Name: 荧光标记基因的基因枪转化成机会性真菌病原新型隐球菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习基因枪转化技术，将荧光标记DNA稳定整合到机会性病原真菌Cryptococcus neoformans基因组中。该方法通过PCR和荧光显微镜验证整合效果，为真菌遗传学研究提供可靠工具。

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本工作获得了美国国家科学基金会（资助号：0920274）和南卡罗来纳州实验站项目 SC-1700340 的资助。本文为克莱姆森大学实验站第 6283 号技术贡献。作者感谢 Lukasz Kozubowski 博士在本最终方案开发过程中提供的有益建议，以及 Cheryl Ingram-Smith 博士、Katie Glenn 和 Grace Kisirkoi 对稿件的审阅与宝贵意见。

注意：本方案的整体流程见图1。
1. C. neoformans 的制备
<ol>
	<li>每次转化反应中，在YPD培养基中于30 °C、250 rpm振荡条件下培养2-3 ml&#160;新生隐球菌（C. neoformans）过夜培养物。</li>
	<li>将过夜培养物在10 °C下以900 × g离心5分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>将每个细胞沉淀重悬于300 μl酵母胨葡萄糖（YPD）培养基中。</li>
	<li>使用玻璃珠将300 μl洗涤后的细胞悬液轻轻涂布于含1 M山梨醇的YPD琼脂平板上。</li>
	<li>让平板在室温下干燥3-4小时。</li>
</ol>
2. 金微载体的制备
<ol>
	<li>将0.25 g的0.6 μm金珠重悬于1 ml ddH2O中，于900 × g离心1分钟以沉淀金珠，弃去上清液。</li>
	<li>将金珠重悬于1 ml 100%乙醇中。</li>
	<li>将金珠分装至4个离心管中，每管250 μl，并加入750 μl 100%乙醇。</li>
	<li>将金珠分装液储存在4 °C。</li>
</ol>
3. DNA 制备
<ol>
	<li>使用镊子将橙色宏载体基因枪圆片浸入100%乙醇中，以制备圆片。将圆片放入盛有干燥剂的大培养皿中干燥（确保干燥剂不接触圆片）。</li>
	<li>干燥后，将宏载体圆片压入银质圆片支架中（支架此前已用100%乙醇擦拭过）。</li>
	<li>涡旋震荡金微粒（按步骤2制备），每管分装12 µl至1.5 ml微量离心管中，每项转化使用一管。</li>
	<li>依次向每管中加入：2 µg DNA（建议加入2 µl浓度为1 µg/µl的DNA）、10 μl 2.5 M CaCl2 和 2 μl 1 M 亚精胺游离碱。</li>
	<li>设置阴性对照，操作同步骤3.4，但不加DNA。</li>
	<li>涡旋震荡各管，室温孵育5分钟。孵育期间偶尔轻弹管壁，以重新悬浮沉淀的微粒。</li>
	<li>以225 × g离心30秒，使DNA包被的金微粒沉淀。小心吸除上清液（通过移液或抽吸），并弃去。</li>
	<li>用100%乙醇600 µl缓慢吹打重悬微粒，确保完全悬浮。</li>
	<li>以225 × g离心30秒，使微粒沉淀但不压实。小心吸除并弃去上清液。</li>
	<li>用100%乙醇8 µl缓慢吹打重悬DNA包被的金微粒。</li>
	<li>将DNA包被的金微粒溶液滴加至基因枪圆片中心，形成直径约1 cm的液滴，静置使其干燥。 
	注意：若在基因枪圆片中心可见干燥的金色环状物，表明金微粒浓度足够。 
	注意：载有DNA包被金微粒的宏载体圆片现已可直接用于基因枪操作。</li>
</ol>
4. 基因枪的操作
<ol>
	<li>打开真空泵。</li>
	<li>逆时针旋转旋钮以开启氦气，直至压力表显示压力达到约 2,200 psi。</li>
	<li>拨动左侧红色开关，打开基因枪。</li>
	<li>确保调节真空和排气的流速，使真空度在 15 秒内达到 28 英寸汞柱（inches Hg）。</li>
	<li>确保破裂盘与宏载体之间的距离约为 3/8 英寸。</li>
	<li>用乙醇擦拭整个腔室以进行清洁。</li>
	<li>将破裂盘浸入 100% 乙醇中，然后置于无菌表面（e.g.，培养皿）晾干。</li>
	<li>使用扭矩扳手松开破裂盘固定座。将一片洁净的破裂盘插入固定座中，再将固定座旋回原位，并用扭矩扳手向右旋转一次将其拧紧。 
