Name: Biolistischen Transformation einer Leuchtstoff Tagged-Gens in den Opportunistic Pilzpathogenentwicklung Cryptococcus neoformans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Lernen Sie die biolistische Transformation zur DNA-Integration in Cryptococcus neoformans mit fluoreszierenden Tags. Diese Methode ermöglicht stabile Genomintegration und vereinfacht die genetische Manipulation von Pathogenen.

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Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von der National Science Foundation (Preis # 0.920.274) und dem South Carolina Experiment Station Projekt SC-1.700.340 unterstützt. Dieses Papier isTechnical Beitrag Nr 6283 der Clemson University Experiment Station. Die Autoren danken Dr. Lukasz Kozubowski für seine hilfreiche Ratschläge bei der Entwicklung dieser letzten Protokoll und Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, und Grace Kisirkoi für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

HINWEIS: Das Gesamtkonzept dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. C. neoformans Vorbereitung <ol><li> Für jedes Transformationsreaktion, wachsen einem 2-3 ml O / N-Kultur von C. neoformans in YPD-Medium bei 30 ° C unter Schütteln bei 250 rpm. </li><li> Zentrifugieren Sie die O / N-Kultur für 5 Minuten bei 900 · g bei 10 ° C und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Zellpellets in 300 &amp; mgr; l Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) Medium. </li><li> Mit Glasperlen, sanft verteilen 300 ul der gewaschenen Zellsuspension auf YPD-Agar, 1 M Sorbitol. </li><li> Zulassen Platten bei Raumtemperatur für 3-4 Stunden trocknen. </li></ol> 2. Gold Mikro Vorbereitung <ol><li> Resuspendieren 0,25 g von 0,6 um Gold Perlen in 1 ml ddH 2 O, Zentrifuge für 1 min bei 900 xg pelletiert die Perlen, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren der Gold Perlen in 1 ml 100% Ethanol. &lt;/ Li&gt; <li> Verteilen Sie die Perlen in 4 Röhrchen wurden 250 ul jeder, und fügen Sie 750 ul 100% Ethanol. </li><li> Shop Goldperle Aliquots bei 4 ° C. </li></ol> 3. DNA-Präparation <ol><li> Bereiten Orange Makroträger biolistischen Scheiben durch Eintauchen sie in 100% Ethanol mit einer Pinzette. Platz Scheiben in eine große Petrischale Drierite zu trocknen, die (sicherstellen, dass der Drierite nicht die Scheiben berühren). </li><li> Nach dem Trocknen, drücken Sie die Makroträger Scheiben in die Silberplattenhalter (bisher mit 100% Ethanol abgewischt). </li><li> Vortex Gold Perlen (wie in Schritt 2 hergestellt) und aliquote 12 ul in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, eine Röhre pro Transformation. </li><li> Hinzufügen zu jedem Röhrchen, um: 2 ug DNA (vorzugsweise 2 &amp; mgr; l von 1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l DNA), 10 ul 2,5 M CaCl 2 und 2 ul 1 M Spermidin freie Base. </li><li> Eine negative Kontrolle, wie in Schritt 3.4, aber ohne DNA festgelegt. </li><li> Vortex jedes Röhrchen und Inkubation bei Raumtemperatur5 min. Flick vorsichtig jedes Röhrchen gelegentlich die siedelt Perlen Während dieser Inkubation resuspendieren. </li><li> Spin-Röhrchen bei 225 g für 30 Sekunden bis zu pelletieren Sie die DNA-beschichteten Goldperlen. Den Überstand (durch Pipettieren oder Aspiration) Entfernen und entsorgen. </li><li> Resuspendieren Perlen vollständig in 600 ul 100% Ethanol durch langsames Auf- und Abpipettieren. </li><li> Spin-Röhrchen bei 225 xg für 30 Sekunden, um die Kügelchen zu pelletieren ohne Verpackung. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren der DNA-beschichteten Goldperlen in 8 ul 100% Ethanol durch langsames Auf- und Abpipettieren. </li><li> Pipettieren Sie die DNA-beschichteten Goldperlen auf die Mitte des biolistischen Scheibe in einer 1 cm Durchmesser und trocknen lassen. HINWEIS: Eine getrocknete gold Kreis in der Mitte des biolistischen Scheibe sichtbar zeigt an, dass eine ausreichende Konzentration von Gold Perlen vorliegt. HINWEIS: Die Makroträger Scheiben mit DNA-beschichteten Goldkügelchen beladen sind jetzt bereit für den Einsatz mit der Genkanone. </li></ol> 4. O-perating die Gene Gun <ol><li> Einschalten der Vakuumpumpe. </li><li> Schalten Sie das Heliumgas durch Drehen des Knopfes gegen den Uhrzeigersinn, bis ein Druck von etwa 2200 psi wird am Manometer erreicht. </li><li> Schalten Sie den Gen-Kanone, indem Sie den roten Schalter auf der linken Seite. </li><li> Achten Sie darauf, dass die Durchflussraten für das Vakuum und die Entlüftung werden so eingestellt, das Vakuum 28 Zoll Hg innerhalb von 15 Sekunden zu erreichen. </li><li> Seien Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Berstscheibe und Makroträger ist ungefähr 3/8 Zoll. </li><li> Die gesamte Kammer Reinigen durch Abwischen mit Ethanol. </li><li> Tauchen Sie die Berstscheiben in 100% Ethanol. Zulassen, um eine sterile Oberfläche trocknen auf (zB Petrischale). </li><li> Verwenden Sie einen Drehmomentschlüssel, um die Berstscheibe Halter lockern. Legen Sie eine saubere Berstscheibe in die Halterung. Schrauben Sie die Berstscheibe Halter zurück an ihren Platz und ziehen Sie mit einem Drehmomentschlüssel durch einmaliges Drehen Sie ihn nach