Name: Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung In Vivo Und In-vitro- Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung thymischer Einwanderungsvorläufer in Maus-Embryonen mittels In-vivo- und In-vitro-Assays. Diese Methode ermöglicht die vollständige T-Zell-Reifung aus definierten Vorläufern.

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Unterstützt durch das Institut Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant Lymphopoese &#39;), der REVIVE Zukunftsinvestitionsprogramm und &quot;La Ligue contre le Cancer&quot;.

Ethics Hinweise: Alle Experimente wurden nach dem Pasteur-Institut Ethik-Charta, von der Französisch Landwirtschaftsministerium genehmigt durchgeführt und an die EU-Richtlinien. Ein Manipulator mit Training am Kleintier-Chirurgie, von der Französisch Ministerium für Landwirtschaft zertifiziert, führt alle chirurgischen Eingriffen. HINWEIS: Siehe Anhang in Tabelle 1, die das 5-Stufen-Plan Verfahren. 1. Auswahl der Embryonen <ol><li> Verwenden Sie 36 C57BL / 6 CD45.2 Frauen, 12 Frauen CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 Männer und 12 C57BL / 6 CD45.2 Männer. Überschreiten der Weibchen mit entweder männlich Genotyp erzeugen Embryonen CD45.1 / 2 und CD45.1 als Quelle von TSP oder CD45.2 als Quelle des Empfängers Thymus Keulen verwendet. Haus alle Männer einzeln. </li><li> Embryonen für E18 TSP Isolation zu erhalten, setzen Sie 2 Hündinnen in einem Käfig mit einem Männchen CD45.1 um 6 Uhr, 21 Tage vor dem Pfropfen Experiment. Prüfen Sie das Vorhandensein einer vaginalen Stecker am nächsten Tag, vor Mittag. Sepabewerten die eingesteckt Weibchen. </li><li> Um E14 Embryonen zu erhalten, die von TSP besiedelt werden, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern CD45.2, 17 Tage vor dem Pfropfen Experiment. </li><li> Embryonen zu E13 TSP isolieren zu erhalten, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern C57BL / 6 CD45.1, 16 Tage vor dem Pfropfen Experiment. </li></ol> 2. Dissection des Embryos unter einem Horizontal Laminar Flow Hood Anmerkung: Zwei Tage vor der Transplantation Experiments. <ol><li> Opfern, die schwangeren Frauen durch Genickbruch oder durch fortschreitende Verwaltung von CO 2 -Gas während mindestens 5 min, in einem geschlossenen Raum zu sättigen. Achten Sie darauf, den Tod durch endgültige Festnahme von Herz-Kreislauf-Atembewegungen. Befeuchten Sie den Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Längsschnitt in der Haut an der Mittellinie Bauch und öffnen Sie sie durch Ziehen der Haut auseinander. Öffnen Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und Schere, ohne den Verdauungstrakt. Ziehen Sie das gespaltene uteruns und trennen es von der Vagina mit der Schere. </li><li> Legen Sie die Gebärmutter in einem 90 x 15 mm Petrischale mit 40-50 ml DPBS und schneiden quer zwischen jedem Embryo decidua. </li><li> Mit dem Paar von feinen Spitze Schere und einer feinen Pinzette entfernen Sie die Muskelmembran der Gebärmutter, nehmen Sie die Embryonen durch Schneiden zwischen der Plazenta und der Dottersack, und entfernen Sie die amnios, die Beibehaltung ist die Embryonen. </li><li> Zeigen die Embryonen in einer Petrischale 90 x 15 mm enthält HBSS + 1% fötales Kälberserum (FCS). Für Embryonen älter als E15, entfernen Sie die Köpfe mit einer Schere vor jeder weiteren Präparation. </li></ol> 3. Isolierung des Thymus <ol><li> Unter der binokularen Vergrößerungslinse, setzen Sie den Embryo, liegend in Rückenlage (ventral), auf einem nassen Gaze Betten. </li><li> Legen Sie eine Pinzette in Längsrichtung entlang der Knorpel des Brustbeins, kneifen und öffnen Sie die Brust-Netz. Mit einer gebogenen Pinzette, ziehen Sie den Brustwand zur Seite, um die t visualisierenhymic Nocken an jeder Seite der Luftröhre. </li><li> Sorgfältig halten jeder Lappen von unterhalb Kneifen mit einer feinen Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolieren Sie die Lappen und entfernen umgebende Bindegewebe mit zwei 1 ml-Spritzen + 26 G ⅜ &quot;Nadeln, ohne Beschädigung der Kapsel. </li><li> Waschen der Lappen in 3 ml HBSS + 1% FCS, um Blutzellen zu eliminieren. Hinweis: Vor dem E15 sind Thymus Nocken an jeder Seite der Luftröhre und später Sicherung in der Mitte angeordnet, um eine bi-lobar Organ bilden. </li></ol> 4. Zellsuspensionen <ol><li> Necken neben die Lappen unter der binokularen Vergrößerungslinse, mit zwei 26 G Nadeln auf 1 ml Spritzen montiert, in HBSS + 1% FCS. Filtern der Zellsuspension durch ein Nylonnetz. </li></ol> 5. Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern und Zellsortierung HINWEIS: Alle Antikörper werden zuvor titriert, um eine optimale Definition der Bevölkerung (die titrat erhaltenIon kann mit dem Antikörper Charge variieren). <ol><li> Thymozyten (E13 oder E18) für 15-30 min Inkubation bei 4 ° C mit 100 &amp; mgr; l eines Cocktails von biotinyliertem Antikörper an Linie positive Zellen zu färben (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Abzuwaschen Überschuss an Antikörpern Spin-Down der Röhrchen mit 4 ml HBSS + 1% FCS bei 280 g für 7 min, Beseitigung des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in frischem HBSS + 1% FCS. Wiederholen Sie die Zentrifugation. </li><li> E18 Biotin-markierten Zellen mit Streptavidin-Microbeads inkubiere 15 Minuten bei 4 ° C und wäscht die Zellen zweimal in HBSS 1% FCS. Wieder die Zellen in 2 ml HBSS + 1% FCS. Esten E13 Thymozyten Linie negativ und daher nicht MACS Anreicherung vor der Zellsortierung benötigen. </li><li> Leiten die Zellen auf dem LS-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wenn alle die Zellsuspension eingegeben die Säule 2 ml HBSS + 1% FCS. Wiederherstellen der4 ml der Säule durchfließen und Zentrifuge die Zellen für 7 min bei 280 x g. </li><li> Re-suspendieren des Pellets entweder abgereichertes E18 oder E13 gesamten Thymozyten in 50 ul TSP Antikörper mix (anti-CD117 APC, Anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24-FITC, anti-CD44 APCCy7 und Streptavidin Pacific Blue ) und Inkubation für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 4 ml HBSS + 1% FCS und Wieder die Zellen in 1 ml HBSS + 1% FCS mit Propidiumiodid. </li><li> Sortieren Sie die TSPs Lin - CD44 + CD117 + CD24 + CD135 CD127 niedrigen + Zellen in einem FACS (mit 4-Laser) auf eine 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul Vollmedium + 20% FCS. Tor zunächst die Zellen entsprechend ihrer Größe und Granularität auf der FSC und SSC-Kanäle. Eliminieren abgestorbene Zellen (Färbung mit Propidiumjodid), Gate-out Dubletten und Ergebnis der Fluoreszenz in exponentiellen Skalen. Rund 100 oder 600 FDA kann von einem E13 oder E18 ein Thymus, JEWEILIGEN erhältlichEly. </li></ol> 6. Colonization von E14 Thymic Lobes mit Vorläufern: Hanging-Drop-Technik <ol><li> Bestrahlen (30 Grays = 30 Gy) E14 Thymus Lappen aus CD45.2 Embryonen, 3 Stunden, bevor Kultur. HINWEIS: E14 oder E15 Thymus Lappen wurden erfolgreich als Empfänger der T-Zell-Vorläuferzellen verwendet. Verwendung Empfänger Thymus Lappen später Schwangerschaftstagen führt zu vorzeitigem Nekrose aufgrund der größeren Größe der Orgel während Thymus-Lappen in früheren Schwangerschafts Tagen entwickeln schlecht, wahrscheinlich aufgrund der unvollständigen Entwicklung der Epithelzellen. </li><li> Zentrifuge nach FDA und wieder die Zellen in Kulturmedium (OPTI-MEM komplettes Medium mit 10% FCS, Penicillin (50 Einheiten / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und 2β-Mercaptoethanol (50 uM)), so daß 35 ul enthalten 500 TSP. </li><li> Legen Sie eine 35 ul Tropfen Zellsuspension jedes zweite Well einer 60 gut Terasaki Platte. HINWEIS: 35 ul Tropfen können fusionieren, wenn sie in zusammenhängende Vertiefungen gegeben werden. </li><li> Legen Sie einen Lappen auf der bestrahlten Oberfläche jeder Tropfen. Schließen Sie das Terasaki Platte und drehen Sie die Platte auf den Kopf die Zellen des apikalen Pol der Tropfen durch die Schwerkraft erreichen zu lassen. </li><li> Schlagen Sie vorsichtig die Oberseite der umgedrehten Platte die Lappen zu zwingen, sich an der apikalen Rand des Drop verschieben. Inkubieren des invertierten Terasaki Platte in einem befeuchteten Inkubator für 48 h bei 37 ° C + 5% CO 2. Nach der Kolonisierung entweder Kultur E14 Thymi in FTOC 7 oder Transplantat unter die Nierenkapsel eines Empfänger erwachsenen Maus 8. </li></ol> 7. Fetal Thymic Organ Culture <ol><li> Zeigen 3 ml Vollmedium auf einer 35 mm Petrischale. Ein isoporösen Membranfilter schwimmend auf dem Medium. Platzieren Sie die rekonstituierte Lappen am Rand der Membran mit einer Pinzette (nicht mehr als 8 Keulen auf einer Membran). </li><li> Legen Sie die Petrischalen mit den Thymus-Lappen in einem 90 mm-Petrischale, zusammen mit einem 35-mm-Schale, ohne Deckel, mit 2 ml water, um eine optimale Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Inkubiere 12 Tage bei 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. Grafts unter die Nierenkapsel unter sterilen Bedingungen HINWEIS: Die Nierenparenchyms durch Ausbilden einer Kapsel Bindegewebe umgeben. Der Teilkapsel Region ist besonders reich an Blut- und Lymphgefäße, wodurch ein geeignetes Umfeld für die Entwicklung von Transplantaten (zB Thymus Lappen, Langerhans-Inseln oder Neugeborenen Herzen). Transplantate werden normalerweise auf der linken Niere gemacht, weil sie leichter zugänglich als die rechte Niere ist. CD3 - / - männliche Mäuse wurden als Empfänger wodurch