	注意：每次射击后均需更换破裂盘。</li>
	<li>将金属网筛浸入 100% 乙醇中，然后置于无菌表面（e.g.，培养皿）晾干。</li>
	<li>晾干后，将清洗过的金属网筛放置在白色塑料安装板上。将带有 DNA 的宏载体圆盘固定座（DNA 面朝下）放入圆盘腔室中。旋上银色盖帽，并将安装板置于最高位置的插槽中。 
	注意：每次射击后均需更换金属网筛。</li>
	<li>将含有 1 M 山梨醇的 YPD 琼脂平板放置在底部托板上。</li>
	<li>关闭腔室门并锁紧。</li>
	<li>向上推动并按住中间的红色开关以启动真空，使真空度达到 28 英寸汞柱。当达到所需真空度后，将该开关拨至向下位置。准备就绪后，按住右侧红色开关进行射击。当破裂盘爆裂时，立即松开射击按钮，并将中间红色开关推至中间位置，使腔室排气至 0 psi。</li>
	<li>清除破裂盘残渣并关闭基因枪。然后顺时针旋转旋钮关闭氦气，最后关闭真空泵。</li>
</ol>
5. 涂布转化后的细胞
<ol>
	<li>将转化后的平板置于室温下静置 4 小时，以使细胞恢复。</li>
	<li>用移液器将 700 µl YPD 加入平板中。使用细胞刮轻轻刮下琼脂上的细胞，并将液体移入无菌的 1.5 ml 微量离心管中。重复此步骤，确保从平板上完全回收所有细胞。</li>
	<li>在 225 × g 条件下离心 30 秒以收集细胞沉淀。移去并弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 500 µl YPD 中。</li>
	<li>取 100 µl 细胞悬液滴加至 YPD + 抗生素平板中央，使用玻璃珠涂布均匀。</li>
	<li>将平板倒置，于室温下放置 3–4 天。待菌落出现后，转接到新的 YPD + 抗生素平板上进行划线培养。</li>
</ol>
6. 用于 PCR 的基因组 DNA 提取
注意：这是使用DNA纯化试剂盒中的试剂（参见材料表）的修改版本。
<ol>
	<li>在30 °C、250 rpm振荡条件下，于YPD液体培养基中过夜培养每种C. neoformans转化子的5 ml菌液。</li>
	<li>以900 × g离心3 ml菌液收集菌体，用600 µl核裂解液重悬。</li>
	<li>将悬液转移至含200 µl 0.5 mm酸洗玻璃珠的新1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>在室温下使用微型珠磨机均质45秒，将管子置于冰上冷却，然后重复一次。</li>
	<li>将样品在冰上静置2分钟，转移上清至新的1.5 ml离心管中。向每管加入200 µl蛋白沉淀溶液（每回收600 µl上清加100 µl），并剧烈涡旋20秒。</li>
	<li>将样品在冰上静置5分钟，然后在11,000 × g离心3分钟。</li>
	<li>将上清转移至含有300 µl室温异丙醇的洁净1.5 ml离心管中，轻轻颠倒混匀。</li>
	<li>在11,000 × g离心2分钟，小心移除上清，并将离心管倒置在纸巾上沥干。</li>
	<li>向每管加入300 µl室温70%乙醇，轻轻颠倒洗涤沉淀。</li>
	<li>在11,000 × g离心2分钟，小心完全移除乙醇。</li>
	<li>将离心管倒置在干净的纸巾上，使沉淀在空气中干燥10–15分钟。</li>
	<li>向每份沉淀中加入50 µl DNA重悬液和1.5 µl RNase溶液，涡旋混匀。</li>
	<li>离心5秒，使管盖内液体全部沉至管底。</li>
	<li>在37 °C孵育15分钟。</li>
	<li>将样品在65 °C孵育1小时，以重悬DNA。</li>
	<li>通过测定260 nm处吸光度进行分光光度法DNA定量（A260读数为1.0相当于约50 µg/ml双链DNA），每项PCR反应使用最多200 ng DNA。</li>
</ol>
7. 用于逆转录PCR的RNA提取。
<ol>
	<li>使用RNA纯化试剂盒（参见材料表），按照制造商说明，利用微型珠磨机从酵母细胞中分离RNA。</li>
	<li>通过测量260 nm处的吸光度来定量RNA浓度（A260读数为1.0相当于约40 µg/ml单链RNA）。</li>
	<li>使用RT-PCR试剂盒（参见材料表），按照制造商说明，用约1 µg RNA设置RT-PCR反应。本研究结果所用引物见表1。</li>
</ol>