rechts. HINWEIS: Berstscheiben wird nach jedem Shooting ersetzt werden. </li><li> Tauchen Sie the Maschensieben in 100% Ethanol. Zulassen, um eine sterile Oberfläche trocknen auf (zB Petrischale). </li><li> Einmal trocken, legen Sie ein gewaschen Sieb auf dem weißen Kunststoff-Montageplatte. Setzen Sie den Macrocarrier Scheibenhalter DNA Seite nach unten in das Disc-Kammer. Schrauben Sie die silberne Kappe und legen Sie die Montageplatte in der höchsten Steckplatz. HINWEIS: Das Sieb wird nach jedem Shooting ersetzt werden. </li><li> Legen Sie eine YPD-Agar-Platte mit 1 M Sorbit auf der Bodenplatte. </li><li> Halt die Kammertür und einrasten. </li><li> Drücken und halten Sie den mittleren roten Schalter bis zu Vakuum engagieren und das Vakuum bis 28 Zoll Hg erreichen. Sobald geeignete Vakuumniveau erreicht ist, bewegen Sie den Schalter in die untere Position. Wenn Sie bereit sind, halten Sie den roten Schalter auf der rechten Seite, um Feuer. Wenn die Berstscheibe öffnet, lassen Sie sofort den Feuerknopf und drücken Sie den mittleren roten Schalter in die mittlere Position, um die Kammer auf 0 psi entlüften. </li><li> Reinigen Sie Berstscheibe Schutt und schalten Sie den Gen-Kanone. Schalten Sie dann den helium Gas durch Drehen des Knopfes im Uhrzeigersinn, und schließlich, schalten Sie die Vakuumpumpe. </li></ol> 5. Überzug transformierten Zellen <ol><li> Lassen Sie die Transformationsplatten bei RT 4 Stunden ruhen lassen, damit die Zellen sich zu erholen. </li><li> Pipette 700 ul YPD auf die Platte. Verwenden Sie einen Zellschaber, um sanft kratzen die Zellen aus der Agar und Pipette Flüssigkeit in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt, um sicherzustellen, dass alle Zellen von der Platte wiederhergestellt. </li><li> Pelle Zellen bei 225 · g für 30 sec. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Das Pellet in 500 ul YPD. </li><li> Je 100 ul der Zellsuspension in die Mitte der YPD + Antibiotikum Platten und verbreiten mit Glasperlen. </li><li> Lassen umgekehrten Platten bei Raumtemperatur für 3-4 Tage. Wie Kolonien erscheinen, Patch auf neue YPD + Antibiotikum Platten. </li></ol> 6. Die genomische DNA Isolierung für die PCR Hinweis: Dies ist eine modifizierte Version mit Reagenzs aus einem DNA-Reinigungskits (Siehe Tabelle der Materialien). <ol><li> Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von jedem der C neoformans -Transformanten in YPD Flüssigkeit bei 30 ° C unter Schütteln bei 250 rpm O / N. </li><li> Pelle 3 ml Zellen bei 900 · g und Resuspension in 600 &amp; mgr; l der Zellkerne Lyselösung. </li><li> Fügen Sie die Suspension in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 ul 0,5 mm säuregewaschene Glasperlen. </li><li> Homogenisierung für 45 Sekunden in einem Mini BeadBeater bei Umgebungstemperatur, kühle Röhrchen auf Eis, und wiederholen. </li><li> Lassen Sie Probe auf Eis für 2 min absetzen und übertragen Stand in ein neues 1,5-ml-Tube. Gib 200 ul Proteinfällungslösung zu jedem Röhrchen (100 &amp; mgr; l pro 600 &amp; mgr; l Überstand gewonnen) und Vortex kräftig 20 sec. </li><li> Werden die Proben auf Eis für 5 min absitzen und Zentrifugieren bei 11.000 g für 3 min. </li><li> Den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Röhrchen mit 300 ul RT Isopropanol. Vorsichtig mischen durch Umdrehen. </li><li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 11.000 g für 2 min, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, und entleeren Sie die Rohre auf Papiertücher. </li><li> Hinzufügen von 300 &amp; mgr; l RT 70% Ethanol zu jedem Röhrchen und vorsichtig umgedreht, um das Pellet zu waschen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 11.000 g für 2 min, und entfernen Sie vorsichtig die gesamte Ethanol. </li><li> Lassen Sie das Rohr auf die saubere Papierhandtücher, und lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen für 10-15 min. </li><li> In 50 ul DNA Rehydrationslösung und 1,5 ul RNase-Lösung zu jedem Pellet und Wirbel. </li><li> Zentrifuge Proben für 5 sec bis die gesamte Flüssigkeit aus der Kappe zu entfernen. </li><li> Proben bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Rehydrieren die DNA durch Inkubation der Proben bei 65 ° C für 1 Stunde. </li><li> Quantifizierung DNA spektrophotometrisch durch Messung der Absorption bei 260 nm (A 260 ein Lesen von 1,0 ist äquivalent zu ~ 50 &amp; mgr; g / ml doppelsträngige DNA), und Verwendung von bis zu 200 ng in jeder PCR-Reaktion. </li></ol> 7. RNA-Isolierung fürReverse Transkriptase-PCR. <ol><li> Mit Hilfe eines RNA-Reinigungskits (Siehe Tabelle der Materialien), folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um RNA aus Hefezellen mit einem minibeadbeater isolieren. </li><li> Quantifizierung der Konzentration der RNA durch Messung der Absorption bei 260 nm (A 260 ein Lesen von 1,0 ist äquivalent zu ~ 40 &amp; mgr; g / ml Einzelstrang-RNA). </li><li> Die Verwendung eines RT-PCR-Kit (siehe Tabelle der Materialien), folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um die RT-PCR-Reaktionen mit ungefähr 1 ug RNA einzurichten. Für die in dieser Studie erhaltenen Ergebnisse, die in Tabelle 1 aufgelisteten Primer. </li></ol>