Transplantat-Wirt-Reaktion aufgrund Nebenhistokompatibilitätsantigene auf dem Y-Chromosom verbunden, weil die Geschlechtsbestimmung vor E15 ist nicht leicht getan verwendet. <ol><li> Sterilisieren der Instrumente und tragen sterile Handschuhe an der Operation. Betäuben der Maus durch intraperitoneale Injektion einer Lösung von Ketamin 10 mg / ml + Xylazin 1 mg /ml in PBS verdünnt (50 bis 100 &amp; mgr; l pro 10 g Körpergewicht), unter Verwendung einer 1 ml-Spritze. Stellen Sie sicher, Anästhesie, indem fehlende Inter Reflexe. Geben Sie einen Tropfen Hydro Optimune Gel auf jedes Auge bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. HINWEIS: Die Lösung sollte aus dem Stegreif vorbereitet und erwärmt bei Raumtemperatur vor der Injektion werden. Die Betäubung Dauer von mindestens 20 min. Der Grad der Anästhesie sollte entlang der Operation kontrolliert werden. Die Anästhesie kann durch intraperitoneale Injektion von halbe Dosis alle 20 Minuten verlängert werden. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite, unter einer horizontalen Lamina-Flow-Haube. Sterilisation des Operationsfeldes mit 70% Ethanol und 10% Iodid dermic Lösung. Mit einem Zangenteil die Maus Haare entlang eines 2 cm Länge direkt über dem Gelenk der Hinterhand. Rasieren Sie die OP-Bereich. </li><li> Mit einem Skalpell, einen Einschnitt 1,5 cm Länge der ersten, der Hautgewebe, dann mit einer Schere das Muskelgewebe. Anwenden eines leichten Druck auf beiden Seiten des Einschnitts, Die die Niere aus der Bauchhöhle zwingen wird. </li><li> Bewerben Kochsalzlösung mit einem Baumwollknospe, die Nieren feucht zu halten. Wenn Sie Schwierigkeiten bei der Freilegung der Orgel haben, verwenden Sie eine Flachzange, um die umliegende Gewebe Adipozyten, auf die die Niere angeschlossen ziehen. Pflegen Sie die Nieren aus dem retroperitonealen Hohlraum von einem Wattestäbchen unter der Orgel platziert. </li><li> Mit zwei feinen Pinzette, machen Sie eine 2-3 mm Loch in der Kapsel (berühren Sie nicht die Parenchym um Blutungen zu verhindern). Während des gesamten chirurgischen Eingriffs halten die freiliegenden Nierenkapsel kontinuierlich befeuchtet. </li><li> Setzen Sie sorgfältig die Lappen unter die Nierenkapsel, durch die Aufrechterhaltung der Wand der Kapsel geöffnet und schieben Sie das Transplantat unter der Kapsel zum Rand Pol. Platzieren Sie bis zu 6 Keulen pro Niere. </li><li> Ersetzen Sie die Niere in der retro-Bauchhöhle. Naht der Muskel Aponeurosen, dann die Haut mit einzelnen Chirurgen Knoten. Befeuchten Sie die Wunde mit 10% Iodid Povidonlösung. Platzieren Sie die Maus auf einer beheizten pad bei 37 ° C. </li><li> Umfrage der transplantierten Maus bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie durch Kontrolle der Herz-, Atemwegs- und Whisker-Bewegungen, Schleimhaut-Farben bis zur vollständigen Rückgewinnung von Selbst gesehen enthaltenen Bewegungen. HINWEIS: Wir empfehlen Injektion von schmerzstillende Lösung (Buprenorphin, 0,1 mg / kg) intra Muskel direkt nach der Operation und die 2 Tage nach der Operation, um postoperative Schmerzen zu verhindern. </li><li> Halten Sie das betrieben Tier isoliert, bis vollständig erholt. Untersuchen Sie jeden zweiten Tag die Stiche der Wunde zu überprüfen und zu verhindern Infektion. Nie beobachtet Wundinfektion nach diesem Verfahren. HINWEIS: wöchentliche Analyse von peripheren Blutzellen aus dem CD3 - / - Mäuse aufgepfropft uns erlauben, die Thymus-abgeleiteten Populationen entweder E13 oder E18-Vorläufern unter Verwendung der CD45 allotypische Marker und T-Zelllinie spezifische Antikörper (Abbildung 3) entstand detektieren. </li></ol> 9. Analyse des TSP Nachkommen mittels Durchflusszytometrie <ol><li&gt; Tease die FTOCs individuell auf Einzelzellsuspensionen (siehe Protokoll Abschnitt 4) zu erhalten. </li><li> Stain Zellsuspensionen aus einzelnen Lappen mit einem Antikörper Mischung, die Antikörper, die CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 und inkubieren, wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li><li> Wieder die Zellen in HBSS + 1% FCS + Propidiumiodid und in einem Strömungs analysieren Zytometer (siehe Ergebnisse in Figur 2). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Zwei Assays können verwendet werden, um T-Zell-Differenzierung ex vivo zu analysieren. Die zuletzt gemeldet ist die Co-Kultur von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit BM-Stromazellen, OP9, Expression der Liganden der Noth1, delta wie 1 oder 4 12. Das 2-D-Assay ist leicht durchzuführen, sehr leistungsfähig und empfindlich, so dass bei Analyse Einzelzellebene. Es wird jedoch weder unterstützt T-Zell-Entwicklung über die Stufe der DP noch die Erzeugung von γδ DETC 13, die beide eine direkte I...