<ol><li>Price, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcusneoformans+requires+a+functional+glycolytic+pathway+for+disease+but+not+persistence+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host.</a> MBio. 2, e00103-e00111 (2011).</li>
<li>Bubb, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+NMR+studies+of+metabolites+produced+by+Cryptococcusneoformans+in+culture+media%3A+identification+of+possible+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors.</a> Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).</li>
<li>Himmelreich, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+metabolites+of+importance+in+the+pathogenesis+of+pulmonary+cryptococcoma+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).</li>
<li>Wright, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+released+by+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+and+var.+gattii+differentially+affect+human+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function.</a> Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).</li>
<li>Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+adaptation+in+Cryptococcusneoformans+during+early+murine+pulmonary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection.</a> Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase%3A+not+just+a+bacterial+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li>
<li>Davidson, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+biolistic+transformation+in+serotype+D+strains+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%3A+FG+%26+B%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans.</a> Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).</li>
<li>Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+in+Cryptococcusneoformans+by+use+of+biolistic+delivery+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA.</a> J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).</li>
<li>Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+URA5+gene+from+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+and+its+use+as+a+selective+marker+for+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation.</a> Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).</li>
<li>Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+a+capsule-deficient+mutation+of+Cryptococcus+neoformans+restores+its+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence.</a> Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).</li>
<li>Del Poeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+is+essential+in+Cryptococcusneoformans%3A+role+In+pathobiology+and+as+an+antifungal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target.</a> Genetics. 152, 167-178 (1999).</li>
<li>McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+transformation+of+Cryptococcusneoformans+and+Cryptococcusgattii+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%3AFG+%26+B%22%5BJournal%5D)">High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%27DiOlistic%27+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+dye+staining+of+Cryptococcusneoformans+extracellular+vesicles+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule.</a> Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).</li>
</ol>

我们无可披露事项。

利用本方案，可通过基因枪转化技术实现线性DNA通过同源重组整合到Cryptococcus neoformans基因组的特定靶位点。方案中的某些步骤会对转化的效果或效率产生显著影响。为确保转化成功，用于轰击的DNA浓度必须至少达到1 µg。然而，若DNA得率低于1 µg，可增加加入金颗粒的DNA体积（步骤3.4）。
另一个重要步骤是金微粒的DNA包被。由于操作失误导致DNA制备样品中金微粒数量不足，会减少轰击到培养板上的DNA量。将DNA加载到金微粒上后，需用移液器将其转移至基因枪的载弹盘上，并使其自然干燥。干燥后，载弹盘上应出现一个直径约1 cm的可见金色圆环。若未观察到该圆环，提示金微粒的浓度过低。另一个提示金微粒浓度过低的迹象是在轰击后观察培养板：应能看到一个可见的金色环状痕迹（图2A）；如果未见金色环状痕迹且破裂盘已爆裂，则可能表明制备过程中所用金微粒的浓度过低。
使用基因枪转化法的典型产量为20-30个菌落。菌落数量较少可能表明该技术或基因枪装置的效率未达到100%。...