<ol><li>Price, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcusneoformans+requires+a+functional+glycolytic+pathway+for+disease+but+not+persistence+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host.</a> MBio. 2, e00103-e00111 (2011).</li>
<li>Bubb, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+NMR+studies+of+metabolites+produced+by+Cryptococcusneoformans+in+culture+media%3A+identification+of+possible+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors.</a> Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).</li>
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<li>Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+a+capsule-deficient+mutation+of+Cryptococcus+neoformans+restores+its+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence.</a> Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).</li>
<li>Del Poeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+is+essential+in+Cryptococcusneoformans%3A+role+In+pathobiology+and+as+an+antifungal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target.</a> Genetics. 152, 167-178 (1999).</li>
<li>McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+transformation+of+Cryptococcusneoformans+and+Cryptococcusgattii+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%3AFG+%26+B%22%5BJournal%5D)">High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%27DiOlistic%27+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+dye+staining+of+Cryptococcusneoformans+extracellular+vesicles+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule.</a> Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).</li>
</ol>

Wir haben nichts offenzulegen.

Unter Verwendung dieses Protokolls kann eine biolistische Transformation durchgeführt werden, bei der lineare DNA durch homologe Rekombination in einen gewünschten Locus im Genom von Cryptococcus neoformans integriert wird. Bestimmte Schritte im Protokoll können einen dramatischen Einfluss auf die Effektivität/Effizienz der Transformation haben. Für eine erfolgreiche Transformation ist es zwingend erforderlich, dass die im Spross verwendete DNA eine Konzentration von mindestens 1 μg aufweist. Das Volumen der DNA...