T-Lymphozyten, wobei das αβ oder γδ T-Zell-Rezeptor (TCR), differenzieren in einem speziellen Organ, der Thymus. Die ausgereifte Thymus ist in zwei unterschiedliche Bereiche unterteilt: die Rinde, in der Thymus-Vorläuferzellen entwickeln und wo Thymozyten, die produktiv TCR β und α-Kette-Gene neu anordnen aus programmierten Tod (ein Verfahren, wie die positive Selektion bekannt) gerettet; und der Medulla, wo ausgewählt Thymozyten mit zu starke Reaktivität Selbstliganden werden gelöscht (negative Selektion) 1,2. Der Thymus stammt aus dem endodermalen Schicht der dritten Schlundtasche, die später von mesenchymalen Zellen 3 umgeben ist. Es wird von hämatopoetischen Vorläuferzellen ab Embryonaltag E12, und danach wird eine kontinuierliche Einstellung für den normalen T-Zell-Entwicklung 4 erforderliche besiedelt. Thymus Einwanderer entwickeln durch aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, von einem streng regulierten Programm, initiiert und inszeniert maidurch die Aktivierung des Notch-Signalwegs auf Thymocyten bei Wechselwirkung mit seinem Liganden, wie 4 delta ntained, ausgedrückt Thymusepithelzellen (TECs) 5. Thymozyten-Entwicklung beginnt bei der so genannten CD4 - CD8 - doppelt negativ (DN) Stufen. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) und DN4 (CD25 - CD44 -) - DN Thymozyten kann weiter gemäß der Expression von CD25 und CD44 in DN1 (CD44 + CD25) unterteilt werden. CD24 (HSA) und CD117 (c-Kit) weiter unterteilt die DN1 Fach in 5 Untergruppen, wo DN1A und b entsprechen frühen Vorläuferzellen des Thymus (ETP). Thymozyten neu anordnen TCR δ, β und α-Ketten an der DN Bühne und pre-TcR Auswahl (DN3-DN4 Stufen) zu unterziehen. Sie Transit auf die CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Fach, in dem der TCR α-Kette lagert sich vor der positiven und negativen selection. In dieser Phase am meisten Thymozyten eliminiert werden und nur ein kleiner Anteil (3-5%) zu erreichen, die den CD4 + oder CD8 + T-Zellen zu reifen Fach. Die lymphatischen Differenzierungsweg schreitet durch die Stadien der HSCs, die multipotenten Vorläuferzellen (MPP) und lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP), die die Erythrozyten und Megakaryozyten Potential 6 verloren zu generieren. LMPP phänotypisch durch das Fehlen von differenzierten Blutzellmarker definiert (Linie negativ, Lin -), die Expression von c-Kit (CD117), Sca-1 und Flt3 / Flk2 (CD135) und das Fehlen von nachweisbaren Konzentrationen an Interleukin ( IL) -7-Rezeptor-α-Kette (IL-7rα oder CD127). LMPPs weiter zu differenzieren, die in Stamm lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) 7, dass von diesem Zeitpunkt haben die Fähigkeit, myeloischen Zellen erzeugen verloren. CLP behalten Lymphozyten (B- und T-Zelle), NK-Zelle DC und angeborenen lymphoiden Zelle (ILC) Potential, und unterscheiden sich von LMPP durch die Expression von CD127 und das Fehlen von hohen Sca-1. Obwohl die Art der Thymus Beilegung Vorläuferzellen (TSP) wurde ausgiebig diskutiert 8, vor kurzem wurde klar, dass TSP Änderung Phänotyp, Differenzierungspotenzial und Funktion, während der gesamten Entwicklung 9. Wir führten in vitro und in vivo-Tests, um die TSP, durch FACS-Zellsortierung entweder von E13 (erste Welle) oder E18 (zweite Welle) isoliert kennzeichnen. Fetalen Thymus Organkulturen (FTOC) mit bestrahlten Thymus Lappen kolonisiert durch die gleiche Anzahl von E13 und E18 Vorläuferzellen, die verschiedene allotypische Marker, im Anschluss an ihre Nachkommen in einer ähnlichen Entwicklungsumgebung erlaubt und offenbarte Zelle innewohnenden Eigenschaften, unterschiedlich zwischen beiden Arten von Vorläuferzellen. Thymus Lappen entweder E13 oder E18 TSP kolonisiert erlaubt Entwicklung ohne Selektion aufgrund der Konkurrenz zwischen den beiden Vorläufern. In vivo Transplantation der kolonisierten Thymus Lappen weiter gezeigt, dass auch ter reifen Nachkommen von E13 und E18 TSP haben unterschiedliche biologische Eigenschaften in vivo. FDA von der ersten Welle schnell generieren T-Zellen, sondern führen zu geringen Anzahl von αβ und γδ T-Zellen. Unter den letzteren entdeckten wir Vγ5Vδ1 dendritischen epithelialen T-Zellen (DETC), die eine Invariante TcR, wandern in die Epidermis, wo sie eine Funktion, bei der Wundheilung ausüben und werden nur während der Embryonalentwicklung 10 hergestellt haben. Im Gegensatz dazu TSP aus der zweiten Welle zu nehmen längere Zeit, um eine hohe Zahl von TcR + T-Zellen zu erzeugen und sind unfähig, DETC generieren.

