angrenzend an Knochenfragmente, die durch Stücke von Knochenwachs immobilisiert werden ausgesät. Kontrollvertiefungen enthalten Knochenwachs, aber keine Knochenfragment. Sobald Zellflecken zu befestigen, ist Medium gegeben und die Platte wird für 24 Stunden, nach der Biolumineszenz-Signalintensität (mit Zellzahl assoziiert) mit BLI gemessen kultiviert. Im nächsten Schritt stellen wir Verfahren zur Co-Kultivierung Brustkrebszellen direkt auf Knochenfragmente beimpft, um Ansiedlung und Vermehrung zu studieren. Hier werden die Brustzellsuspensionen werden direkt auf die Knochengewebefragmenten, die in Kultur durch BLI und Fluoreszenzmikroskopie über die Zeit überwacht werden, um Kolonisation und Zellzahl verfolgen pipettiert. In diesem Verfahren wird der Markraum kann von den Knochenfragmenten zu jedem Zeitpunkt für die Analyse von kolonisierten Brustkrebszellen durch Durchflusszytometrie gespült werden oder Mark-Lebensfähigkeitstests. Darüber hinaus haben wir deSchreiber zwei verschiedene Ansätze zur Messung von Brustkrebszellmigration. Im ersten Verfahren wird zur Messung der Migration in Richtung Knochengewebekulturüberständen Schritten beschrieben. In diesem Protokoll die Brustkrebszellen ausgesät werden, auf die inneren, oberen Flächen der Transwell einfügen Membranen mit einer 8 um Porengröße (wie in 1A gezeigt). Die Einsätze werden dann in einer Aufnahmeplatte mit Vertiefungen, die Knochengewebe Überstand oder Kontrollmedium platziert. Im Laufe von 20 Stunden Inkubationszeit eine kleine Anzahl von Brustkrebszellen wandern durch den Einsatz Membranen in die unteren Gewebekulturvertiefungen, wo sie für den Nachweis durch BLI befestigen. In der zweiten Migrations-Verfahren die Brustkrebszellen werden auf die untere Außenflächen Transwell-Einsatz Membranen ausgesät. Knochengewebefragmente werden in die Einsatzschalen gelegt und die Brustkrebszellen wandern nach oben durch die Membranen an den Knochenfragmenten zu kolonisieren (wie in 1B dargestellt), diewerden dann aufgenommen mit BLI.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Ergänzen Sie alle DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Ergänzen Sie alle McCoy's mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Pen/Strep</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Ergänzungsmedium für transfizierte Zelllinien.</td></tr><tr><td>Falke&reg; Zellkultureinsätze für 24-Well-Platten mit transparenter PET-Membran (8,0 &mu; m Porengröße)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg 24 Well TC-behandelter Polystyrol-Zellkultureinsatz Companion Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *für Säugetierzellen*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Glühwürmchen, Kaliumsalz 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Zellsieb 70 μmu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-TC-behandelter Zellkultur-Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-TC-behandelter Zellkultur-Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-TC-behandelter Zellkultur-Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Knochenwachs</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Bildgebungsplattform</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software-Programm&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>Version 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 Brustkrebszellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Brustkrebszellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales Maus-Anti-Human-Cytokeratin Antikörper</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

verfahren zur kultivierung humaner femur gewebeexplantaten an brustkrebs zellbesiedlung des metastasierten niche studieren

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone ist die häufigste Stelle der Metastasierung von Brustkrebs. Obwohl es allgemein, dass der Mikro Einflüsse Krebszellverhalten akzeptiert wird, wird wenig über Brustkrebszell Eigenschaften und Verhaltensweisen in der nativen Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe bekannt. Wir haben Ansätze zu verfolgen, zu quantifizieren und zu modulieren menschlichen Brustkrebszellen in der Mikroumgebung des entwickelten kultivierten menschlichen Knochengewebefragmenten aus gebrauchten Femurköpfe nach Hüft-TEP Operationen isoliert. Verwendung Brustkrebszellen für Luciferase konstruiert und verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) Expression sind wir in der Lage, reproduzierbar zu quantifizieren Migration und Proliferation Muster mit Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), Spur Zell-Wechselwirkungen innerhalb der Knochenfragmente mittels Fluoreszenzmikroskopie und auszuwerten Brustzellen nach Besiedlung mit Durchflusszytometrie. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind: 1) eine native, architektonisch intaktem Gewebe MicroEnvironment relevanten Zelltypen des Menschen beinhaltet, und 2) direkten Zugriff auf die Mikroumgebung, die eine schnelle quantitative und qualitative Überwachung und Störung der Brust und Knochenzelleigenschaften, Verhaltensweisen und Interaktionen ermöglicht. Eine Haupteinschränkung, derzeit ist die finite Lebensfähigkeit der Gewebefragmente, die das Fenster der Studie, um Kurzzeitkultur beschränkt. Anwendungen des Modellsystems umfassen die Untersuchung der Grundlagen der Biologie von Brustkrebs und anderen Knochensuchmalignomen in der metastatischen Nische, und die Entwicklung therapeutischer Strategien zur zielgerichteter Brustkrebszellen in Knochengewebe.