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种侵袭性的中枢神经系统机会性病原体，是导致真菌性脑膜炎的最常见原因，每年在全球造成超过62.5万人死亡1。已有研究表明，在隐球菌感染期间，乙酸是主要的发酵产物之一2,3,4，并且编码三条潜在乙酸生成途径中酶的基因在感染过程中被上调5。这提示乙酸的生成与转运可能是致病过程中的必要环节；然而，其具体意义尚不明确。其中一条可能的乙酸生成途径是木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶（Xfp）—乙酸激酶（Ack）途径，该途径此前被认为仅存在于细菌中，但最近已在包括&#160;C. neoformans&#160;在内的子囊菌和担子菌真菌中被发现6。
为了确定该通路中这些酶在细胞内的定位，构建了一个在新霉素抗性基因下游携带 ACK 将基因融合至荧光标签 mCherry（ACK:mCherry:Neo）并引入 C. neoformans 使用成熟的基因枪转化方法 7,8. 尽管电穿孔是一种将作为附加体维持的质粒高效转化的方法 隐球菌 9，它在创建稳定的同源转化子方面并无用处 8仅&#160;基因枪法&#160;基因枪递送&#160;提供&#160;一种有效的转化方法&#160;线性的&#160;DNA&#160;将通过同源重组整合到基因组中。例如，Edman 等 表明，通过电穿孔转化质粒后获得的转化子中 URA5 可筛选标记基因进入 C. neoformansura5 突变体中，仅有0.001%至0.1%的转化子是稳定的 9. Chang 等 使用电穿孔法在无荚膜突变株中重建荚膜产生能力时，仅获得了0.25%的稳定转化效率 10与电穿孔不同，基因枪转化已被证明可实现2-50%的稳定转化效率，具体效率取决于所修饰的基因 7,8,11. 
本可视化实验将逐步演示将线性 ACK:mCherry:Neo DNA 构建体通过基因枪法转化至C. neoformans的过程，并介绍如何通过同源重组将其正确整合到&#160;ack&#160;位点进行验证。本实验所展示的方案是对Perfect实验室开发的方法8的改进。

<table><tbody><tr><td>0.6 &amp;mu;m 金珠</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>精胺游离碱</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S0266</td><td>https://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>G418-硫酸盐（新霉素）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-418-10</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-270-1</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>1350 psi 破裂盘</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>阻挡筛网</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>宏载体圆片</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>YPD 肉汤</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co.</td><td>242820</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co.</td><td>214530</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td>http://www.fishersci.com</td></tr><tr><td>PDS-1000/He 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio</td><td>http://www.zeiss.com/microscopy</td></tr><tr><td>KOD 一步 PCR 试剂盒</td><td>EMD Millipore</td><td>71086-4</td><td>http://www.emdmillipore.com</td></tr><tr><td>一步 RT-PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>www.promega.com</td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Mini Beadbeater - 1</td><td>BioSpecs</td><td>3110BX</td><td>http://www.biospec.com</td></tr><tr><td>Microfuge 18 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>F241.5P</td><td>www.beckmancoulter.com</td></tr><tr><td>微孔板分光光度计</td><td>BioTek</td><td>EPOCH</td><td>www.biotek.com</td></tr></tbody></table>

将荧光标记基因通过基因枪法转化至机会性真菌病原体 cryptoc游戏副本occus neoformans

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

担子菌门真菌 新型隐球菌，一种中枢神经系统的侵袭性机会性病原体，是全球真菌性脑膜炎最常见的致病原因，每年导致全球超过62.5万人死亡。&#160;尽管电穿孔技术已用于质粒转化 隐球菌，仅&#160;基因枪法&#160;递送提供&#160;一种有效的转化方法&#160;线性的&#160;DNA&#160;可通过同源重组整合到基因组中。&#160;
乙酸已被证明是隐球菌感染期间的主要发酵产物，但其意义尚不清楚。&#160;在新生隐球菌（C. neoformans）中，存在三条可能的乙酸生成途径，其中之一是由木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶（Xfp）和乙酸激酶（Ack）组成的细菌型代谢途径。本文中，我们展示了通过基因枪法将一个携带编码Ack与荧光标签mCherry融合基因的构建体转化至&#160;C. neoformans中的实验过程。随后，我们确认了ACK-mCherry融合基因已成功整合至&#160;ACK&#160;基因位点。

按照本方案流程（图1），可成功实现对C. neoformans的基因枪转化。在基因枪转化过程中，若包被金微粒成功击发，可在DNA轰击后的培养板上观察到可见的金环，表明轰击成功（图2A）。将从YPD + 1M山梨醇平板中回收的细胞接种至选择性培养基后，在室温下培养4至5天内应出现菌落。使用2 µg DNA进行转化，通常可获得20至30个菌落（图2B）。当菌落出现后，应将其在选择性培养基上重新划线以分离单菌落。
单个菌落可在YPD培养基中培养，并可从这些细胞中分离DNA和RNA，通过PCR和RT-PCR分析以确认正确的整合与表达。若本实验方案用于标签基因融合（如此例所示），引物需分别结合于目的基因的编码区（引物2）和目的基因的3’非编码区（引物4）（图3A）。利用该构建体，PCR反应扩增出的DNA需进行测序，以进一步确认mCherry标签已与ACK基因正确地按读码框融合。阳性PCR结果表现为：从转化细胞中提取的DNA...