<table><tbody><tr><td>90 x 15 mm und 35 x 15 mm Petrischalen aus Kunststoffgewebe.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Probenahme</td></tr><tr><td>26 G &frac38; " 0,45 x 10 mm Spritzen mit Nadeln</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell Suspension</td></tr><tr><td>Nylon-Netzverschraubungstuch sterilisiert 50/50 mm Stücke.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtration von Zellen</td></tr><tr><td>Ethanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterilitätswirkungen</td></tr><tr><td>Iodid, Povidon 10% (Betadin)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Sterilitätswirkungen</td></tr><tr><td>Ketamin 100 mg/ml (Stammlösung)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anästhesiemittel</td></tr><tr><td>Xylazin 100 mg/ml in PBS (Stammlösung)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anästhetikum und Muskelrelaxans</td></tr><tr><td>Buprenorphin 0,3 mg/ml Stammlösung</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Morphinisches Analgetikum</td></tr><tr><td>Ophtalmisches Gel (0,2 % Cyclosporin)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Augenschutz</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>zur Isolierung von Embryonen</td></tr><tr><td>HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>zum Auswaschen des Blutes und Präparieren der Embryonen</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Medium für Kulturen</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>Zusatzstoff für Kulturen</td></tr><tr><td>Penicilin und Streptomycin</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibiotika für Kulturen</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>Zusatzstoff für Kulturen</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Dissektionsmikroskop</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Kaltlampenquelle</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Zwei Schwanenhalsfasern angepasst</td></tr><tr><td>Silikonelastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Dissektion Pad</td></tr><tr><td>Löffel, rund und perforiert</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Dissektionswerkzeuge</td></tr><tr><td>Fine Science Iris-Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Sezierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Pinzette: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr>, <tr><td>2 Paar feine gerade Uhrmacherzange Dumont #5, 11 cm feine Spitzen.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Polyamidfaden mit Nadel 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>für Nähte</td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>für Nähte</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>Zur Aufrechterhaltung der Maustemperatur während der Anästhesie</td></tr><tr><td>Membran Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>Für FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 Wells</td><td>Platten FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>Für hängende Tropfentechnik</td></tr><tr><td>Mulltupfer steril 7,5 x 7,5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>Zum Auftragen von Desinfektionslösung</td></tr><tr><td>Fluoreszenz- oder Biotin-markierte Antikörper</td><td>BD Biosciences, Biolegend oder e-Biocsiences&nbsp;</td><td>Klonnummer: siehe untenstehende Tabelle</td><td>: Färbende Zellen</td></tr><tr><td>MACS-Säulen/Streptavidin-Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Zelldepletionsmäuse</td></tr><tr><td></td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) und Janvier Labs&nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 ODER CD45.2</td><td>Quelle von Zellen und Thymuslappen</td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>CDTA Orl&eacute; ans, Frankreich</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Pfropfexperiment</td></tr></tbody></table>