Isolieren von Gewebefragmenten aus Hüftköpfe Kugelköpfe wurden aus einer gleichen Anzahl von männlichen und weiblichen Patienten (44-90 Jahre) nach elektiven Hüft-Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Jedes verworfen Hüftkopf enthält einen kleinen Teil des oberen Oberschenkel, die trabekuläre Knochengewebe des mineralisierten Nadeln und Mark zusammen birgt. Dieses Gewebe ist durch die chirurgisch freiQuerSchnitt der We...

Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Proliferation, Kolonisation und Migration von Brustkrebszellen in einem humanen Knochengewebsexplant-Modellsystem zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem trabekuläre Knochengewebefragmente aus operativen Femurkopfproben isoliert und mit Brustkrebszellen kultiviert werden, die Luciferase und grün fluoreszierendes Protein exprimieren. Mithilfe der Biolumineszenzbildgebung wird die Zellproliferation gemessen und die Kolonisation der Brustkrebszellen in den Knochengewebefragmenten überprüft.Die Kolonisationsmuster von Brustkrebszellen werden mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Das Markkompartiment kann zur Analyse mittels Durchflusszytometrie, Lumineszenz- und Färbeassays aus den Fragmenten ausgewaschen werden. Die Migration von Brustkrebszellen hin zu Gewebekultur, Überständen und Knochenfragmente wird in Transwell-Migrationskammern gemessen. Mit biolumineszenzbasierten Bildgebungsverfahren lässt sich der Knochen als häufigster Ort von Brustkrebsmetastasen untersuchen, und letztlich eröffnet dieses Modell einen neuen Ansatz zur Untersuchung von Brustkrebszellen im metastatischen Knochenmilieu.Ein großer Vorteil dieses Modells besteht darin, dass es direkten Zugang zum Mikroumfeld menschlicher Knochenfragmente bietet, wodurch wir das Verhalten von Brustkrebszellen während kurzzeitiger Ko-Kultur-Experimente leicht beobachten und analysieren können. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen zu den Mechanismen zugrunde liegenden Brustkrebs-Metastasierung in den Knochen zu untersuchen, mit dem Ziel, therapeutische Strategien zur wirksamen Prävention und Behandlung zu identifizieren. Obwohl dieses Modell Einblicke in die Brustkrebs-Metastasierung ermöglicht, kann es auch zur Untersuchung anderer knochensuchender Malignitäten wie beispielsweise Prostatakrebs eingesetzt werden.Knochentissuefragmente müssen zu verschiedenen Zeitpunkten in jedem Assay gewonnen werden. Dies beginnt mit dem Sammeln und Transportieren einer femoralen Probe in Kochsalzlösung und der Vorbereitung der Arbeitsstation in einem Biosicherheitsschrank unter Tragen eines chirurgischen Handschuhs. Halten Sie den Femurkopf mit einer Hand fest und verwenden Sie einen chirurgischen Rohrer, um trabekuläres Knochengewebe zu entnehmen.Die Fragmente sind etwa zwei bis fünf Millimeter groß. Pinzetten eignen sich für diesen Schritt nicht. Sie benötigen eine chirurgische Rohrzange von guter Qualität.Bereiten Sie für dieses Experiment eine Brustkrebszell-Suspension mit 100.000 Zellen pro 50 µL DMEM plus 10 % FBS vor. Bereiten Sie außerdem Stopfen aus Knochenwachs vor, um die Knochenfragmente zu mobilisieren, indem Sie die abgeschnittenen Enden einer Mikropipettenspitze verwenden, und lagern Sie die Stopfen in einer Petrischale. Übertragen Sie die Stopfen dann mit einer Pinzette in eine sechslochige Platte und drücken Sie sie mit einem sterilen Handschuh an die Position „12 Uhr“.Pipettieren Sie anschließend 50 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte jedes Wells. Stellen Sie die Platte 45 Minuten lang in einen Zellkultur-Inkubator, um die Zellanheftung zu fördern. Während