基因枪转化是一种通过同源重组将DNA稳定整合到机会性病原体Cryptococcus neoformans基因组中的方法。我们将演示将一个编码乙酸激酶与荧光标签mCherry融合的基因构建体通过基因枪转化导入&#160;C. neoformans的过程。

将荧光标记基因通过基因枪法转化至机会性真菌病原体 Cryptoc游戏副本occus neoformans

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans），一种侵袭性机会性病原真菌，属于担子菌门，是中枢神经系统真菌感染的最常见病因……

本实验的总体目标是逐步演示包含荧光标记的线性结构的生物转化过程。该过程首先用目的DNA包被金微载体颗粒，然后通过基因枪将DNA转移至C neo forin细胞中。随后将转化后的细胞进行涂布培养，并通过PCR和实时荧光定量PCR检测DNA构建物的整合情况。最终，利用荧光显微镜通过同源重组确认DNA产物的正确整合。该技术相较于现有方法（如电穿孔法）的主要优势在于，BIC转化可实现将外源DNA稳定整合到隐球菌（crypto office）的基因组中。接近性能。演示该技术的是我实验室的博士生 Tanya Taylor，她已熟练掌握此项技术。首先使用镊子将橙色大载片 BIC 圆片浸入 100% 乙醇中，随后将圆片转移至含有干燥剂的大培养皿中，注意确保圆片不与干燥剂接触。干燥后，将菌饼压入经乙醇擦拭过的银质菌饼托中，然后涡旋震荡一管金珠，并将12微升珠液分装至每根用于转化的1.5毫升微量离心管中。随后依次向每管珠液中加入2微克DNA、10微升氯化钙和2微升无游离碱基的亚精胺。涡旋震荡每个样品。然后将离心管在室温下孵育5分钟，期间偶尔轻轻弹动以重新悬浮。孵育结束后，使沉淀的磁珠重新悬浮，收集吸附有DNA的金珠，并小心吸除上清液。将磁珠缓慢地完全重悬于600微升100%乙醇中，再次离心收集磁珠。此时，将珠子重悬于八微升乙醇中。随后，将每管珠子分别均匀滴加到一个BIC圆片的中心，形成直径一厘米的圆形。若珠子浓度足够，则每个圆片中心将可见一个金色圆圈。 beads 干燥后，操作基因枪时，首先打开真空泵，然后逆时针旋转氦气罐阀门，直至压力表显示压力达到约 2200 PSI。接着，拨动左侧红色开关以开启基因枪，并调节真空和排气的流量，使真空压力在 15 秒内达到 28 英寸汞柱。此时还需确认破裂盘与宏载体之间的距离约为八分之三英寸。当所有部件就位后，用70%乙醇擦拭整个腔室，并将破裂盘浸入100%乙醇中。在无菌表面干燥破裂盘后，使用扭矩扳手松开破裂盘固定座，并插入一片洁净的破裂盘。将破裂盘固定座重新拧回原位，并用扭矩扳手向右旋转一次以拧紧。接下来将网筛浸入100%乙醇中。待其干燥后，将网筛放置在白色塑料载片板上，并将基因枪宏载体圆盘架（DNA面朝下）放入圆盘室中，拧紧银色盖子，然后将载片板放入最高层的槽位。随后，将含有1摩尔山梨醇的YPD琼脂平板放置在底层板上。现在关闭腔室门并将其锁紧。然后将中间的红色开关向上推并保持在该位置，以启动真空泵，使真空度达到28英寸汞柱。当达到适当的真空水平后，将中间开关移至向下位置，然后按住右侧红色开关进行点火。当爆破片破裂时，立即松开点火按钮，并将中间的红色开关推至中间位置。若射击成功，为将腔室压力释放至零 psi，观察到平板上出现金色环状痕迹。清理爆破片和宏载体盘的残留物，关闭基因枪。然后顺时针旋转氦气罐旋钮以关闭气体，并关闭真空泵。经过四小时的

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免疫学与感染

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学习基因枪转化技术，将荧光标记DNA稳定整合到机会性病原真菌Cryptococcus neoformans基因组中。该方法通过PCR和荧光显微镜验证整合效果，为真菌遗传学研究提供可靠工具。

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