charakterisierung von thymic einschwingzeit vorläufern in der mouse embryo verwendung<em&gt; in vivo</em&gt; und<em&gt; in-vitro-</em&gt; assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Charakterisieren Thymus Absetzen Vorläufern ist wichtig, die pre-Thymus Stufen T-Zell-Entwicklung zu verstehen, wesentlich, Strategien für T-Zell-Ersatz in lymphopenischen Patienten zu erstellen. Wir untersuchten Thymus Beilegung Vorläuferzellen aus murinen embryonalen Tag 13 und 18 Thymi durch zwei komplementäre in vitro und in vivo-Techniken, die beide auf der Grundlage des &quot;hängenden Tropfen&quot; Methode. Diese Methode erlaubt besiedeln bestrahlten fetalen Thymus Keulen mit E13 und / oder E18 Thymus-Vorläuferzellen durch CD45 allotypische Marker und damit im Anschluss an ihre Nachkommen aus. Colonization mit gemischter Bevölkerung ermöglicht die Analyse Zell autonomen Unterschiede in biologischen Eigenschaften der Vorläuferzellen während Besiedlung mit entweder Bevölkerung beseitigt mögliche Wettbewerbsselektionsdruck. Die Kolonisierten Thymus Lappen kann auch in immundefizienten männlichen Empfängermäuse ermöglicht die Analyse der reifen T-Zellen-Nachkommen in vivo, wie Populationsdynamik von t aufgepfropft werdener peripheren Immunsystem und Besiedlung von verschiedenen Geweben und Organen. Fötalem Thymus-Organkulturen zeigte, dass E13 Vorläufern entwickelt sich rasch in alle reifen CD3 + Zellen und führten zu der kanonischen γδ T-Zell-Untergruppe, wie dendritische epithelialen T-Zellen bekannt. Im Vergleich dazu haben E18 Vorläuferzellen eine verzögerte Differenzierung und konnten dendritische epithelialen T-Zellen zu erzeugen. Die Überwachung der peripheren Blut von Thymus-gepfropft CD3 - / - Mäuse zeigten weiter, dass E18 Thymus Beilegung Vorläuferzellen zu erzeugen, mit der Zeit, eine größere Anzahl von reifen T-Zellen als ihre Gegenstücke E13, eine Funktion, die nicht in der kurzen Frist fetalen Thymus geschätzt werden konnte Organkulturen.