die Platte inkubiert wird, extrahieren Sie die Knochenfragmente mit den an der Platte haftenden Zellen. Legen Sie ein Knochengewebefragment auf das Bienenwachs in drei Wells und drücken Sie jedes mit dem GER nieder; die drei Wells ohne Fragmente dienen als Kontrollen.Fügen Sie anschließend langsam fünf Milliliter DMEM mit 10 % FBS an die Wand jedes Wells hinzu. Das Knochenwachs und die Knochenfragmente dürfen nicht gelöst werden. Inkubieren Sie die Kultur danach 20 bis 24 Stunden lang.Am nächsten Tag zuerst die Zellen abbilden. Geben Sie 300 Mikrogramm pro Milliliter Luciferin in jede Vertiefung und bilden Sie die Platte anschließend unverzüglich mit einer Ivis-Bildgebungsplattform ab. Für dieses Experiment wird eine Brustkrebszell-Suspension wie zuvor benötigt.Nach der Extraktion der Knochenfragmente jedes Fragment mit einer Pinzette in eine leere Vertiefung einer 24-Loch-Platte überführen, anschließend 50 Mikroliter Zellsuspension direkt auf jeden Knochenfragment pipettieren und die Platte 45 Minuten lang in einen Inkubator stellen, um die Zellanheftung zu fördern. Sobald die Zellen angeheftet sind, vorsichtig ein bis zwei Milliliter Medium in jede Vertiefung geben, sodass das Knochenfragment vollständig bedeckt ist. Danach die Platte 20 bis 24 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator stellen.Zur Vorbereitung auf die Ivis-Bildgebung, die Fluoreszenzbildgebung oder das Sammeln von Markzellen zur Analyse für die Ivis-Bildgebung überführen Sie die Knochenfragmente in eine 24-Loch-Platte mit je einem Milliliter frischem Medium pro Loch. Geben Sie 300 Mikrogramm pro Milliliter Lucifer pro Loch hinzu und verfahren Sie wie zuvor für die Fluoreszenzmikroskopie beschrieben. Pipettieren Sie fünf Mikroliter fluoreszierende Bisphosphat-Markierungslösung in jedes Loch, um die knöchernen Bälkchen der Knochenfragmente zu markieren, und inkubieren Sie die Platte weitere 24 Stunden.24 Stunden später die Fragmente mit einer Pinzette auf Platten mit phenolrotfreiem Medium übertragen. Anschließend die Platten mit einem Fluoreszenzmikroskop, das für die Bildgebung bei 485 Nanometern zur Lokalisierung kolonisierender GFP-exprimierender Brustkrebszellen und bei 680 Nanometern zur Identifizierung von Bisphosphat-markierten Knochenspikulen konfiguriert ist, untersuchen, um das Knochenmarkkompartiment zu spülen und die Zellzahlen oder -eigenschaften zu analysieren.Überführen Sie ein Fragment in einen 70-Mikron-Filter über einem 50-Milliliter-Chronikgefäß. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, um das Fragment kräftig mit 10 Millilitern PBS zu spülen. Zentrifugieren Sie die Suspension drei Minuten bei Raumtemperatur mit 300 × g, um die Zellen zu pelletieren. Aspirieren und entsorgen Sie anschließend den Überstand.Biegen Sie das Pellet aus Markzellen in PBS oder einer anderen gewünschten Lösung je nach Durchflusszytometrie- oder Vitalitätsassays. Beginnen Sie mit der Erzeugung eines Knochengewebenetzes. Geben Sie Knochenfragmente in die Vertiefungen einer 12. Platte mit 2,2 Milliliter DMEM mit 10 % FBS pro Vertiefung, wobei einige Kontrollvertiefungen ohne Knochenfragmente belassen werden. Die Platte 24 Stunden lang kultivieren. Danach das Medium abpipettieren und ersetzen und die Kultivierung weitere 24 Stunden fortsetzen. Nach 48 Stunden Kultur 0,9 Milliliter Überstand in eine Empfängerplatte überführen, während die Empfängerplatte vorübergehend inkubiert wird.Transwell-Einsätze in eine leere 24-Loch-Platte geben. Anschließend 100.000 Brustkrebszellen in 350 Mikroliter auf jeden Einsatz impfieren. Danach die Platten 45 Minuten lang kultivieren, um die