Cryptococcus neoformans, ein invasiver opportunistischer Erreger des Zentralnervensystems, ist die häufigste Ursache für Pilzmeningitis, die weltweit zu mehr als 625.000 Todesfällen pro Jahr führt 1. Es wurde gezeigt, dass Acetat ein wichtiges Fermentationsprodukt während einer Kryptokokkeninfektion ist 2,3,4, und es wurde gezeigt, dass Gene, die Enzyme aus drei mutmaßlichen Acetat-Produktionswegen kodieren, während der Infektion hochreguliert sind 5. Dies deutet darauf hin, dass die Produktion und der Transport von Acetat ein notwendiger und erforderlicher Teil des pathogenen Prozesses sein können; Die Bedeutung dessen ist jedoch noch nicht verstanden. Ein möglicher Weg für die Acetatproduktion ist die Xylulose-5-Phosphat/Fructose-6-phosphat-phosphoketolase (Xfp)-Acetatkinase (Ack), ein Signalweg, von dem bisher angenommen wurde, dass er nur in Bakterien vorkommt, aber kürzlich sowohl in Euascomyceten- als auch in Basidiomyceten-Pilzen, einschließlich C. neoformans 6, identifiziert wurde.
Um die Lokalisation dieser Enzyme dieses Signalwegs in der Zelle zu bestimmen, wird ein Konstrukt, das ein Neomycin-Resistenzgen stromabwärts einer ACK-Genfusion zum Fluoreszenz-Tag mCherry (ACK:mCherry:Neo) trägt, unter Verwendung der etablierten Methode der biolistischen Transformation 7,8 in C. neoformans eingeführt. Obwohl die Elektroporation eine effiziente Methode zur Umwandlung von Plasmiden, die als Episomen erhalten bleiben, in Cryptococcus 9 ist, ist sie nicht nützlich für die Erzeugung stabiler homologe Transformanten 8. Nur die biolistische Verabreichung mit einer Genkanone bietet ein wirksames Mittel zur Transformation linearer DNAs, die durch homologe Rekombination in das Genom integriert werden. Zum Beispiel zeigten Edman et al., dass von den Transformanten, die aus der Elektroporation eines plasmidgetragenen URA5-selektierbaren Markers in C. neoformansura5-Mutanten resultierten, nur 0,001 bis 0,1% der Transformanten stabil waren 9. Chang et al. erreichten mit Hilfe der Elektroporation zur Rekonstitution der Kapselproduktion in einer acapsularen Mutante nur eine stabile Transformationseffizienz von 0,25 % 10. Im Gegensatz zur Elektroporation hat sich gezeigt, dass die biolistische Transformation zu einer stabilen Transformationseffizienz von 2-50% führt, abhängig von dem Gen, das verändert wird 7,8,11. 
Dieses visuelle Experiment wird eine Schritt-für-Schritt-Demonstration der biolistischen Transformation des linearen ACK:mCherry:Neo-DNA-Konstrukts in C. neoformans bieten und beschreiben, wie seine korrekte Integration durch homologe Rekombination in den ack-Locus bestätigt werden kann. Das hier demonstrierte Protokoll ist eine Modifikation der Methode, die im Perfect-Labor entwickelt wurde 8.

<table><tbody><tr><td>0,6 μm m Goldperlen</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Spermadin-freie Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td>https://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>G418 - Sulfat (Neomycin)</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>G-418-10</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>H-270-1</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>1350 psi Berstscheiben</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Stoppsiebe</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Makroträgerscheiben</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>YPD-Bouillon</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td>242820</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td>214530</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td>http://www.fishersci.com</td></tr><tr><td>PDS-1000/He System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio</td><td>http://www.zeiss.com/microscopy</td></tr><tr><td>KOD One Step PCR Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>71086-4</td><td>http://www.emdmillipore.com</td></tr><tr><td>One Step RT-PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>www.promega.com</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Mini Beadbeater - 1</td><td>BioSpecs</td><td>3110BX</td><td>http://www.biospec.com</td></tr><tr><td>Microfuge 18 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>F241.5P</td><td>www.beckmancoulter.com</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>BioTek</td><td>EPOCH</td><td>www.biotek.com</td></tr></tbody></table>