Um ein Verfahren zum Thymus Keulen endogener Thymozyten ermöglicht die beste Entwicklung der Kolonisierung Vorläufern führen zu wählen, verglichen wir das Niveau von T-Zell-Rekonstitution in Thymus Keulen nach Bestrahlung kolonisiert oder eine 5-Tage-desoxy-guanosin (d-Gua) Behandlung. Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl es keinen Unterschied am Tag 9 der Kultur enthaltenen bestrahlt Lappen mehr T-Zellen als jene mit d-Gua behandelt, am Tag 12. Somit ist die Bestrahlung geeigneter als d-Gua-Behandlung an T-Zell-Entwickl...

Dieser Artikel beschreibt in vivo und in vitro Methoden zur Charakterisierung der thymusabsetzenden Vorläuferzellen durch die Analyse der Kinetik der Erzeugung, des Phänotyps und der Anzahl ihrer T-Zell-Nachkommen.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die phänotypischen Kinetiken der Erzeugung und der Anzahl von T-Zellen zu analysieren, die von E13- oder E18-Thymuskolonisierenden Vorläuferzellen hervorgebracht werden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Thymuslappen von E13-, E14- und E18-Mausembryonen isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die E14-Thymuslappen bestrahlt und anschließend 48 Stunden lang in einem hängenden Tropfen mit per Flusszytometrie sortierten E13- oder E18-Zellen besiedelt.Im letzten Schritt werden die besiedelten Lappen unter die Nierenkapsel erwachsener CD-drei-Knockout-Mäuse transplantiert. Abschließend kann mittels Durchflusszytometrie die Anwesenheit der E-13- und E-18-Thymus-seedenden Vorläufer und ihrer Nachkommen im Blut der chimären Tiere überprüft werden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie der in-vitro-T-Zell-Kultur auf Ine-So-Zellen, liegt darin, dass sie Verfahren kombiniert, die eine vollständige T-Zell-Maturierung aus definierten Vorläufern in einem dreidimensionalen Test sowie die Transplantation von Thymus-Organ-Kulturen in intakte Empfängertiere ermöglichen und somit die Beurteilung von Differenzierung und Funktion der Thymus-Scheibenvorläufer und ihrer Nachkommen erlauben.Als Forschungsingenieur mit Expertise in der Chirurgie von Nagetieren werde ich das Verfahren demonstrieren: Zwei Tage vor dem Transplantationsversuch im laminarer Luftstromwerk, desinfizieren Sie den Bauch einer trächtigen weiblichen Maus mit 70 % Ethanol und führen einen Längsschnitt in der Haut entlang der Mittellinie durch. Ziehen Sie die Haut auseinander, um den Schnitt freizulegen, und öffnen Sie anschließend mit Pinzette und Schere die Bauchhöhle, ohne den Verdauungstrakt zu berühren. Danach ziehen Sie die gespaltene Gebärmutter heraus und trennen sie mit der Schere von der Vagina ab. Anschließend legen Sie die Gebärmutter in eine 90 mal 15 Millimeter große Petrischale, die 40 bis 50 Milliliter DPBS enthält, und schneiden quer zwischen den Deciduae jedes Embryos. Verwenden Sie eine feine Schere und feine Pinzette, um die Muskelmembran des Uterus zu entfernen, indem Sie zwischen Plazenta und Dottersack schneiden, um jeden Embryo zu entnehmen. Entfernen Sie anschließend das Amnion, wobei die Embryonen erhalten bleiben, und geben Sie die Embryonen in eine neue Petrischale mit HBSS plus 1 % FCS. Um den Thymus zu isolieren, legen Sie die Embryonen einzeln in Rückenlage unter eine binokulare Vergrößerungslinse. Danach eine Pinzette längs entlang des Knorpels des Brustbeins einführen und das Thoraxgitter mit einer gebogenen Pinzette zusammendrücken und öffnen. Die Thoraxwand zur Seite ziehen, um die Thymuslappen auf jeder Seite der Luftröhre sichtbar zu machen. Anschließend mit einer feinen Pinzette unterhalb des Thymus greifen, um jeden Lappen vorsichtig zu entfernen, und sie in eine Petrischale mit einem Milliliter HBSS plus 1 % FCS legen.Als Nächstes verwenden Sie zwei feine Pinzetten, um das umgebende Bindegewebe zu entfernen, ohne die Lappen zu beschädigen. Anschließend waschen Sie die Lappen in drei Millilitern HBSS mit 1 % FCS, um die roten Blutkörperchen zu entfernen, um die fetale tymische Organkultur-Bestrahlung zu beginnen. E14-tymische Lappen, isoliert aus CD45.2-Embryonen, wie gerade gezeigt.Lassen Sie die Lappen etwa drei Stunden ruhen. Anschließend frisch sortierte E 13- oder E 18-Thymus-Siedlungsprogenitoren abzentrifugieren. Den Pellet in Kulturmedium so resuspendieren, dass eine Endkonzentration von 500 Zellen pro 35 Mikroliter Medium vorliegt.Platzieren Sie dann einen 35-Mikroliter-Tropfen der Zellsuspension in jeder zweiten Vertiefung einer 60-Vertiefungs-Terasaki-Platte und geben Sie einen bestrahlten Lappen auf die Oberfläche jedes Tropfens. Schließen Sie die Platte und drehen Sie sie um, damit die Zellen durch die Schwerkraft zum apikalen Pol des Tropfens gelangen; klopfen Sie dabei leicht auf die obere Seite der umgedrehten Platte, um die Lappen zum apikalen Rand des Tropfens zu bewegen. Anschließend inkubieren Sie die umgedrehte Platte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator.Nachdem die Thymuslappen besiedelt wurden, überprüfen Sie die Anästhesietiefe des Empfängertiers anhand des Fehlens einer Reflexantwort. Tragen Sie dann einen Tropfen Augensalbe auf jedes Auge auf und legen Sie die Maus unter einem laminaren Luftstromhauben auf die rechte Seite. Rasieren Sie anschließend den chirurgischen Bereich direkt oberhalb des Gelenks des Hinterbeins. Als Nächstes ziehen Sie ein Paar sterile Handschuhe an und desinfizieren das Operationsfeld mit 70 % Ethanol und einer 10 %igen IOD DY DER-Lösung. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 1,5 cm langen Schnitt durch das kutane Gewebe und anschließend einen Schnitt durch das Muskelgewebe durchzuführen. Üben Sie nun leichtem Druck auf beide Seiten des Schnittes aus, um die Niere aus der Bauchhöhle herauszudrücken, und halten Sie die Niere mit Kochsalzlösung feucht.Halten Sie die Niere mit einem Wattestäbchen außerhalb der retroperitonealen Kavität und verwenden Sie zwei feine Pinzetten, um ein zwei bis drei Millimeter großes Loch in die Kapsel zu machen. Halten Sie dann vorsichtig die Kapselwand geöffnet und schieben Sie bis zu sechs Thymuslappen-Transplantate unter die Kapsel bis zum Rand des Nierenpols. Legen Sie die Niere anschließend zurück in die retroperitoneale Kavität. Nähen Sie zunächst die Muskulatur mit einem Nervennahtverfahren und danach die Haut mit Einzelknoten des Chirurgen.Be feuchten Sie die Wunde mit einer 10%igen Povidon-Jod-Lösung an, und legen Sie die Maus auf eine Heizplatte mit 37 Grad Celsius. Überwachen Sie das Tier und den Operationswundbereich, bis beide vollständig regeneriert sind, um die beste Methode zur Ausschaltung endogener Thymozyten für die Entwicklung kolonisierender Vorläuferzellen zu bestimmen. In diesem Experiment wurden die T-Zell-Rekonstitution in einem kolonisierten Thymuslappen nach Bestrahlung oder einer fünftägigen Desoxyguanin-Behandlung verglichen. Obwohl am neunten Kulturtag kein Unterschied in der Anzahl kolonisierender Lymphozyten erkennbar war, enthielten die bestrahlten Lappen am zwölften Tag mehr T-Zellen als die mit Desoxyguanin behandelten, weshalb die Bestrahlung als bevorzugte Behandlung zur Förderung der T-Zell-Entwicklung nach Thymuskolonisation gewählt wurde. Um das Entwicklungspotential der E 13- und E 18-Thymus-siedelnden Vorläuferzellen zu untersuchen, wurden hier E 14-bestrahlte Thymuslappen mit gleicher Anzahl beider Vorläuferzelltypen kolonisiert. Wie beobachtet wurde, gingen aus den E 13-Thymus-siedelnden Vorläuferzellen weniger Thymozyten und doppelt positive T-Zellen hervor als aus den E 18-Thymus-siedelnden Vorläuferzellen.Die Häufigkeit reifer CD3-positiver Zellen war hingegen erhöht, und die Produktion dendritischer epidermaler T-Zellen wurde nur bei den Nachkommen der E13-Thymusbesiedelnden Vorläuferzellen nachgewiesen. Um das in-vivo-Potential der E13- und E18-Thymusbesiedelnden Vorläuferzellen zu analysieren, wurden Thymuslappen, die mit jeder Art von Vorläuferzellen besiedelt waren, unter die Nierenkapsel von CD3-Knockout-Empfängern transplantiert. Wie gerade gezeigt, war dies erwartungsgemäß der Fall. Die E13-Thymusbesiedelnden Vorläuferzellen bildeten T-Zellen schneller als die E18-Vorläuferzellen, obwohl die Anzahl zirkulierender T-Zellen bei den Tieren, die mit E13-Thymusbesiedelnden Vorläuferzellen besiedelt waren, insgesamt signifikant niedriger war. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsimmunologie den Weg, um die Eigenschaften von T-Zell-Subtypen zu untersuchen, von denen einige streng embryonalen Ursprungs sind, in einem Säugetiermodell.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die differenziellen und funktionellen Wege von Timex-siedelnden Vorläufern und ihrer Nachkommenschaft auch unter natürlichen und konkurrierenden Bedingungen verfolgen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir präsentieren Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erzeugung von Chimären Neugeborenen sowie die Präparation und Vorbereitung des Thymus für die Ex-vivo-Bildgebung durch 2-Photonen-Mikroskopie.