Zellanheftung zu fördern. Nach 45 Minuten die Einsätze mit einer Pinzette auf eine Empfängerplatte übertragen.Stellen Sie sicher, dass Sie die Inserts schräg in den Empfänger einführen. Gute Supination, damit sich keine Blasen bilden. Inkubieren Sie die Platte mit den Inserts anschließend am nächsten Tag 20 Stunden bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie die Inserts mit einer Pinzette und geben Sie 300 Mikrogramm pro Milliliter Luciferin in jedes hinzu. Führen Sie die Biolumineszenz-Bildgebung auf der Empfängerplatte durch, um Brustkrebszellen nachzuweisen, die durch die Membranen migriert und sich an der Unterseite der Vertiefungen der Empfängerplatte angeheftet haben. Zunächst befüllen Sie eine Empfängerplatte mit Medium und stellen sie in den Zellkultur-Inkubator.Um die Inserts zu besiedeln, stellen Sie diese umgekehrt in eine leere Mikrofusionsröhrchenbox mit Deckel. Geben Sie dann 100.000 Zellen in 50 µL auf die äußere untere Oberfläche jeder Insert-Membran. Decken Sie die Box ab, lassen Sie den Deckel jedoch leicht geöffnet, und inkubieren Sie die Inserts 45 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Anschließend invertieren Sie die Inserts mit einer Pinzette und überführen sie, indem Sie die Vertiefungen einer Receiver-Platte in jede Insert-Schale geben, jeweils mit 0,45 Milliliter DMEM mit 10 % FBS. Danach geben Sie je ein drei Millimeter großes Knochenfragment oder eine Glaskugel in jedes Insert und inkubieren sie 20 Stunden lang. Überführen Sie am nächsten Tag die Fragmente und Perlen mithilfe einer Pinzette in eine Platte mit Vertiefungen, die jeweils ein Milliliter frisches Medium enthalten. Fügen Sie 300 Mikrogramm pro Milliliter Lucifer pro Vertiefung hinzu und führen Sie anschließend die Biolumineszenz-Bildgebung durch. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.Brustkrebszellen wurden zusammen mit immobilisierten Knochenfragmenten kultiviert, um die Proliferation der Brustzellen zu messen. Die Biolumineszenz-Bildgebung nach 24-stündiger Kultur zeigte eine verstärkte Proliferation von Brustkrebszellen in Gegenwart von Knochenfragmenten in den oberen drei Vertiefungen im Vergleich zur Abwesenheit von Knochenfragmenten in den unteren drei Vertiefungen. Die Ergebnisse von Experimenten mit Fragmenten aus drei verschiedenen chirurgischen Proben zeigten eine erhöhte Proliferation in Gegenwart im Vergleich zur Abwesenheit von Knochengewebe.In allen drei Fällen wurde nach 24 Stunden mittels Biolumineszenzbildgebung eine Kolonisation der direkt unter Knochenfragments stehenden MCF-7-F-Luke-EGFP-Zellen beobachtet. Eine verminderte Signalintensität ging mit einer abnehmenden Aussaatdichte nach 48 Stunden einher. Direkt besiedelte, mit Bisphosphonat-Reagenz markierte Fragmente zeigten eine Kolonisation der GFP-positiven Brustkrebszellen innerhalb der mineralisierten und Markräume.Die Migration der Brustkrebszellen durch die poröse Migrationsmembran hinweg zum Knochengewebskulturüberstand war in den oberen drei Vertiefungen im Vergleich zur Migration in die Kontrolle deutlich stärker ausgeprägt. Medium war in den unteren drei Vertiefungen sichtbar. Es wurde ebenfalls Migration in drei Knochenfragmente aus einer gegebenen THR-Probe beobachtet, während keine Migration auf die Kügelchen festgestellt wurde.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie menschliche Knochenfragmente aus einer Femurkopfprobe gewonnen und in Koinkubationsassays eingesetzt werden können, um das Verhalten von Brustkrebszellen hinsichtlich Migration, Kolonisation und Proliferation zu untersuchen.

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