biolistischen transformation einer leuchtstoff tagged-gens in den opportunistic pilzpathogenentwicklung<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Die Basidiomyceten Cryptococcus neoformans, eine invasive opportunistische Erreger des zentralen Nervensystems, ist die häufigste Ursache für Pilzmeningitis weltweiten was zu mehr als 625.000 Todesfälle pro Jahr weltweit. Obwohl Elektroporation zur Transformation von Plasmiden in Cryptococcus entwickelt, liefert nur biolistischen Anlieferung ein wirksames Mittel, um eine lineare DNA, die in das Genom durch homologe Rekombination integriert werden kann, zu transformieren. Acetat wurde gezeigt, ein Hauptfermentationsprodukt während cryptococcal Infektion sein, aber die Bedeutung dieser Tatsache wird noch nicht bekannt. Eine bakterielle Wegs der Enzyme Xylulose-5-Phosphat / Fructose-6-phosphat Phosphoketolase (XFP) und Acetatkinase (Ack) zusammengesetzt ist, eines von drei möglichen Pfade für Acetatproduktion in C. neoformans. Hier zeigen wir die biolistische Transformation eines Konstrukts,was hat die Ack kodierende Gen in die fluoreszierende Markierung verschmolzen mCherry, in C. neoformans. Wir bestätigen dann die Integration des ACK -mCherry Fusion in die ACK-Locus.

Eine erfolgreiche biolistische Transformation von C. neoformans kann durch Anschluss an diese Protokollschema (Abbildung 1) erreicht werden. Mit biolistische Transformation, ist ein erfolgreicher Shooting der beschichteten Goldkügelchen von einem goldenen Ring auf der Platte sichtbar angezeigt, nachdem die DNA Aufnahme (Abbildung 2A). Kolonien sollte innerhalb von 4 bis 5 Tage angezeigt werden, wenn bei Raumtemperatur nach der Plattierung der gewonnenen Zellen von den YPD + 1 M...

Biolistische Transformation ein Verfahren verwendet werden, um eine stabile Integration der DNA in das Genom der opportunistisches Pathogen Cryptococcus neoformans durch homologe Rekombination zu erzeugen. Wir biolistische Transformation eines Konstrukts, das den kodierenden Gens Acetatkinase zur Fluoreszenzmarkierung mCherry in C. neoformans fusioniert hat demonstrieren.

Biolistischen Transformation einer Leuchtstoff Tagged-Gens in den Opportunistic Pilzpathogenentwicklung<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Schritt-für-Schritt-Demonstration der biotischen Transformation eines linearen Konstrukts zu liefern, das eine Fluoreszenzmarkierung enthält. Dies wird erreicht, indem zunächst goldene Mikrocar-Perlen mit der interessierenden DNA beschichtet werden. Im zweiten Schritt wird die DNA per Genkanone auf die C-Neo-Forin-Zellen übertragen.Die transformierten Zellen werden dann plattiert und die Integration des DNA-Konstrukts wird mittels PCR und R-T-P-C-R bewertet. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die korrekte Integration des DNA-Produkts durch homologe Rekombination zu bestätigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Elektroporation, besteht darin, dass die BIC-Transformation zu einer stabilen Integration in das Genom von Crypto Office führt.Nahezu Leistung. Tanya Taylor, eine Doktorandin in meinem Labor, die diese Technik beherrscht, demonstriert diese Technik. Beginnen Sie damit, die orangefarbenen Makroträger-BIC-Scheiben mit einer Pinzette in 100%iges Ethanol zu tauchen, und geben Sie die Scheiben dann in eine große Petrischale mit Trockner, wobei Sie darauf achten

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Dieser Artikel stellt ein kleines Plasmamembranisolationsprotokoll zur Charakterisierung des Candida albicans ABC (ATP-bindende Kassette) Proteins Cdr1 vor, das in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert wird. Ein proteasespaltender C-terminaler mGFPHis-Doppel-Tag mit einem 16-Rückstands-Linker zwischen Cdr1 und dem Tag wurde entwickelt, um die Reinigung und das Reinigungsmittel-Screening von Cdr1 zu erleichtern.

Plasmamembranpräparation im kleinen Maßstab zur Analyse von Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum Screening mittelgroßer Candida albicans-Mutantenbibliotheken auf Morphogenesephänotypen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt mittels nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Dieses Protokoll verwendet einen biolumineszierenden Reporter, der Messungen der transkriptionellen Aktivität in Saccharomyces eubayanus ermöglicht, um den Übergang von Glukose zu Maltose zu überwachen, eine Echtzeitanalyse metabolischer Anpassungen zu ermöglichen und die Stammoptimierung für die industrielle Fermentation unter verschiedenen Bedingungen zu unterstützen.

Im lebenden Organismus Überwachung der transkriptionellen Aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter in Hefe

Lernen Sie die biolistische Transformation zur DNA-Integration in Cryptococcus neoformans mit fluoreszierenden Tags. Diese Methode ermöglicht stabile Genomintegration und vereinfacht die genetische Manipulation von Pathogenen.

Biolistischen Transformation einer Leuchtstoff Tagged-Gens in den Opportunistic Pilzpathogenentwicklung

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