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Wir haben neuartige Labormethoden und Protokolle zur intravitale Bildgebung des Thymus entwickelt. Unsere Technik sollte bei der Identifizierung von „Nischen“ im Thymus helfen, in denen die Entwicklung von T-Zellen stattfindet.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Erzeugung funktioneller antigenspezifischer T-Zellen aus iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen unter Verwendung eines dreidimensionalen Thymuskultursystems. Die Co-Kultivierung der iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen mit endogenen lymphozytendepletierten Mäusen aus fetalen Thymuslappen führte zu einer erfolgreichen Reifung der T-Zellen zur Bildung von CD8αβ+ MHC-Klasse I+ iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten (iTEs).

Dreidimensionales Thymuskultursystem zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten

Embryonale Stammzellen der Maus können in vitro mit dem OP9-DL1 Co-Kultursystem zu T-Zellen differenziert werden. Der Erfolg dieses Verfahrens erfordert eine sorgfältige Beachtung der Reagenzien-/Zellpflege und der wichtigsten technikabhängigen Schritte. Hier diskutieren wir diese kritischen Parameter und stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die Einführung dieser Technologie zu fördern.

Ableitung von T-Zellen In-vitro- Aus embryonalen Stammzellen der Maus

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von T-abhängigen und T-unabhängige Immunglobulin (Ig) Isotype Antworten bei Mäusen mittels ELISA. Diese Methode verwendet, allein oder in Kombination mit Flow Cytometry wird erlauben Forschern, Unterschiede in der B-Zell-vermittelten Ig Isotype Antworten bei Mäusen nach T-abhängigen und T-unabhängige Antigen-Immunisierung zu identifizieren.

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Dieser Artikel enthält eine Methode, um reine embryonalen Gewebe von Wachteln und Hühner-Embryonen zu isolieren, die kombiniert werden können, um ex Vivo Chimären Organe.

Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel

Lernen Sie die Charakterisierung thymischer Einwanderungsvorläufer in Maus-Embryonen mittels In-vivo- und In-vitro-Assays. Diese Methode ermöglicht die vollständige T-Zell-Reifung aus definierten Vorläufern.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung

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